第4章 蛋白质的分子量研究法
测定蛋白质相对分子量的方法
测定蛋白质相对分子量的方法
《测定蛋白质相对分子量的方法》
测定蛋白质相对分子量是生物学研究中常用的技术之一，它可以帮助研究者了解蛋白质的结构、功能和互作关系。
测定蛋白质相对分子量的方法主要有电泳、沉淀和放射免疫测定等。
电泳是最常用的测定蛋白质相对分子量的方法，它通过将蛋白质电泳到电泳凝胶板上，然后将凝胶板置于电压场中，使蛋白质在凝胶中移动，根据蛋白质在凝胶中的移动距离来测定其相对分子量。
沉淀法是另一种测定蛋白质相对分子量的方法，它是通过将蛋白质溶液与沉淀剂混合，使蛋白质沉淀，然后测定沉淀物的质量来计算蛋白质的相对分子量。
放射免疫测定是一种特殊的测定蛋白质相对分子量的方法，它是通过将蛋白质混合物接种到动物体内，使其产生免疫反应，然后收集抗体，测定抗体的浓度来计算蛋白质的相对分子量。
以上是测定蛋白质相对分子量的几种方法，它们都能够帮助研究者更好地了解蛋白质的结构、功能和互作关系。
蛋白质相对分子量
蛋白质相对分子量蛋白质是生物体中最重要的组成部分，它是高分子最重要的组成部分之一，广泛存在于生物体中。
它是分子量较大，结构相对复杂的高分子组成体，有重要的功能作用。
蛋白质的分子量对于研究其结构和功能以及它们在生物体内的作用起着至关重要的作用。
因此，了解蛋白质的相对分子量变得尤为重要。
蛋白质的相对分子量称为“等量质量”。
它取决于蛋白质内部的元素和组成，而不受个体差异的影响。
这主要是由于蛋白质的比较均一的组成而实现的，其中大多数是氨基酸，还有一小部分是其他非氨基酸组分，例如脱氨基残基，糖类残基等。
因此，不同物质的蛋白质相对分子量可能会有所不同，但是大多数情况下它们的相对分子量都是不变的。
蛋白质相对分子量可以从其组成的氨基酸的分子量来确定。
对于氨基酸，每个氨基酸的分子量都是固定的，且随氨基酸的不同而有所不同。
例如，苯丙氨酸的分子量为117.15Da，苏氨酸的分子量为105.09Da，缬氨酸的分子量为119.12Da，丙氨酸的分子量为89.09Da，等等。
因此，通过计算蛋白质中各不同氨基酸的相对分子量，可以得到蛋白质的相对分子量，即蛋白质中所含氨基酸分子量的总和。
蛋白质相对分子量的测定方法主要有几种。
其中，最常用的是分子量分析法，也称为分子量测定法或数量分析法。
分子量分析法是根据蛋白质中各氨基酸的分子量，按照它们的比例测定蛋白质的相对分子量。
此外，还有一种叫做放大分子量法的分子量分析方法。
放大分子量法首先通过电泳技术，将蛋白质进行纯净，然后用放大器根据放大后的分子量，进行蛋白质的相对分子量的测定。
蛋白质的相对分子量的测定也可以通过电荷分布测定法。
这种方法是通过电荷分布测定仪测定电荷分布及相对分子量，并对蛋白质产生同步荷电量并对蛋白质电荷分布进行分析，从而测定蛋白质的相对分子量。
蛋白质的相对分子量是如何影响生物体的关键问题之一。
它的大小决定了蛋白质的生物学功能，这也是它在生物体中的结构与功能的关键。
许多生物学研究表明，蛋白质的分子量越大，其生物学功能也就越强。
蛋白质分子量测定方法的比较
蛋白质分子量测定方法的比较蛋白质分子量是指蛋白质分子中所包含的氨基酸数量和分子量之和。
确定蛋白质分子量对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
随着科技的发展，出现了多种蛋白质分子量测定方法。
本文将比较常用的几种方法：紫外吸收光谱法、凝胶电泳法、质谱法和核磁共振法。
1. 紫外吸收光谱法：该方法基于蛋白质中芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸）吸收紫外光的特性，通过测量蛋白质在280nm处的吸光度来估计蛋白质的分子量。
该方法简单、快速，不需要额外的标准物质，适用于大多数蛋白质的分子量估计。
然而，该方法对蛋白质中其他吸光物质的影响较大，且误差较大，无法提供高精度的分子量测定结果。
2.凝胶电泳法：凝胶电泳法是常用的分离和测定蛋白质分子量的方法，主要包括SDS-和聚丙烯酰胺凝胶电泳（）。
SDS-使用表面活性剂SDS使蛋白质在电场中具有相同的负电荷，根据蛋白质迁移速度的不同来估计其分子量。
通过聚丙烯酰胺分子筛效应，使蛋白质根据其分子量大小迁移至不同位置。
凝胶电泳法可以提供较高的分辨率和较准确的分子量测定结果，但需要标准物质来建立标准曲线。
3.质谱法：质谱法是一种通过测量样品分子在质谱仪中形成的离子质量和丰度信息来分析蛋白质分子量的方法。
常见的质谱技术包括基质辅助激光解析离子飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）和液相色谱电喷雾离子源质谱（LC-ESI-MS）。
质谱法具有极高的灵敏度、分辨率和准确性，可以同时测定多个蛋白质的分子量，并且还可以提供蛋白质的部分序列信息。
然而，质谱法设备昂贵，操作复杂，通常需要专业技术人员进行操作和数据解析。
4.核磁共振法：核磁共振法是一种通过测量样品核自旋来分析分子结构和构象的方法。
对于蛋白质分子量的测定，核磁共振法通常使用质子核磁共振（^1H-NMR）或碳核磁共振（^13C-NMR）。
这些方法可以直接测量蛋白质中的原子数量，并通过相应的核磁共振谱图来确定蛋白质的分子量。
核磁共振法具有非常高的准确性和分辨率，但对于大多数蛋白质来说，需要大量的纯化样品，并且数据分析相对复杂。
蛋白质分子量测定实验报告
蛋白质分子量测定实验报告实验报告：蛋白质分子量测定一、实验目的1.掌握蛋白质分子量测定的基本原理和方法。
2.学习使用SDS-PAGE电泳技术测定蛋白质分子量。
3.了解蛋白质的基本性质和分子结构。
二、实验原理蛋白质分子量测定是蛋白质研究中的基本操作之一。
通过测定蛋白质的分子量，可以了解蛋白质的结构、功能和分类等信息。
常用的蛋白质分子量测定方法有SDS-PAGE电泳、渗透压法、凝胶色谱法等。
本实验采用SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE电泳法是一种基于电泳分离和分子筛作用的蛋白质分离技术。
在SDS-PAGE电泳中，样品蛋白质与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，然后在电场作用下迁移。
由于SDS的分子量已知，因此根据迁移率和分子量的关系，可以通过计算得出蛋白质的分子量。
三、实验步骤1.准备试剂和仪器（1）试剂：蛋白质样品、SDS、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）、甘氨酸碱溶液、冰醋酸、超纯水。
（2）仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、摇床、离心管、移液器、计时器、分光光度计。
2.样品制备（1）将蛋白质样品用Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）稀释至一定浓度。
（2）加入等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液，搅拌均匀。
（3）煮沸5-10分钟，使蛋白质变性并充分与SDS结合。
（4）离心10分钟，取上清液备用。
3.电泳分离（1）按照电泳仪使用说明书，装配垂直板电泳槽，加入预冷的Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）。
（2）将制备好的样品加入电泳槽中，注意不要产生气泡。
（3）接通电泳电源，调节电压为100V，开始电泳分离。
（4）电泳过程中保持温度恒定，并及时补充水以保持电泳槽中的水平。
（5）当样品迁移至距底部约1cm时，停止电泳。
4.染色与脱色（1）将凝胶取出，用自来水冲洗干净。
（2）加入适量考马斯亮蓝染色液，室温下染色30分钟。
（3）加入脱色液，室温下脱色至背景清晰。
蛋白分子量的计算方法
蛋白分子量的计算方法蛋白分子量的计算方法引言：蛋白质是生物体内的重要分子，其功能多种多样。
研究蛋白质的分子量有助于我们理解其结构和功能。
蛋白分子量的计算方法是一种重要的工具，可以通过计算得出蛋白质的实际分子量。
本文将介绍几种常用的蛋白分子量计算方法。
一、氨基酸序列法氨基酸序列法是一种常用的计算蛋白分子量的方法。
每种氨基酸都有其特定的分子量，因此可以将蛋白质的氨基酸序列与各个氨基酸的分子量对应起来，然后求和即可得到蛋白分子量。
这种方法相对简单易行，但需要准确的氨基酸序列信息。
二、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种广泛应用于蛋白质研究领域的实验方法。
在凝胶电泳中，蛋白质会根据其分子量的大小在凝胶中进行迁移，从而形成一条或多条带状。
通过制定标准曲线，可以对蛋白质的迁移距离与分子量之间的关系进行定量计算，从而得到蛋白分子量。
三、质谱法质谱法是一种高精度的蛋白质分析方法，可以用于准确测定蛋白分子量。
在质谱法中，蛋白质会被分离出来，并通过质量分析仪器进行检测。
根据蛋白质的离子信号和质量-电荷比，可以计算出其分子量。
质谱法精确度高，但设备和技术要求较高。
四、生物信息学方法随着生物信息学的发展，越来越多的计算方法可以用于预测蛋白质的分子量。
这些方法基于蛋白质的氨基酸序列和结构特征，使用机器学习和统计算法进行计算。
这种方法不仅能够快速预测蛋白质分子量，还可以提供其他相关信息，如亚细胞定位和功能预测等。
总结与回顾：本文介绍了几种常用的蛋白分子量计算方法，包括氨基酸序列法、凝胶电泳法、质谱法和生物信息学方法。
氨基酸序列法是一种简单易行的方法，但需要准确的氨基酸序列信息；凝胶电泳法在实验室中广泛应用，通过迁移距离与分子量之间的关系计算蛋白质分子量；质谱法是一种精确测定蛋白分子量的方法，但需要高级设备和技术；生物信息学方法利用机器学习和统计算法预测蛋白质分子量，并提供其他相关信息。
综合考虑，不同的蛋白分子量计算方法在不同的应用场景中具有各自的优势和局限性。
蛋白质的性质分类及研究方法
(术语：推定/推测蛋白质 putative protein)
优点：快速、无需纯化蛋白质、基因易分离测序 缺点：无法确定经后加工的蛋白质的最终序列、
被修饰的氨基酸和二硫键的位置
二、直接测定法（9大步）
（一）测定蛋白质一级结构 (测序) 的策略
（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目 （2）拆分蛋白质分子的多肽链 （3）断开多肽链内的二硫键 （4）分析每一多肽链的氨基酸组成 √ （5）鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基 √ （6）裂解多肽链成较小的肽段（用2种或几种不
◆蛋白质在等电点时，易沉淀析出；同时，其粘 度、渗透压、膨胀性及导电能力均为最小。
二、蛋白质的胶体性质
◆蛋白质由于分子量很大，在水溶液中形成 1～100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征；
◆可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基 酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在 颗粒外面形成一层水化层；
串联质谱技术； • 重建多肽链一级序列的重叠肽拼凑法 • 用于二硫桥定位的对角线电泳等。
第三节、蛋白质的分离、纯化和分析
一、蛋白质纯化的准备工作
准备工作要解决三个问题：
（一）明确纯化蛋白质的目的； （二）建立目标蛋白的测活方法； （三）选择富含目标蛋白的原材料。
二、蛋白质纯化的一般注意事项
1.操作尽可能在低温条件下进行。2.待纯化的材料不要太稀.3. 合适的PH。4.使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标的降解。 5.避免样品反复冷冻盒剧烈搅动，防止蛋白质变性。6.缓冲溶 液成分尽量模拟细胞内环境。7.加入防止蛋白质氧化及对目标 蛋白破坏的DTT和EDTA。8.使用灭菌溶液防止微生物生长。
（二）沉淀 根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同，而 对他们进行选择性沉降从而达到分离目的一 种粗纯化方法。它通常用于目的蛋白从大体 积的粗抽提物中游离出来。这种方法既能除 去许多杂质，又有浓缩之效。 方法包括：改变PH或改变离子强度（盐析）
第四章 蛋白质的性质、分类及研究方法
多肽序列分析实例
蛋白质研究方法
假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X 1. 如何得到这种蛋白质?
蛋白质的分离、纯化技术 2. 这种蛋白质的大小？
（SDS-PAGE） 3.它的pI是多少？
（等电聚焦） 4. 其他细胞或其他生物体内是否存在？ （Western印迹） 5. 其一级结构如何？
`
• N末端:
• Sanger法（FDNB)
• C端：
肼解法
此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加 热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成 肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-
端氨基酸分离。
RO H2N CH C
R n-1O
Rn O
HN CH C HN CH C OH
几种蛋白酶特异性的比较
蛋白质的各种 间接测定法。
先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的 遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。(DNA测定 序列简单，无法确定最终加工后蛋白质序列、修饰后蛋白 质序列、二硫键信息）
蛋白质一级结构直接测定法的主要步骤
沉降系数S：
大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场 的速度。 或S=v/ω^2‧r。s是沉降系数，ω是离心转子 的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距 离，v是沉降速度。 沉降系数以每单位重力的沉降速度表示， （the velocity per unit force）并且生物大分 子通常为1～500×10^-13秒范围 如令1×10^-13=S 那么生物大分子沉降系数 通常为1～500S S=(p-m)V/f
第四章 蛋白质的性 质分类及研究方法
蛋白直径 分子量
蛋白直径分子量蛋白质是生物体中至关重要的分子，其结构和功能的研究对于深入了解生命现象和疾病机制具有重要意义。
在蛋白质研究中，蛋白直径和分子量是两个关键参数。
本文将介绍蛋白直径与分子量的基本概念、测量方法以及在生物科学中的应用和重要性。
一、蛋白直径与分子量的基本概念蛋白直径是指蛋白质分子在空间中的最大尺寸，通常用纳米（nm）作为单位。
分子量则是指蛋白质分子中所有原子质量的总和，单位为道尔顿（Da）。
这两个参数可以反映蛋白质的结构特征和功能性质。
二、蛋白直径与分子量的测量方法1.光散射法：通过测量蛋白质溶液中的光散射强度，结合斯托克斯-埃雷尔方程，计算出蛋白直径和分子量。
2.动态光散射法：通过测量蛋白质溶液在动态条件下的光散射强度，计算出蛋白直径和分子量。
3.电泳法：利用电场驱动蛋白质分子在凝胶中迁移，根据迁移速度和分子量的关系，计算出蛋白直径和分子量。
4.质谱法：通过对蛋白质进行断裂解离，分析断裂片段的质量，推算出蛋白质的分子量。
三、蛋白直径与分子量的应用领域1.生物化学与分子生物学研究：蛋白直径和分子量对于研究蛋白质结构与功能的关系具有重要意义。
2.药物研发：通过测量药物靶点蛋白的直径和分子量，有助于筛选潜在的药物候选分子。
3.生物传感器：利用蛋白直径和分子量的特异性，开发具有高灵敏度和特异性的生物传感器。
4.生物工程：在蛋白质工程中，精确测量蛋白直径和分子量有助于优化蛋白质设计和生产过程。
四、蛋白直径与分子量在生物科学中的重要性1.结构生物学：蛋白直径和分子量是蛋白质结构研究的基础数据，有助于揭示蛋白质的空间构象和功能域。
2.功能研究：蛋白直径和分子量与蛋白质的生物活性、相互作用、定位等生物学功能密切相关。
3.疾病诊断与治疗：蛋白质异常导致的疾病，如肿瘤、炎症等，其蛋白直径和分子量的变化可作为疾病诊断和治疗的生物标志物。
五、提高蛋白直径与分子量测量技术的展望随着生物科学技术的不断发展，蛋白直径和分子量测量技术也在不断进步。
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这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
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非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
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细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
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#
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等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
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5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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蛋白组学定量蛋白质组学.ppt
2
常用研究方法
以质谱技术为基础的化学标记定量方法 荧 光 差 示 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 （ F－2D－
质量变化依赖于氮原子数目，因此对未 知的蛋白质难以进行定量。
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（二）稳定同位素标记的必需氨基酸体 内标记(SILAC法)
高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸 (Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等，这些氨基酸细胞自身 无法合成，需要从外界摄入补充。
在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。
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MCAT策略流程：定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y 离子带Lys，因此被修饰。
在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现， 丰度比例一样，且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。
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MCAT策略流程：定量
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–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异
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羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例＝2 : 1
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缺点：
特异性不是很好，在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺
第4章高级生物化学-蛋白质性质和分离(蛋白质的理化性质)
思考题
1. 蛋白质变性后的现象
-2011四川大学生物化学
2. 什么是蛋白质变性和蛋白质复性？蛋白质变性 后哪些性质会发生改变？
2013 江南大学生物化学
核酸的变性
P508
(一)、DNA的变性(denaturation) 1 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开 成两条单链的过程。 2 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等
复性率达0.5时的Cot值(称Cot1/2),Cot1/2是与基因组的大 小成正比的
Cot1/2 表明基因组所包含不同序列的总长度
思考
试述下列因素如何影响DNA的复性过程。(1)阳离 子的存在(2)低于Tm的温度(3)高浓度的DNA链
（1）阳离子可以中和DNA中所带负电荷的磷酸基团， 减弱DNA链间的静电作用，促进两条互补的多核苷酸的 相互靠近，从而促进DNA的复性。
(2)、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释 (3)、举例：
• 有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一 定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。
牛胰核糖核酸酶变性和复性
DNA的复性
P509
1 DNA复性(renaturation)的定义
在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然 的双螺旋构象，这一现象称为复性。
5、变性蛋白质的特性
• 生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶
变性失去催化作用。
• 物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高，密度降低，
失去结晶能力，旋光值改变，光谱发生变化。(分子量不变）
生物化学第4章 蛋白质的共价结构
二、肽
（一）肽和肽键的结构
肽(peptide)是氨基酸的线性聚合物，因此也 称肽链（peptide chain)。蛋白质中氨基酸的基本 连 接方式是肽键(peptide bond)。
N端
C端
肽单位
肽键
(酰胺基、肽基)
共价主链
最简单的肽为二肽（dipeptide),含一个肽键； 一般把不多于12个残基的肽叫二肽、三肽……
的
测
定
C-
末 肼解法
端 氨 基 酸 的 测 定
羧肽酶法
C末
端
氨
基
酸
的
羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基
测
羧肽酶B：仅Arg、Lys
羧肽酶C：除羟脯氨酸外的所有的氨基酸残基
定
羧肽酶Y：所有的氨基酸残基
二硫键的断裂
氨基酸组分的分析
氨基酸的薄层层析分析
多肽链的部分裂解
酶法裂解
氨肽酶
12283 = 10305
蛋白质的主要功能： 1.催化：大多数酶是蛋白质。
2.调节：如激素和反式作用因子。 3.转运：如血红蛋白、载酯蛋白、膜转运蛋白等。 4.贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。 5.运动：如肌肉、微管蛋白等。 6.结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等。 7.支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。 8.防御和进攻：如抗体、毒蛋白等。 9.特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等
蛋白质相对分子量变化很大，一般在6000-1×106
（肌联蛋白）
(三) 蛋白质结构和功能的多样性
蛋白质序列的多样性决定了其功能的多样性。
如：20种氨基酸形成的二十肽（每种氨基酸只用 1次）可以形成的异构体为： 20！= 2 ×1018
又如：相对分子质量为34000的蛋白质含12种氨基 酸，假定在肽链的任一位置， 12种氨基酸出现的概率 相等，则34000/120 = 283
蛋白质大小计算
蛋白质大小计算蛋白质的大小是指蛋白质分子的分子量或分子大小。
蛋白质的大小对于研究蛋白质的结构、功能和相互作用非常重要。
下面我将解释如何计算蛋白质的大小，并提供相关的概念和方法。
1. 蛋白质的分子量蛋白质的分子量是指蛋白质分子中所有氨基酸残基的相对分子质量之和。
每个氨基酸残基有不同的相对分子质量，因此计算分子量需要知道蛋白质中每种氨基酸残基的数量。
计算蛋白质的分子量可以使用以下公式：分子量 = (数量1 × 相对分子质量1) + (数量2 × 相对分子质量2) + ... + (数量n × 相对分子质量n)其中，数量1是第一种氨基酸残基的数量，相对分子质量1是第一种氨基酸残基的相对分子质量；数量2是第二种氨基酸残基的数量，相对分子质量2是第二种氨基酸残基的相对分子质量；以此类推，直到第n种氨基酸残基。
2. 蛋白质的分子大小蛋白质的分子大小是指蛋白质分子的物理尺寸或体积。
蛋白质的分子大小可以通过多种实验方法来确定，其中最常用的是凝胶过滤层析、动态光散射和质谱分析。
•凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是一种基于分子大小的分离技术，可以通过选择性分子筛来分离不同大小的蛋白质。
通过比较蛋白质在凝胶柱中的迁移速率，可以估计蛋白质的分子大小。
•动态光散射：动态光散射是一种用于测量溶液中颗粒物体（如蛋白质分子）的大小和形状的技术。
通过测量散射光的强度和散射角度的变化，可以计算出蛋白质的分子大小。
•质谱分析：质谱分析是一种高灵敏度的分析技术，可以测量分子的质量和相对丰度。
通过将蛋白质样品离子化并加速到质谱仪中，可以根据离子的质量-电荷比分布来确定蛋白质的分子大小。
3. 其他影响蛋白质大小的因素除了分子量和分子大小之外，蛋白质的结构和构象也会影响其大小的估计。
蛋白质的结构包括原子间的键长、键角和二级结构等。
不同的结构和构象会导致蛋白质在空间中占据不同的体积，从而影响蛋白质的大小估计。
此外，蛋白质的溶剂条件（如pH、离子强度和温度）也可能影响蛋白质的大小。
蛋白质相对分子质量的测定方法
蛋白质相对分子质量的测定方法
1蛋白质相对分子质量的测定
蛋白质是生物体最重要的组成部分之一，因此蛋白质的相对分子质量(relative molecular weight,RMW)测定是生物学中重要的一个研究内容，也是生物分子研究工作中的重要参考依据。
蛋白质相对分子质量的测定主要有两种方法，即分析质谱法(mass spectrometry)和团聚层析分析法(gel-filtration analysis)。
分析质谱法主要是使用一种叫做质谱仪(mass spectrometer)的仪器，质谱仪能将不同质量的物质进行分离，通过测量每个部分所占比例，就可以计算出该分子的相对分子质量。
团聚层析分析法的原理是，将蛋白质经过液相色谱柱纯化后，使用分子量评估剂(molecular weight markers)约定一定的分子量范围，并且将蛋白质和分子量评估剂一起通过一定的流量放入液相色谱柱中，然后也能计算出该分子的相对分子质量。
除了以上两种方法之外，分子质量还可以用分子量测定剂(molecular weight determinants)和中和滴定(neutralization titration)来测定。
分子量测定剂是使用电泳来测定相对分子质量，它能够比较准确精确地测定蛋白质的相对分子质量；而中和滴定是利用不同离子浓度影响溶液的电位来测定蛋白质的相对分子质量。
通过以上介绍，我们就可以知道，在生物分子研究工作中，蛋白质的相对分子质量的测定有多种方法可供选择，可以根据具体需要使用不同的方法进行测定。
蛋白质分子量分布
蛋白质分子量分布
蛋白质的分子量分布是指在一定范围内，不同分子量的蛋白质在样品中的相对丰度的分布情况。
蛋白质分子量分布可以通过分子生物学方法和质谱技术进行分析。
在分子生物学方法中，通常使用凝胶电泳技术，如SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）来分析蛋白质的分子量分布。
通过将蛋白质样品在SDS-PAGE中进行电泳分离，根据蛋白质迁移速率的不同，可以得到不同分子量的蛋白质带。
质谱技术是一种高精确度和高灵敏度的分析方法，可以准确测量蛋白质的分子量。
质谱技术中常用的方法包括质谱仪，如MALDI-TOF（基质辅助激光解离/ 电离飞行时间质谱）和ESI （电喷雾离子源）质谱。
这些方法可以通过测量蛋白质的离子质量来确定其分子量。
蛋白质分子量分布的分析结果可以提供有关蛋白质组成和结构的信息。
在蛋白质组学研究中，了解蛋白质分子量分布可以帮助人们理解生物体内蛋白质的功能和相互作用关系，以及疾病发生和发展过程中蛋白质变化的规律。
蛋白大小测定实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质分子量测定方法；2. 学习使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术测定蛋白质分子量；3. 了解蛋白质分子量与生物功能的关系。
二、实验原理蛋白质分子量是衡量蛋白质大小的重要指标，对于蛋白质的结构、功能和生物学活性等研究具有重要意义。
SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分子量测定方法，其原理是将蛋白质样品在含有SDS（十二烷基硫酸钠）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，SDS能够使蛋白质变性，并使其带有负电荷，从而消除蛋白质分子间电荷差异，使蛋白质的迁移率仅与分子量有关。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：蛋白质样品、SDS-PAGE凝胶制备试剂、电泳缓冲液、染色试剂等；2. 仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、紫外检测仪、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 准备SDS-PAGE凝胶：按照说明书配制凝胶制备试剂，加入SDS、β-巯基乙醇等，混合均匀后倒入电泳槽，插入梳子，静置至凝胶凝固。
2. 准备蛋白质样品：将蛋白质样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合，加入β-巯基乙醇，沸水浴变性5分钟。
3. 加样：将变性后的蛋白质样品加到凝胶样品孔中，加入标准蛋白质分子量标记。
4. 电泳：将凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液，开启电泳仪，设置电压和电泳时间，待溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部时，关闭电泳仪。
5. 染色：将凝胶取出，加入染色试剂，染色30分钟。
6. 洗脱：将染色后的凝胶放入脱色液中，脱色30分钟。
7. 成像与分析：使用凝胶成像系统对凝胶进行拍照，分析蛋白质分子量。
五、实验结果与分析1. 实验结果：根据蛋白质样品在凝胶中的迁移距离，可以判断蛋白质分子量大小。
2. 结果分析：根据标准蛋白质分子量标记的迁移距离，绘制标准曲线，根据蛋白质样品的迁移距离，从标准曲线上查找相应的蛋白质分子量。
六、讨论与心得1. 讨论：本实验成功测定了蛋白质分子量，SDS-PAGE技术具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点，是蛋白质分子量测定的常用方法。
蛋白质工程复习提纲
蛋白质工程复习提纲第一章蛋白质工程的概念及其发展1．什么是蛋白质工程？是以对蛋白质结构和功能关系的认识为依据，借助基因工程技术和X-射线衍射分析技术，从基因入手，通过定点突变改变核苷酸顺序，以达到改造现有蛋白质分子、或创造新的蛋白质分子目的的技术学科。
2．与蛋白质工程有关的四个基础学科是什么？蛋白质化学、分子遗传学、蛋白质晶体学、蛋白质动力学。
3．为什么蛋白质化学方面的研究又出现了新高潮？今后蛋白质化学的研究将向哪三个方向发展？1）遗传工程的产品开拓依赖于新蛋白质的发现；2）遗传工程的下游技术有赖于蛋白质的新的分离、纯化技术的发展；3）医学上和商业上发现新分蛋白质推动了蛋白质化学研究技术的不断发展。
今后蛋白质化学的主要研究方向有：1）蛋白质的研究与核酸研究相结合；2）蛋白质化学与量子化学相结合；3）新功能蛋白质的寻找、原有蛋白质新功能的揭示、新的研究蛋白质技术的开拓。
4．举例说明蛋白质工程已经取得了哪些成果？（1）在基础研究方面：1) 进行酶活性中心上必需基团的研究2）展宽酶分子的底物范围研究3）提高酶分子对底物的专一性研究4）提高蛋白质分子的稳定性研究5）研究了酶分子的空间结构与催化的关系6) 研究了酶分子与底物结合成中间产物时结合能的作用。
（2）应用方面1)改进蛋白质分子的热稳定性2)提高抗氧化性能3)提高蛋白质抵抗重金属的性能4) 增强蛋白质对pH值的稳定性5) 改变酶催化的最适pH值5．当前阻碍酶的大量生产和销售的因素有哪些？酶的生产成本较高（非主要）；来自自然界的酶或其他蛋白质并不随人意，应用起来会遇到这样那样的困难（生产环境与自然环境有差距）6．蛋白质工程的近期目标是什么？增强蛋白质对热的稳定性；增强蛋白质对氧的稳定性；增强蛋白质对重金属的稳定性；增强蛋白质对pH的稳定性；改进酶的催化性质7．制约蛋白质工程发展的因素有哪些？蛋白质分子构象的研究手段的建立；基因的高效表达及其下游技术第二章蛋白质分子的立体结构原理1 什么是顺式酰胺键？各在什么时候出现？多肽链是以众多的氨基酸分别以酰胺键连接起来，当酰胺键上的N原子由Pro供给时，所形成的酰胺键是顺式排列的，称为顺式酰胺键。
蛋白质的分子量
蛋白质的分子量一、蛋白质的重要性蛋白质是生物体内最重要的宏观有机物之一，它们参与了几乎所有的生命活动。
蛋白质可以作为酶催化化学反应，参与代谢过程；可以作为结构蛋白构建细胞和组织的骨架；可以作为激素传递信号；还可以作为抗体保护机体免受病原体侵袭。
因此，研究蛋白质的结构和功能对于理解生物体的基本特征和生命活动具有重要意义。
二、蛋白质的结构和功能蛋白质的结构多样，主要由氨基酸组成。
氨基酸通过肽键连接形成多肽链，进一步折叠成特定的三维结构，从而实现特定的功能。
蛋白质的结构可以分为四个层次：一级结构是指多肽链的氨基酸序列；二级结构是指多肽链的α-螺旋和β-折叠等空间结构；三级结构是指多肽链的整体三维结构；四级结构是指由多个多肽链组装而成的蛋白质复合物。
蛋白质的结构决定其功能，不同的结构对应着不同的功能。
三、蛋白质分子量的研究进展蛋白质的分子量是衡量蛋白质大小的重要指标，它可以通过实验测定或计算得到。
实验测定通常使用质谱法，通过测量蛋白质分子在质谱仪中的离子质量来确定其分子量。
计算方法则是根据蛋白质的氨基酸序列，将每个氨基酸的分子量相加得到蛋白质的分子量。
近年来，随着计算方法的发展，越来越多的蛋白质分子量可以通过计算得到，这极大地推动了蛋白质研究的进展。
四、蛋白质分子量与功能的关系蛋白质的分子量与其功能之间存在着一定的关系。
研究发现，分子量较大的蛋白质往往具有更复杂的结构和更多的功能模块，能够同时参与多个生物过程。
例如，抗体是一类由两个较大的蛋白质链组成的复合物，它具有高度特异性的结合能力，能够识别和中和病原体。
另外，一些蛋白质的分子量在不同物种中存在差异，这可能与物种特有的生理需求和适应环境的差异有关。
五、蛋白质分子量的应用蛋白质的分子量在生物医学研究和药物开发中具有重要的应用价值。
通过测定蛋白质的分子量，可以判断蛋白质的纯度和构象状态，进而评估其质量和活性。
此外，蛋白质的分子量也可以作为药物筛选和药效评估的指标之一。
第四章 蛋白质结构解析
NMR基本原理
核 磁 共 振 ( Nuclear Magnetic Resonance)，
就是处于某个静磁场中的 自旋核系统受到相应频率 的射频磁场作用时 ,共振 吸收某一特定频率的射频 辐射的物理过程。
核磁共振波谱是测量原子核对 射频辐射(约4600MHz)的吸收， 这种吸收只有在高磁场中才能 产生。 核磁共振波谱仪
1957年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白 的0.6 nm分辨率的蛋白质晶体结构
图片出处: http://www.drg.de/data/wuerdig ungen/Nobelpreise/RoenNobel .htm
图片出处: /arc hive/gal/source/kendrew.html
衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、 键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有 序或无序的排列以及非计量的程度等。
肌红蛋白的三维结构模型
图片出处: http:// / archive/Kendrew62.html
肌红蛋白的三维结构
多维核磁共振
核磁共振本身不能展示样体的内部结构。要得到内部 的图像，就要将不同梯度的磁场加以结合，即改变穿过 样本的磁场强度。这样就有无数二维的图像，彼此重叠
后就得到样本内部空间的三维图像 可以把一维谱中的重叠峰在二维或三维方向展开，
便于NMR谱的解析。还能间接检测到在普通NMR方法中 得不到的多量子跃迁
由于测定出蛋白质的精细结构,两位英国科 学家M.F.佩鲁茨和J.C.肯德鲁获得1962年的诺 贝尔化学奖。
图片出处：/nobel/micro/46132.html
蛋白质X射线晶体结构测定程序
蛋白质晶体结构的X射线衍射分析包含五个主要步骤：
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真实分子量等于： 最低分子量×n n表示分子中该被测元素原子 数或被测基团的真实个数。
(二). 渗透压法测定蛋白质的分子量
• 将蛋白质溶液与清水用半透膜隔开. • 清水分子可自由进入膜内蛋白质溶液, 蛋白质不能出来到清水中. • 导致蛋白质溶液体积膨胀,液面上升.
• 当液柱向下造成的压力与清水进 入蛋白质的渗透压数值相等时,液 柱的压力就代表渗透压.
数均分子量的计算公式为：
2. 重均分子量 Mw
• 设W1、W2、W3……Wi为每一成 分的总重量,M1、M2、M3……为每 一成分的分子量,则样品的重均分子 量表示为:
3. Z平均分子量
4.
Z+1平均分子量
• 对于纯品来说 Mn=Mw=Mz=Mz+1 • 对于不均一的样品来说, Mn<Mw<Mz<Mz+1
若把蛋白质放在十二烷基硫酸钠 (SDS)溶液中,加少量巯基乙醇,100℃加 热. 结果,肽链解离,SDS阴离子附在肽 链上. 肽链呈棒状,直径1.8nm,带大量负 电荷. 肽链原有的电荷被覆盖.
将这样处理过的变型肽链在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳, 多肽迁移率大小与其原来的电荷无 关,而只与肽链原来的分子量有关. 用标准蛋白质进行电泳,求出各标 准蛋白质的迁移率: R= de/do
例题：牛血清清蛋白在298K，浓 度分别为18、30、50、56克／升时的 渗透压数据分别是0.0074、0.0134、 0.0253、0.0292大气压.求其分子量是多 少. 解:计算P/C分别是:4.11×10－4、4.47 ×10－4、5.06 ×10－4、5.21 ×10－4, 以P/C对C作图:
Ve与分子量(M)的关系: Ve=K1-K2lgM K1和K2对特定的层析柱来说都是常数. 这是一条直线方程,应用时测定一系列 已知分子量蛋白质的Ve,作图得一直线. 用此直线为标准曲线,求知未知蛋白的 lgM.再由lgM求出M.
25 20 lg M 15 10 5 0 0 5 10 Ve 15 20 25
设层析柱床的总体积是Vt, 其中，胶粒之间的空隙容积是Vo (也叫外水体积）， 胶粒内部小空隙之和为Vi(也叫内 水体积）， 胶粒固体占的体积为Vs 则： Vt=Vo+Vi+Vs
从加入样品时算起，到蛋白质流出 最大浓度出现时流出的体积称为洗脫 体积，用符号Ve表示。 Ve=Vo+KdVi Kd为样品组分在二相（即胶粒内部 与胶粒外部空隙）的分配系数。
S
(1 -V p )
RT S M= D (1 -V p )
(四) 沉降平衡法
此法也是使用离心的方法来测定 蛋白质分子量的. 要求离心速度不高,7000到8000转/ 分就行.
此法使用的公式是:
C2 2RTln M=
2
C1
2 2
(1-Vp)w (x2 -x1 )
X1、X2是离心管内任两点离 中轴的距离（cm), C1、C2分别是X1和X2处的蛋 白质含量。
又设M为蛋白质的分子量； V为溶质分子的微分比容（cm3/g); ρ为介质密度。 则作用于1摩尔蛋白质的总离 心力是： F1＝M（1－V ρ） ω2X
蛋白质在沉降时，也会受到 介质的阻力，其摩擦力是： F2＝f(dx/dt) f是溶质的摩尔摩擦系数， dx/dt为沉降速度。
经过很短的加速过程后，两 种力平衡。 F1＝F2 M（1－V ρ） ω2X ＝ f(dx/dt) M（1－V ρ）=f(dx/dt)/ ω2X
• 理想溶液的渗透压公式为: P=ART P:渗透压(大气压) A:溶质的体积摩尔浓度(摩尔/升). R:气体常数(0.082升.大气压/摩尔.度) T:绝对温度
• 上式的浓度A改用“克/升”表示时,用字 母C代替. A=C/M M为溶质的分子量. 则 P=ART=(C/M)RT • 所以,通过渗透压的测定可以计算理想 溶液的分子量.
15 10 5 0 0 5 10 1/Rf 15 20 25
(七) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法
在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,被分离 的蛋白质受到双重效应: 分子筛效应:大分子在凝胶中跑得 慢,小分子跑得快. 电场效应:带电荷多的分子跑得快, 带电荷少的分子跑得慢.
两种效应综合起来:分子小,带电 多的分子跑得快,分子大,带电少的分 子跑得慢.
第四章 蛋白质分子量研究法
蛋白质是分子量很大的分子, 其分子量的研究方法与研究小分子 的方法不同.用研究小分子的方法 来研究蛋白质的分子量是无能为力 的. 用化学方法测得的分子量称为 化学分子量;用物理方法测得的分 子量称为物理分子量.
• 物理分子量：根据蛋白质分子的 物理性质来测定所得到的分子 量。 • 化学分子量：根据蛋白质分子的 化学性质测定所得到的分子量。
（五） 凝胶层析法
凝胶层析法是利用凝胶把分子 大小不同的物质分离开来的一种方 法。又叫分子筛层析法、排阻层析 法。 凝胶颗粒是一种分子筛，可以把 分子按大小不同进行分离。
将一蛋白质混合物放在凝胶柱上 层析. 洗脫时，大分子不能进入凝胶颗 粒内部，沿着颗粒间的空隙最先流出 柱外。 小分子可以进入凝胶内部，流速减 慢，最后流出柱外。
P/C × 10－ 4
6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 蛋白质浓度(克/升)
图中截距等于3.7×10－4， 得RT／M＝ 3.7×10－4 M＝RT／ 3.7×10－4＝ 0.082×298／ 3.7×10－4＝66043 道尔顿
（三） 超离心沉降速度法
在高速离心沉降过程中，溶质分 子离开中轴移动。 设溶质分子离中轴的距离是X,转 子的角速度是ω， 则离心的加速度是ω2X。
• 蛋白质分子主要含有C、H、O、 N、S等元素。 • 蛋白质的分子量就是组成蛋白质分 子中各原子的原子量的总和。
一. 分子量的平均值
• 分子量的平均值有四种表示法: 数均分子量 重均分子量 Z平均分子量 Z+1平均分子量
1. 数均分子量 Mn
• 表示总质量m对总克分子数n的比值. • 设样品中有分子量为M1、M2、 M3、….. Mi的若干种分子,其 克分 子数分别是n1、n2、n3…..ni,
但是,蛋白质溶液不是理想溶 液,故上式不适合蛋白质溶液,需修 正. P=(C/M)RT + KC2 K是和溶质、溶剂有关的常 数。整理得 P／C ＝ RT／M ＋KC P／C称为比浓渗透压。
• 这是一条直线方程，测定一系列 浓度蛋白质溶液的渗透压后，由 P／C对C作图，得一直线。 • 该直线的截距是RT／M。 • 由RT／M计算分子量。
Kd有不同情况： 1. 当Kd＝0时，Ve=Vo,样品全部 被排阻，不能进入凝胶颗粒中。 2.当kd=1时，Ve=Vo+Vi,样品全部 进入凝胶颗粒内部。
3.当0<Kd<1时,Ve=Vo+kdVi, 表示内水体积只有一部分被利用. 不同样品的Kd不同,洗脫体积 就不同,就可以分离开. 4.有时Kd>1,表示凝胶对组分 有吸附作用.
此法有如下优点:
1.各组分有浓缩作用,可分次点样. 2.谱带更清晰,可鉴定纯度. 3.在同一胶片上同时测定分子量范围较 大的样品. 4.直接测定天然结构的分子量.
R= de/do de是某蛋白电泳后的斑点到原点的距离. do是前沿指示剂到原点的距离. lg M=a-bR M是分子量,R为迁移率,a,b是常数.
• 用lgM对R作图,得一直线:
(八) 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳
此法所用的聚丙烯酰胺凝胶不是 均一的凝胶,而是梯度凝胶.
电泳时,分子小的可进入较小 的网孔部位,分子大的停留在较大 网孔部位. 不同大小的样品就有不同的 迁移率R,同样有 lgM=a-bR
(六) 凝胶薄板层析法
将凝胶涂在玻璃板上,把样品点在 胶板上, 然后用推动剂推动,不同的样品即 可据分子量不同而分开.
设层析后溶剂前沿到点样线的距离 为do, 层析后某标准蛋白质位置到点样线 的距离为de. 则 Rf=de/do Rf与分子量的关系为: lgM=a-b/Rf
25 20
lg M
设S=(dx/dt)/ ω2X S称为沉降系数。 则 M（1－V ρ）＝fS M=fS/(1－V ρ）
假定上式中溶质分子沉降时，受到溶 剂的阻力与分子扩散受到的阻力相 同。 则 f =RT/D D是扩散系数， R为气体常数（8.314×107尔格／摩 尔.度) T是绝对温度.
所以
M =
ห้องสมุดไป่ตู้
R T D
二. 分子量的研究方法 • 测定蛋白质的分子量有多种, 现分述如下:
(一) 根据化学组成推测最低分子量
• 是根据蛋白质样品中含有某种微量 元素或某种特殊物质的百分含量, 並假设分子中只含一个被测元素原 子或基团,推测最低分子量.
• 肌红蛋白含铁0.335%,其最低分子量: (铁的原子量/铁的百分含量)×100＝ (55.8/0.335)×100＝16657