细菌内毒素检测应用指南

5.1.9 Guidelines for Using the Test for Bacterial Endotoxins 细菌内毒素检测指南

01/2010:50110 Page 520-523 翻译时间：2012/12

无菌检测（2.6.1）的目的，和所有药典检测项目相同，是给检验员提供确认某种物料符合欧洲药典要求的方法。既没有强制生产商执行此类检测，也没有排除修订药典方法或其它方法的可能性，前提是生产商认可对于存在争议的物料用药典方法检验应符合规定。

1.介绍

革兰氏阴性菌是药品受热源污染造成毒素反应的最常见原因。它们的热源反应要比其它大多数热源物质高。这些内毒素是脂多糖。尽管有少量的热源结构不同，结论通常是产品中没有内毒素说明不含热源物质，并且能排除不含非内毒的热源物质。

如果有干扰内毒素和鲎试剂反应的因素可能掩盖内毒素的存在。因此，检验员若想代替个论中细菌内毒素的家兔热源检测法，需要证明有对相关产品有效的方法，可能需要增加排除干扰因素的程序。

如细菌内毒素检验（2.6.14）中说明，必须提供以下两方面信息才能判断检测样品有效：

✓建立检测用物料的适用性。应确保BET水和其他试剂中不含内毒素，并检查鲎试剂的灵敏性与供应商标注是否相符；

✓由于待测产品可能影响检测，应在有产品和无产品条件下测试鲎试剂灵敏性。2项灵敏度值不得有明显差异。

2.6.14细菌内毒素检测说明了去除干扰因素的方法：如果有干扰，在执行去除干扰测试后，需执行另外一项测试检查干扰是否真正被中和或移除。

本通则解释了细菌内毒素方法中要求的原因，然后讨论了读数和结果解读的内容。

如果用鲎试剂代替药典个论规定的家兔热源检测法，则属于变更方法需要验证；11部分给

出了怎样进行验证的一些指南。

每个产品的个论中给出了细菌内毒素的参照方法，如果没有说明参照方法，则使用方法A。如果没有使用参照方法，实验员必须证明该方法适合该产品，并且检测结果应与参照方法得出的结果一致。

2.方法

向鲎试剂中加入内毒素可能引起混浊、沉淀或凝胶化（凝胶法）；只有凝胶法用于药典中细菌内毒素检验一类的评价标准。优势是简便，根据检查产品中是否出现凝胶来判断结果不合格或合格，裸眼目测即可。随后又建立了方法C、D、E和F的定量法：虽然需要更多的仪器，但对于同个产品的大量样品自动检测更简便。

内毒素可能吸附在某种塑料或玻璃试管或移液管的表面。可能是由于塑料材质释放的物质造成干扰。因此应检测所使用的材料，不同批次的试管或移液管组分可能有少许不同，因此建议检验员使用新物料批次时重新检测。

若决定使用细菌内毒素检测作为限度检测意味着首先要定义待测产品的内毒素限度，然后检测的目的是确定待测产品中内毒素浓度是高于还是低于此限度。定量方法C、D、E和F可以确定待测样品中内毒素的浓度，但为了符合药典及在日常质量控制中最终问题是测得浓度是否超过了定义限度。

设定待测产品的内毒素浓度限度时，应关注产品的剂量：限度的设定应保证只要内毒素浓度不超过限度，即使每小时按规定的给药方式给最大剂量也不会引起毒性反应。

当产品中内毒素浓度恰好为规定限度时，会形成凝胶，当浓度远超过限度时也是如此，则产品被判定不合格。因为检测方法“有或无”的性质，使得无法区分浓度等于限度和浓度超过限度的情况。只有在无凝胶生成时检验员才能判定合格，此时浓度低于限度要求。

对于固体产品，内毒素按重量或按国际单位（IU）的限度浓度应转换为每ml溶液的浓度，因为测试必须在溶液中进行。对于液体状态的产品（如输液）讨论如下：

内毒素限度：注射用药物内毒素限度，按照剂量计算，等于：

K

M

K = 每公斤体重内毒素致热的限度，

M=每公斤体重最大注射剂量。

如果产品短时间内重复给药或者输液，M是1小时内最大容许的总剂量。

内毒素限度根据产品和给药途径不同而不同，在个论中有说明。表5.1.10.-1中给出了建议K 值。

对于其它给药途径，内毒素质量标准通常根据制剂研发过程的结果制定。

表5.1.10.-1

用于检测的产品应稀释到什么浓度，能最大保证阴性结果意味着产品内毒素浓度低于限度，而阳性结果意味着产品内毒素浓度等于或大于限度？稀释取决于内毒素限度及溶解产物的灵敏度：称为最大有效稀释（MVD）其值根据以下公式计算：

内毒素限度×测试溶液浓度

λ

测试溶液浓度：

-mg/mL，如果内毒素限度以重量表示（IU/mg）,

-Units/mL, 如果内毒素限度以生物活性表示（IU/Unit）

-ml/mL, 如果内毒素限度以体积表示（IU/mL）

λ= 凝胶法标定的内毒素限度（IU/mL）或浊度法或显色法标准曲线的最低值

如果最大有效稀释值不是整数，日常检验可使用比MVD小的方便的整数值（即产品的稀释

小于MVD）。这种情况下，阴性结果表示产品内毒素浓度低于限度。不过，如果测试中产品内毒素含量比限度小，但足以和溶解产物发生反应，则可能出现假阳性结果。因此，如果使用“方便”的稀释因子时出现阳性结果，还应再次按照MVD重新稀释检测。在出现疑问或有争议的结果时都应使用MVD。

这里强调了确认溶解产物灵敏度的重要性。

举例：

测试了50mg/mL的苯妥英钠溶液（I.v.）。根据下列变量测定MVD：

M = 最大人用剂量= 每公斤体重15mg，

C = 50mg/mL，

K= 每公斤体重5IU，

λ= 每ml 0.4IU内毒素

MVD=5×50

×

1

=41.67

对此产品的日常检测，简便起见可取1ml待测溶液稀释至20ml （MVD/2，再舍尾数）。不过如果检测结果为阳性，检验员应取1ml稀释至41.67ml，然后重复测试。如果有争议也需要稀释至41.67ml重新测试。

3.对照物料

用内毒素标准BRP作为对照品制备。其已根据WHO国际内毒素标准比对，含量用每安瓿含国际单位量来表示。内毒素的国际单位（IU）定义为确定重量的国际单位的特定活性。

对于日常检验，可以使用其他经过内毒素国际单位或BRP标定的内毒素对照品，其含量用内毒素国际单位表示。

注：1内毒素国际单位（IU）等于1内毒素单位（E.U.）。