实验七、植物蛋白的提取

实验七、植物蛋白的提取

一、实验目的

熟悉植物蛋白提取原理和方法，了解其意义及其应用价值。

二、实验原理

植物蛋白提取一般遵循如下基本原则：尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；减少对蛋白质的人为修饰；破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则，植物蛋白制备过程中一般需要有四种试剂①离液剂：尿素和硫脲等；②表面活性剂：SDS、胆酸钠、CHAPS等；③还原剂：DTT、DTE、TBP、Tris-base 等；④蛋白酶抑制剂及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物等，如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子，可在其中加入0.1-5mmol/L EDTA，同时使金属蛋白酶失活。

三、仪器和试剂

仪器：离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱、分光光度计；三角瓶；试管；试管架；移液管；记时器；水浴锅

试剂：1. 20mL 样品提取缓冲液：2.5mL 0.5mol/LTris-HCl

3. -20℃下预冷丙酮

4. （1）标准蛋白质溶液：用0.9%NaCl溶解标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）粉末配制成10mg/ml的标准蛋白溶液。

（2）双缩脲试剂：称取 1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和 6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中或内壁涂以石蜡的瓶中。此试剂可长期保存，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

四、实验步骤（改良丙酮沉淀法提取叶蛋白）

1、蛋白提取

取0.3g 左右的植物叶片，加入4mL 提取缓冲液和适量石英砂，色素多的可按材料鲜重的10%加入PVP，在研钵中研磨充分后转入10 mL离心管中，摇匀并放在4℃条件下提取0.5h，充分溶解蛋白。4℃6000r/min 离心10min，弃沉淀，上清液中加入2.5～3倍体积的预冷丙酮-20℃条件下放置10min，让蛋白充分沉淀。之后，4℃6000r/min 离心5min，弃上清，使丙酮完全挥发后加入上样缓冲液500μl溶解沉淀，沉淀充分溶解后，转移至1.5mL

离心管中，4℃10000r/min 离心5min ，取上清液即为所提取的蛋白溶液。 2、蛋白定量（双缩脲法） （1）标准曲线的绘制

取6支试管分两组，分别加入0.1，0.3，0.5，0.7，0.9， 0毫升的标准蛋白质溶液，用0.9%NaCl 补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制出标准曲线。

（2）样品测定

取提取的蛋白质溶液0.1ml ，加0.9%NaCl 溶液0.9ml ，双缩脲试剂4.0ml ，混匀，于37℃水浴中放置20min ，在540nm 波长下进行比色。以标准曲线第6管（空白）调零点，测其吸光度（A ）。根据吸光度值查标准曲线，即可求出样品中蛋白质的浓度。（注意样品浓度不要超过10mg/ml ） 五、结果计算

样品蛋白质（%）=