生物大分子的分离-SJTU

10. 待磷酸缓冲液将进入柱床时，关掉恒流泵，用 滴管小心加入0.5ml血样（红），再打开恒流泵。
11. 血样将进入柱床时，用滴管小心加入磷 酸缓冲液至柱顶。
加样顺序 0.4ml还原铁(黄) 0.7ml缓冲液(白)
0.5ml血样(红)
12. 旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中， 打开恒流泵。
13. 观察并记录现象
O2
在层析柱中呈现其本来的黄色条
O2
带而远远地落在血红蛋白的后
边。
实验过程模式图
实验仪器设备的介绍与使用
1、层析柱 2、恒流蠕动泵
层析柱：Ø10×150mm
层析柱分解图
层析柱的安装要 垂直稳定，上下 不能倒置。
止水螺丝
恒流蠕动泵
调速旋钮
顺逆按钮
检查恒流泵止水螺旋是否旋紧
旋下层析柱两端螺旋，检查柱子是否装反
3、实验中始终不能使柱床干裂。 4、上样时要小心，避免破坏柱床面。 5、拆卸柱子时请勿将胶圈丢失。
避
免
使
干
柱
裂
床
的
干
柱
床
床
六、实验报告
用简图描述实验过程并分
Na2H2EDTA还原铁溶液 (黄色Eppendorf管
中, 0.4ml ) （4）上柱血样（抗凝血+10倍磷酸缓冲液+固体铁
氰化钾5mg/ml ，红色Eppendorf管中, 0.5ml )
黄色：还原铁样品
白色：缓冲液
红色：血样
四、实验步骤
1. 取血：制备抗凝血和上柱血样 。 2. 调速：在柱中注入1cm磷酸缓冲液，调节流速1滴/2秒。 3. 装柱：待柱中磷酸缓冲液流尽时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊状凝胶
¾ 反应原理
A
B B B
凝胶过滤不仅常用 作大分子物质的分离， 还可以根据需要用某种 试剂处理样品。当样品 流经该试剂区时，因为 可连续接触新鲜试剂， 因而可充分发生反应， 最后经过洗脱与过量的 试剂分开。
¾ 本实验试图通过血红蛋白颜色的变化来揭示凝胶层 析分离大分子物质的原理。
1. 首先, 在层析柱中加入含有Fe2＋
5.自然沉降20min 6. 用镊子取出圆片滤纸
7. 用镊子小心在胶 面上加入圆片滤纸, 打开恒流泵平衡 10min。
注意随时添加缓冲液，防止 柱床干裂。
样品进入柱床瞬间
8. 关掉恒流泵，用滴管小心加入0.4ml还原铁 （黄），再打开恒流泵。
9. 还原铁将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小 心加入0.7ml磷酸缓冲液（白），再打开恒流泵。
... .. .
洗脱液 凝胶床
小分子 .... .
大分子
..
....
....... . ..
. .....
... .
... .. . . . . ..
凝 胶
层
析
原
理
模
式
图
凝胶的排阻上下限
< 3 000
譬如，左图所示凝 胶的排阻上下限为 3 000‾60 000
>60 000 <60 000 进入凝胶孔隙的概率与相对分子质量的关系
实验材料与试剂介绍
（1）Sephadex G-25凝胶（小烧杯中，装柱用）
（2）pH7.0磷酸缓冲液 （分别装在500ml, 250ml 试剂瓶和白色Eppendorf管中0.7ml）
现配现用的试剂： （3） 40mmol/L FeSO4、 0.2 mol/L Na2HPO4,80m mol/L
14. 待色带全部流出，加快流速清洗2min。
15. 关闭电源，旋下柱顶螺丝。
16. 取下凝胶柱，倒出凝胶至小烧杯中。
检查胶圈 柱子两端的胶圈注意避免丢失！
17. 取出滤纸片，弃入废液缸中，重新装好层析柱。
五、注意事项
1、装柱前请务必检查柱子的上下避免 装反。
2、装柱及后面的实验过程中要尽量避 免层析柱的振动与倾斜。
的溶液，形成一个还原区带。
2. 当红褐色的血红蛋白样品（血红 Fe3+
蛋白与铁氰化钾的混合液）流经
还原区带时，褐色的高铁血红蛋
白与Fe2＋结合生成紫色的还原型 Fe2+
血红蛋白。
3. 还原型血红蛋白继续下移，与缓
Fe2+
冲液中的O2结合又形成了鲜红
的氧合血红蛋白。 4. 铁氰化钾则因相对分子质量小，
1. 取血，制备抗凝血和上柱血样 。
大白鼠心脏取血
大白鼠心脏取血
2. 用滴管在柱中注入 少量磷酸缓冲液,调 节流速为1滴/2秒。
3. 待柱中磷酸缓 冲液流尽时，关掉 恒流泵。
4. 把溶胀好的凝胶 搅拌均匀后，一次 性快速倒入柱中, 加 满至柱顶。
凝胶若是分批装入柱子会有什么 现象？对实验有无影响？
三、实验原理
特性
方法
生
电性: 极性:
离子交换层析
物
电泳 等电聚焦
大
分
吸附层析 纸层析
子
反相层析
分
疏水反应层析
离
大小:
超滤
的
凝胶电泳
策
凝胶层析 超速离心
略
特异性:
亲和层析
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
电泳
凝胶过滤
SDS-PAGE
双
抗
向
原
薄
抗
层
体
层
特
析
异
亲
和
离
层
子
Biblioteka Baidu
析
交
分
换
离
层
析
¾ 凝胶层析定义与原理
又称凝胶过滤，是一种按相对分子 质量大小分离物质的方法。其原理主要 是利用不同相对分子质量的生物大分子 体积的差别，造成其在凝胶柱床中洗脱 有效路径长短的差异，从而以不同的洗 脱时间先后从层析柱流出，最终达到分 离纯化的目的。
生物大分子的分离 —— 血红蛋白凝胶柱层析
一、实验目的
1. 了解生物大分子分离的方法 2. 了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握
凝胶柱层析的基本操作技术
二、实验器材
设备
1、层析柱、铁架台
2、恒流蠕动泵
试剂及用品
1. SephadexG-25 2. pH7磷酸缓冲液 3. 还原铁溶液 4. 上柱血样 5. 蒸馏水
一次性倒入柱中，自然沉降20min后，用镊子小心在 胶面上放置圆片 滤纸。 4. 平衡：打开恒流泵，平衡10min，注意随时添 加缓冲液，防止柱床干 裂。 5. 待缓冲液将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小心加入0.4ml还原铁 (黄)，打开恒流泵，待还原铁将进入柱床时关掉恒流泵，用滴管小心 加入0.7ml磷酸缓冲液（白），打开恒流泵。 6. 上样：待磷酸缓冲液将进入柱床时，关掉恒流泵用滴管小心加入 0.5ml血样（红），打开恒流泵，待血样将进入柱床时，用滴管小心 加入磷酸缓冲液至柱顶。 7. 旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，观察并记录现象。 8. 待所有有色带完全流出柱子后，加快流速，继续清洗凝胶柱2min。 9. 停止蠕动泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出 滤纸片，物归原位待老师检查后离开。