霉菌和酵母计数GB
7-2第七章食品微生物检验-霉菌和酵母计数
2.培养
倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察， 共培养观察5d。
• 待培养基凝固后，将培养皿放入恒温培养箱。
提示：培养皿放入培养箱时要倒置。 • 注意选择设置为28℃±1℃的培养箱。
3.计数
• 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀 释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形 成单位（colonyforming units，CFU）表示。
对 照
10-2
10-3 CFU
/ml(g)
霉菌 和酵 母
CFU /ml(g)
（2）液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌 蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中， 充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
（3）取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一 支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。
（4）按（3） 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀 释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。
固
体
10mL
样
品
10-
1
吹吸50次， 1mL
10-
2
吹吸5次， 1mL
10-
3
吹吸5 次，
1mL
1mL
灭 菌 蒸 馏 水
25g+225m L灭菌蒸馏水
10-1
-1
-2
-3
空白
-1
-2
-3
空白
提示：样品加入稀释液管后，要先吹吸， 后取1mL样液加入培养皿。
（5）根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适 宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在 进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL样 品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照
GB 4789.15霉菌和酵母计数
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霉菌和酵母的基本特性
相对于低等的细菌来说，霉菌 和酵母生长缓慢，竞争能力较弱， 故霉菌和酵母常在不利于细菌生长 繁殖的环境中形成优势菌群。由于 霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢 能力强，故10２～10４个酵母即可引 起一克食物的变质，而细菌则需要 100倍于此数的细胞。
6.1 计算两个 平板菌落数的 平均值，再将 平均值乘以相 应稀释倍数计 算。
6.6 报告：每克(或 毫升)食品所含霉
菌和酵母数以 cfu/g(mL)表示。
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6 结果与报告
6.1.2 若所有平板
6.6 报告：每克
6.3 取1 mL1:10稀释 液注入含有9 mL灭
菌水的试管中，另 换一支1 mL灭菌吸 管吹吸5次，此液为 1:100稀释液。
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5 操作步骤
5.1 样品的稀释
5.1.4 按5.1.3操作程 序，制备10倍系列稀 释样品匀液。每递增 稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管。
6.5 计算方法：通常选择 菌落数在10～150之间的 平皿进行计数，同稀释 度的2个平皿的菌落平均 数乘以稀释倍数，即为 每克(或毫升)检样中所含 霉菌和酵母数。稀释度 选择及菌落报告方式可 参考GB/T 4789.2。
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后开始观察，共培 养观察5 d。
霉菌和酵母菌计数
— 1—
• 样品的制备
检
1.固体和半固体样品的制备：
测
称取25 g样品,加人225 mL无菌稀释液(蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液),
方
充分振摇,或用拍击式均质器拍打1 min-2min，制成1 : 10的样品匀液。
法
— 1—
• 样品的制备
检
2.液体样品的制备：
测
以无菌吸管吸取25 mL样品至盛有225 mL无茵稀释液(蒸馏水或生理盐水
方
或磷酸盐缓冲液)的适宜容器内(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)
法
或无菌均质袋中,充分振摇或用拍击式均质器拍打1 min-2 min,制成1-
10的样品匀液。
— 1—
• 接种及培养
检
1.系列稀释：
测
取1 mL 1: 10样品匀液注人含有9mL无菌稀
25ml
1ml
方
释液的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹
告
和酵母。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌
落蔓延。
— 1—
• 结果报告
① 计算同一稀释度的两个平板菌落数的平均值,
计
再将平均值乘以相应稀释倍数。
数 报
② 若有两个稀释度平板上菌落数均在10 CFU-
告
150 CFU之间,则按照GB 4789.2的相应规定进行
计算。
③若所有平板上菌落数均大于150 CFU,则对稀释
方 法
倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1 mL样品
匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL无菌稀释
液加人2个无菌平皿作空白对照。及时将20 mL-25
mL冷却至46 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼
脂(可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注
国标食品微生物学检验 霉菌酵母菌计数
1、检验食品中的霉菌、酵母菌有何意义？试举例食品中产毒素的霉菌、酵母菌？酵母菌是人类较早应用于制作面包、酿酒等的一类微生物。
近年来的应用越来越广，酵母菌体可供食用和作饲料，并可提取核酸、辅酶A、细胞色素C、凝血质等贵重药品；利用其代谢产物，制取维生素、有机酸和酶制剂等；同时，也可用于石油发酵和石油脱蜡等；霉菌除用于传统的酿酒、制酱和做其他发酵食品外，近年来在发酵工业中广泛用来生产酒精、柠檬酸、青霉素、灰黄霉素、赤霉素、淀粉酶、发酵饲料等。
腐生型酵母能使食物、纺织品和其他原料腐败变质；少数嗜高渗压酵母菌如鲁氏酵母、蜂蜜酵母可使蜂蜜、果酱败坏；有的是发酵工业的污染菌，它们消耗酒精，降低产量或产生不良气味，影响产品质量。
面包内含有淀粉，容易滋生霉菌，霉菌会分解淀粉，产生有毒黄曲霉素，是强致癌物质。
根霉经常出现在淀粉质食品上，引起食品霉烂变质，有些曲霉菌能产生对人体有害的物质，如黄曲霉毒素。
2、如何在菌落形态上鉴定霉菌、细菌、酵母菌？细菌：小而突起，大而平坦，透明或半透明，易挑取，粘稠，有臭味，质地均匀菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致，圆形菌落，颜色有白色、黄色等。
放线菌：正面有白点而且正背面颜色不同，干燥，小而紧密，与培养基结合牢固（难以挑取），不透明，泥香味，菌落背面有同心圆形纹路。
这点可以和细菌菌落区分。
酵母菌：菌落为淡黄色，光滑，半透明，比细菌菌落大。
霉菌：有菌丝，干燥，大而疏松，有霉味而且透明，菌落大型，肉眼可见许多毛状物，如绒毛状或棉絮状，棕色、青色等，可见黑色的分生孢子群。
菌落最初往往是浅色或白色，当菌落上长出各种颜色的孢子后，由于孢子有不同形状、构造和色素，菌落表面常出现肉眼可见的不同的结构和色泽，如黄、绿、青、黑、橙等各色。
有的霉菌由于产生的色素能扩散到培养基内，使培养基正面和反面显示出不同颜色，故菌落特征也是鉴定霉菌的主要依据之一。
3、该实验只进行霉菌总数的测定而如何进行霉菌的分离与鉴定？(在土壤中，将10-2、10-3各1ml稀释液接于马丁氏培养基)一、配制培养基（根据试剂瓶上的配比）每个培养皿装15~20ml，有7个培养皿，每组近似配150ml(20*7=140ml取最大范围)；二、取两个100或150ml的三角瓶，其中一个用于装90ml的蒸馏水，使用硅胶塞（用于配样品），另一个用于装50~60ml蒸馏水（五根试管，5*9=45ml）,用报纸包扎；三、包扎枪头（10个），将培养基放置于一个铁笼子，再将枪头和两瓶水放置于另一个铁笼子，进行湿热灭菌。
霉菌和酵母菌介绍及检测方法
霉菌和酵母菌介绍及检测方法一、霉菌和酵母菌介绍：霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类,通常是单细胞，呈圆形，卵圆形、腊肠形或杆状。
霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。
长期以来,人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美;还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。
但在某些情况下,霉菌和酵母也可造成中腐败变质。
由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现,这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。
由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长;有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素.霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味.例如,酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。
因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌,并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。
目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准.我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
二、检验方法：霉菌和酵母的计数方法,与菌落总数的测定方法基本相似。
主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数.对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。
具体检测标准参见：GB4789.15—94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》三、说明：1．样品的处理。
为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。
对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料,再混合磨碎.如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。
霉菌和酵母菌计数及分离培养
品种名称：马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)
英译名称：Potato Dextrose Agar
Potato dextrose agar medium with antibiotics
培养基用途：
供霉菌和酵母菌计数及分离培养(GB4789.15-2010和ISO标准)。
马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)使用原理：
马铃薯浸出粉有助于各种霉菌的生长;葡萄糖提供能源;琼脂是培养基的凝固剂;氯霉素可抑制细菌的生长。
马铃薯葡萄糖琼脂配方(每升)：
马铃薯 300g(从中提取浸出粉)
葡萄糖 20g
琼脂15g
氯霉素0.1g
最终pH 6.0±0.2
马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)使用方法：
1、称取马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)40.1g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌20min，备用。
2、霉菌和酵母菌计数。
3、用于霉菌分离鉴定。
马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)质量控制：
本品倾注平皿，下列菌株接种后25—28℃培养72h生长情况如下表。
菌名菌号生长状况菌落特征
黑曲霉ATCC16404 良好菌丝白色孢子黑色
白色念珠菌ATCC10231 良好菌落表面呈奶油色
大肠埃希氏菌ATCC25922 被抑制——
金黄色葡萄球菌ATCC6538 被抑制——
贮存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。
贮存期三年。
规格： 250g。
霉菌及其酵母菌
1、样品的稀释培养
（1）以无菌操作将检样25mL(或25g)放于含
有225mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，振摇30min，
即为1：10稀释液。
（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，
沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌蒸馏水的试管内，
振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
（3）另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，
制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换
用1支1mL灭菌吸管。
（4）根据标准要求或对污染情况的估计，选
择3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的
同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液
于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
及时将15mL～20mL 冷却至46℃的马铃薯-葡 萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于 46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转 动平皿使其混合均匀。 待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养 5d，观察并记录。
制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊 呈烧瓶形或近球形。分生孢子在小梗上呈链状着 生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。 制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊呈 烧瓶形或近球形。分生孢子在小梗上呈链状着生 ，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。
二、黄曲霉毒素检测方法
可归纳为化学方法、生物学方法和免疫学方法 三大类。 1、生物学方法 1. 抑菌试验 通过平皿中抑菌圈大小来衡量AFT含量 2. 荧光测定法 将待检菌株接种于培养基中，28—30 ℃培养48 ～72h，产生的毒素便浸入培养基中，在紫外灯光 下照射培养基会呈现出特异的荧光。此法操作简便 对AFT最低检出量为5pg/mL(拷贝数/毫升)。 3. 动物试验 大白鼠试验法、鸡胚试验、鸭雏试验
霉菌及酵母菌计数测定方法操作规程
食品中霉菌及酵母菌计数测定方法操作规程一、范围本规程规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeasts）的计数方法。
本规程适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。
二、编写依据GB 4789. 15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母菌计数》三、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1冰箱：21〜5（。
3.2恒温培养箱：28o C±ΓCo3.3均质器。
3.4恒温振荡器。
3.5 显微镜：10×-100×o3.6电子天平：感量0. 1g。
3.7无菌锥形瓶：容量500mL. 250mLo3.8无菌广口瓶：500mLo3.9无菌吸管：1mL（具0.01 mL刻度）、10mL（具0. 1mL刻度）。
3.10无菌平皿：直径90mmo4.11 无菌试管：10mm×75mmo5.12无菌牛皮纸袋、塑料袋。
四、培养基和试剂6.1马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：同GB 4789. 15项下制法。
6.2孟加拉红培养基：同GB 4789. 15项下制法。
6.3氢氧化钠Imol/L： 8g配200ml蒸储水。
6.41ICL lmol/L：7. 3g 配200ml 蒸储水。
五、检验程序5.1样品的稀释5.1.1固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸储水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。
或放入盛有225 mL无菌蒸储水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min,制成1:10的样品匀液。
5.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品至盛有225 mL无菌蒸储水的锥形（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
7.1.3取1 mL 1:10稀释液注入含有9 mL无菌水的试管中，另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸，此液为1： 100稀释液。
5.1.4按5. 1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。
食品中霉菌和酵母计数能力验证的质量控制
食品中霉菌和酵母计数能力验证的质量控制曹克任（济南市食品药品检验检测中心，山东济南 250001）摘 要：能力验证作为对实验室质量控制的一种方式，不仅能评定实验室的检验检测能力，还能体现其综合管理水平。
作为微生物领域内的定量类能力验证，食品中霉菌和酵母计数能力验证满意率通常低于定性类微生物能力验证。
本文从能力验证样品、检验人员、仪器设备、培养基、检测方法、检测环境、结果观察、其他等8个方面就食品中霉菌和酵母计数能力验证质量控制进行探讨，为确保获得满意结果，顺利通过能力验证提供参考。
关键词：霉菌；酵母；能力验证；质量控制Quality Control for Proficiency Testing of Mold and YeastEnumeration in FoodsCAO Keren(Jinan Institute for Food and Drug Control, Jinan 250001, China)Abstract: Proficiency testing, as a way to control the quality of laboratories, not only evaluates the laboratory’s testing ability, but also reflects its comprehensive management level. As a quantitative type of proficiency testing in the field of microbiology, the satisfaction rate of proficiency testing for mold and yeast counts in food is usually lower than that of qualitative microbiological proficiency testing. This paper discusses the quality control of proficiency testing of mold and yeast counts in food from eight aspects, including proficiency testing samples, testing personnel, instrumentation, culture media, testing methods, testing environment, observation of results, and other aspects, so as to provide a reference for laboratories to improve their testing ability to ensure that they obtain satisfactory results and pass the proficiency testing successfully.Keywords: mold; yeast; proficiency testing; quality control能力验证是利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力，是评价实验室技术能力的有效手段，是实验室通过外部措施对其内部质量控制方法进行补充的一种重要手段，是确保实验室质量管理体系持续改进的有效措施之一[1]。
霉菌和酵母菌菌数检验技术
28±1℃ 5天
4.结果计数
案例---蜂蜜中霉菌数测定
菌落计数应于培养后的72 h进行第一次观察。培养过程中观察平板时，动作稍重，生长快速的 霉菌孢子就会在培养基内扩散，导致二次污染，结果异常。
一般以第五天的读数为最终计数。
案例---蜂蜜中霉菌数测定
5.结果报告 例次 1
不同稀释度的平均菌落数
GB 4789.15-2016 标准解读
5 操作步骤
5.1.3 取1 mL 1:10样品匀液注入含有9 mL 无菌稀释液的试管中, 另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸，或在 漩涡混合器上混匀，此液为1:100的样品匀液。 5.1.4 按5.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。 5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进 行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀 释液加入2个无菌平皿作空白对照。 5.1.6 及时将20 mL～ 25mL冷却至46 ℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃ 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，置水平台面待培养基完全凝固。
计算公式：
备注：
注意事项
培养基的选择 在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基： ① 马铃薯-葡萄糖-琼脂配有计算（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良 好。用PDA做平板计数时，必须加入抗菌素以抑制细菌。 ② 孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的 作用。孟加拉红还可以抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的 红色有助于霉菌和酵母菌落的计数
霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃,培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.１菌种试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。
05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
９%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、1。
３阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表１规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
图解GB 4789.15霉菌和酵母计数
GB 4789.15－2016霉菌和酵母计数野兽食品伙伴网应用概况1标准修订2标准详解3质控要求4CONTENTSPART 1霉菌和酵母概况Overview of mould and yeastNational Food Safety Standard Food Microbiological Examination病毒原核生物原生生物真菌植物动物生物六界分类法真菌（菌物）已发现七万多种大型真菌是各类蕈类，小型真菌包括霉菌和酵母。
与动物、植物主要的区别是，真菌有细胞壁，主要成分为甲壳素（几丁质）。
相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争力较弱，故只能在不利于细菌的环境中形成优势。
霉菌和酵母基本特性少数对人类有益，绝大多数不造成直接危害，但可导致食品的腐败变质，极少数能够致病或产生真菌毒素，危害极大。
细胞较大，代谢能力比细菌强100倍以上，故标准限量更严格。
危害生长水活度细菌0.90酵母0.87霉菌0.70卫生学意义霉菌和酵母计数主要用于判定样品被真菌污染程度，也可用于监测样品中真菌的性质和繁殖动态，进行样品的卫生学综合评价。
Mould and YeastPART 2检验方法标准修订Revision of Inspection Method Standard National Food Safety Standard Food Microbiological ExaminationGB 4789.15－84卫生部食品卫生监督检验所归口并负责起草。
主要起草人：罗雪云GB/T 4789.15－2003起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。
主要起草人：罗雪云、李风琴、李玉伟GB 4789.15－94卫生部食品卫生监督检验所归口并负责起草。
主要起草人：罗雪云GB 4789.15－2010未公布检验方法标准制修订GB 4789.15－2016起草单位：国家食品安全风险评估中心。
主要起草人：李凤琴、韩小敏、江涛、赵熙等参考国内外标准情况GB 4789.15－2010主要的技术性变化，就是培养温度从25℃～27℃修改为28℃。
4789.15-2010霉菌酵母注意事项图文详解
GB 4789.15-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数Enumeration of moulds and yeasts新标准的修改内容及适用范围•本标准与GB/T 4789.15‐2003 相比，主要修改如下：•——修改了范围；•——修改了检验程序和操作步骤；•——修改了培养基和试剂；•——修改了设备和材料；•——修改了附录。
•本标准的附录A 为规范性附录，附录B 为资料性附录。
适用范围•本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeasts）的计数方法。
•本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。
设备和材料• 2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。
• 2.2 恒温培养箱：28 ℃±1 ℃。
• 2.3 均质器。
• 2.4 恒温振荡器。
• 2.5 显微镜：10×～100×。
• 2.6 电子天平：感量0.1 g。
• 2.7 无菌锥形瓶:容量500 mL、250 mL。
• 2.8 无菌广口瓶：500 mL。
• 2.9 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)。
• 2.10 无菌平皿：直径90 mm。
• 2.11 无菌试管: 10 mm×75 mm。
• 2.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。
培养基和试剂• 3.1 马铃薯‐葡萄糖‐琼脂培养基：见附录A 中A.1。
• 3.2 孟加拉红培养基：见附录A 中A.2。
检验程序操作步骤‐样品的稀释• 5.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。
或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。
• 5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
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选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿， 倾注培养基后，培养观察，计数。 对霉菌的计数，还可以采用显微镜 直接镜检计数的方法。
霉菌和酵母菌及其检验
三、程序:
1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被
检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品
样品采集：
可疑食物 病人血清在未使用抗毒素治疗前采集
（4-5ml） 病人粪便 疑似患者外伤感染后的坏死组织或者是
渗出液
肉毒梭ห้องสมุดไป่ตู้及肉毒毒素检验
1 增菌（产毒培养） 2 分离培养 3 菌落特征及菌体形态 4 菌落特征及菌体形态 5 生化试验 6 肉毒毒素检验（小白鼠腹腔注射）
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征为红色菌落
霉菌和酵母菌及其检验
4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每 个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立 即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反 方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来 放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下 生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观 察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。
5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板 进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌 落数的平均值，乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单 位报告，液体检样以mL 单位报告。关于稀释倍数的选 择可参考细菌菌落总数测定。
霉菌和酵母菌及其检验
6．霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检的方 法进行计数。
上清液稀释500倍
上清液稀释5000倍 明胶磷酸盐缓冲液（对照组）
接种量 小白鼠 数
0.5ml 4 只
0.5ml 4 只 0.5ml 4 只
0.5ml 4 只
0.5ml 2 只
0.5ml 2 只
0.5ml 2 只 0.5ml 2 只
结果
4h死 亡 存活 4h死 亡 6h死 亡 16h死 亡 20h死 亡 存活 存活
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
分纯后主要生化鉴定
明胶 硫化 硝酸 葡萄 麦芽 乳糖 蔗糖 氢盐 糖 糖
+
+－ +
+ —+
肉毒毒素检验（小白鼠腹腔注射）
标本处理
上清液+10%胰酶水溶液（9：1） 37℃1小时 上清液+缓冲液煮沸10分钟 庖肉增菌48小时15分钟/2000转，取上 清液 上清液
上清液稀释50倍
样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。
如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。
液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。
2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增
稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉
菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。
菌落特征及菌体形态
普通琼脂平板上形成直径3-5mm不规则 菌落、半透明、绒毛样边缘扩散生长
血平板上形成发丝状或盘状的灰色菌落 有β-溶血
卵黄琼脂平板菌落及周围培养基上能分 解脂肪表面覆盖着特有的虹彩样薄层和 珠光层
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
生化试验
肉毒梭菌的生化反应变化 很大，同一型各菌株之间也不 完全一致。
微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。
分枝：如菌丝不太短，则多数呈分枝状，分枝与主干的直径
几乎相同，有分枝是鉴定霉功得出可靠的特征之一。
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
肉毒梭菌是厌氧性梭状芽胞杆菌属的一种。该 菌在厌氧环境中能分泌极强烈的肉毒毒素，引 起特殊的神经中毒症状
肉毒毒素通过消化道粘膜吸收，经血液扩散至 全身，主要侵犯中枢神经系统，因而表现出一 系列的神经症状。
3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几
种选择性培养基。
马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）
孟加拉红（虎红）培养基
高盐察氏培养基
霉菌在孟加拉红培养基上典型特征
霉菌在孟加拉红培养基上典型特征为红色菌落， 有黑色孢子 。
酵母菌在孟加拉红培养基上典型 特征
酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征为 红色菌落
主要临床特点：发病初期为无力、腹部不适、 咽部发紧、呕吐，继而出现声音嘶哑、饮水发 呛、吞咽困难、眼睑下垂、复视等眼部症状。
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
培养基、试剂
明胶磷酸盐缓冲液 10%胰酶水溶液（酶活力1：250） 庖肉培养基 卵黄琼脂培养基 肉毒分型抗毒诊断血清 革兰氏染色
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
食品卫生微生物学检验
GB/T 4789 -2003
1、霉菌和酵母计数 2、肉毒梭菌及肉毒毒素检验 3、罐头食品商业无菌的检验 4、乳酸菌检验
一、霉菌和酵母计数
1 范围 2 规范性引用文件 3 设备和材料 4 培养基和试剂 5 检验程序 6 操作步骤
霉菌和酵母菌及其检验
二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总
0.5ml 2 只
存活 7h内死亡 存活
5h内死亡
定型试验说明
标本中的肉毒毒素可被肉毒多价抗毒素 和B型抗毒素中和起到保护小白鼠免于死亡 的作用。
上清液煮沸10分钟可以破坏肉毒的毒素 证明标本中含有毒素。
此次样品检出结果为B型肉毒毒素
罐头食品商业无菌的检验
1 范围 2 规范性引用文件 3 术语与定义 4 设备和仪器 5 培养基和试剂 6 检验步骤 7 结果判定
定型试验
标本处理（抗毒素1ml+9ml上清液1：20 1ml）接种量 小白鼠 数
A-F混合型肉毒抗毒素
0.5ml 4 只
A型肉毒抗毒素
0.5ml 4 只
结果
存活 12h内死亡
B型肉毒抗毒素
E型肉毒抗毒素
对照组：上清液+缓冲液（1：1）煮沸10分 钟 对照组：上清液+缓冲液（1：1）
0.5ml 4 只 0.5ml 4 只 0.5ml 2 只
在显微镜下，霉菌菌丝具有如下特征：
平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下，整个菌丝的直径是
一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区
别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。
横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的
菌丝没有横隔。
菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显