内毒素的测定

侵袭性真菌感染的特点
1. 不产生内毒 素和外毒素 致病机理不明 2. 致病力一般 较弱，机体免 疫低下时发生
3. 感染菌种变化， 白色念珠菌感染下 降，曲霉菌感染增 长趋势上升明显
4. 早期症状无特异性， 往往被原发病掩盖，病 程长，发现较晚，死亡 率高
侵袭性真菌感染（IFI）现状

IFI发生率不断增加；
在胰腺疾病中的应用
在溃疡性结肠炎中的应用 在全身性细菌感染中的应用 在不明原因发热中的应用
6
内毒素检测在医院中的应用
1 2 3 4
在医院灭菌制剂检验中应用
对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测
在透析站和血站中的应用
在临床医学研究中的应用
内毒素的检测方法
鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。
糖尿病
胃癌，肝 癌，肝内 胆管癌， 肺癌，多 发性骨髓 瘤，白血 病，恶性 淋巴瘤
侵袭性肺部真菌感染
侵袭性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)的发病
率逐年上升,其中又以侵袭性肺部真菌感染( invasive
pulmonary fungal infection, IPF I) 最常见,大约占50% ～60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可
高达30% ～80% 。
侵袭性肺部真菌感染

临床表现：缺乏特异性,多表现为发热、咳
嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。

现 状：两高两低一快
高院内感染率和病死Fra Baidu bibliotek 低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快
检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。
ICU诊断延迟时间与死亡率的关系
-D-葡聚糖的评价

可检测多种致病真菌感染 念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，
毛孢子菌等

不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等） 敏感性、特异性：90％左右
• 对于念珠菌血症, G试验检测是首选检查
J. Clin. Microbiol. 2008.46:1009–1013.
G试验检测评价
Odabasi等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为
期3周每周2次采血检测及临床观察 发现：BG值开始高于60 pg／ml的时间比最后
确诊为IFI或临床诊断IFI平均提前了10 d
Clin Infect Dis，2004，39(2)：199—205
-D-葡聚糖参考值
检测值﹤10pg/ml,阴性。 检测值介于10～20pg/ml之间，临床
内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素 最严重的后果：致 的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化， 死性感染性休克， 多器官功能衰竭， 出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神 DIC等。病死率极 经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、 高。 缺氧及酸中毒等。
各类疾病内毒素血症的发生率
影响结果的因素

产生假阳性的原因有：操作环境及操作过 程中污染，应用某些抗生素类如-酰胺内酯 类、喹喏酮类等患者。
MB-80微生物快速动态检测系统
(1-3)--D-葡聚糖
侵袭性真菌感染的定义
定义: 指致病性真菌侵犯皮 下组织、黏膜、肌肉 和内脏器官等所引起 的真菌感染性疾病， 危害性较大。 条件致病性真菌 念珠菌属 曲霉属 其他
镰刀菌属 播散性接 赛多孢菌 感染 合菌病 属感染 83% 96% 58%
系列1
中国感染与化疗杂志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期
IFI诊断困难及漏诊情况严重

尸检研究发现，75%的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊 诊断困难的主要原因：

--- 临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖
--- 确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者
几丁质 麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶 14位还原和7－8位异构酶 角鲨烯环氧化酶
1-3-β-D-葡聚糖本质及特点
1
2 3
真菌细胞壁成分，占50%以上 其他微生物、动物及人的细胞不含该成分 用于侵袭性真菌感染的早期诊断
(1-3)-β-D-葡聚糖特性
1. 2.
3.
对热极为稳定，高压
121℃并不能使其灭活。

IFI感染病死率很高；
IFI诊断困难及漏诊情况严重。

侵袭性真菌感染的诱因
1.内源性诱因
影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、 肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等
2.外源性诱因

广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂； 插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；

免疫缺陷综合症
国内侵袭性真菌感染不容忽视
内毒素的检测原理
G G
内毒素的检测方法
鲎试剂（Limulus amebocyte lysate LAL)
1 2 3 4 5 6
凝胶法——0.03EU/ml范围内半定量 浊度法——0.006-300EU/ml,检测范围大
比色法——0.006-15EU/ml范围内定量
ELISA——0.1pg/ml
流式细胞术——测内毒素的量而不是活性 化学发光测定法
的病情所限难以实施 --- 真菌检测项目开展相对不足或滞后
主要可引发侵袭性真菌感染的疾病
呼吸系统 疾病 肺炎 肺纤维 症
感染及 寄生虫病 循环系统 疾病 内分泌 疾病
血液及造血 器官疾病
再生障碍 性贫血 MODS DIC
肿瘤类
肺结核 腹腔内脓 肿 AIDS
脑出血 脑梗塞 硬膜下血 瘤术后 胸部大动 脉瘤术后
30 35 33 35
死亡率(%)
30 25 20 15 10 11
诊断延迟 时间 (h)
12 h
12-24 h
24-48 h
48 h
Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:3640–3645.
美国四大医疗中心做的一项回顾性研究
45 40 35 36
内毒素检测的参考值
检测值﹤10pg/ml,阴性。 检测值介于10～20pg/ml之间，临床观察期， 建议动态采血检测。 检测值﹥20pg/ml，阳性，建议再次采血以确诊 。 肝炎 败血症 肿瘤 内毒素浓度 50-320 20-1000 20-700

检测样本的采集及影响因素
检测样本：血液 采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采 血管。常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患 者透析前采血）。 样本保存：样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及 时检测，应将血浆转移至无热原转移管内，在-30℃冰箱 中冷冻保存，一周内使用。 特殊标本处理 ：对一般黄疸、溶血、乳糜血标本，稀释2~5 倍后进行检测 ；对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本， 应重新采血。
反应曲线不一样。内毒素反应曲线
为S型特征曲线，而β -葡聚糖反应 曲线为经过0点的斜线。
内毒素和β -葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线
侵袭性真菌感染的临床检测方法对比
方 传 统 检 查
直接培养真菌法
法
特
点
敏感性低，耗时长, 培养阳性 率低。培养结果是定性的，有 些标本采集困难 观察期不确定，费时费力，特 征性不明显并对医师的专业水 平要求高 耗时短，灵敏度高，特异性强， 定量检测可判断感染严重程度 对儿童及接受造血干细胞移植 患者、ICU患者不适用
G试验检测评价
BG值在IFI临床表现出现之前就已经高于正常值

Pazos等报道5例确诊IFI及3例临床诊断的IFI患者，发现
BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部HRCT检
查发现以前 。
• 平均早于发热5 d • 早于呼吸道症状平均10.7 d
J Clin Microbiol，2005，43(1)：299—305
内毒素和1，3-β-D-葡聚糖检 测的临床应用
主要内容
内毒素的来源及结构 内毒素的生物学活性
内毒素检测的临床应用
内毒素的检测方法及参考范围
检测样本的采集及影响因素
内毒素概述
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结 构中的脂多糖（LPS），这些成分只 在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或 活菌以发泡形式将其释出。
感染人数
80 70 60 50 40 30 20 10 0 1981-1986 1986-1991 1991-1996 1996-2001 18 26 26 75
刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402
国内侵袭性真菌感染不容忽视
感染率(%)
50 40 30 20 10 0 13.9 17.1 24.4
内毒素的结构
外层 菌体多糖（O抗 原），与细菌侵 袭力有关。
中层 同一种属之间是相 同的。
内层 特殊的糖磷脂，起 毒性作用，而无种 属特异性。
特异性多糖
核心多糖
类脂A
内毒素的生物学活性
1 2
发热反应 激活血管活性物质的释放 激活凝血和纤溶系统
3
内毒素的生物学活性
4
激活补体 直接或间接损害肝脏 激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统
肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感 染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败 血症70%、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎 58-100%、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻
性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%。
内毒素检测的临床应用
1 2 3 4 5
在肝胆疾病中的应用
在呼吸系统感染中的应用
41
死亡率(%)30
25 20 15 延迟1天 延迟2天 延迟3天及以上 24
诊断延迟时间(d)
Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:25–31 .
真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
β1,3 1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层
1,3葡聚糖 合成酶
科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色：
热带念珠菌----灰蓝色 白色念珠菌 ----绿色 克柔念珠菌----粉红色 光滑念珠菌----紫红色 其他念珠菌----白色

科玛嘉念珠菌显色培养基的菌落颜色：
A/E--白色假丝酵母菌，B/C-克柔假丝酵母菌，F--光滑假丝酵母菌，D-热带假丝酵母菌
“G”试验缘何而来？

1-3-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解 物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。
试验反应机理图：
（1-3）-D-Glucan LAL-RM(反应物) G因子 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶）
活化G因子 凝固酶原
内毒素与β -葡聚糖的检测比较 已知能与鲎试剂发生反应的物质有 细菌内毒素和β -葡聚糖，但它们的
辅助方法：临床表现，免疫学，病 理学，影像学检查等 1.G试验：通过检测(1-3)-β -D-葡 聚糖的含量，判断是否有真菌感染 2.GM试验：曲霉属半乳甘露聚糖抗 原检测。判断是否曲霉属真菌感染
非传 统 检查
3.PCR技术：真菌的抗原、抗体及代 用于实验室检测，已成为这一 谢产物的血清学检查和真菌核酸检 领域研究的热点 测
5
6
内毒素的有益作用
1 2
增加机体非特异性免疫力
防御放射性损伤，促进粒细胞生成
3
4
增加网状内皮系统功能
抗肿瘤，免疫佐剂作用
内毒素血症产生原因
内毒素血症
内源性
1
2 3 肠道内毒素的吸收 败血症时血中细菌的释放
外源性
有效的抗菌治疗后，细菌崩解
输入了含有 细菌的药物、 血液或者体 液等。
内毒素血症的临床症状
1993-1996
1998-1999
1999-2000
临床药物治疗杂志 2007年第5卷第1期
各种真菌感染的病死率
100.00% 73.50% 80.00% 58% 60.00% 40.00% 20.00% 0.00% 29.50% 90% 83% 96%
粒细胞缺 侵袭性念 侵袭性曲 乏患者曲 珠菌病 霉菌病 霉菌感染 29.50% 73.50% 90%
其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒
素产生凝集反应的现象，作为判断试品
中细菌内毒素含量的一种方法。
背面观
就像是古代武士的心甲
腹面观 腹部基本呈六角形， 还可以看到它发达的附肢
内毒素的检测原理
革兰阴性菌脂多糖（内毒素）检测原
理：革兰阴性菌脂多糖（内毒素）激 活酶反应主剂中的相应因子后形成凝 固蛋白， 根据其引起的浊度变化对革 兰氏阴性菌脂多糖（内毒素）浓度进 行定量测定。
在念珠菌和曲霉菌细胞 壁中含量较多，对G 试验灵敏。
当真菌进入人体血 液或深部组织后， 经吞噬细胞的吞噬 、消化等处理后， (1-3)-β-D-葡聚糖可 从胞壁中释放出来 ，从而使血液及其 它体液中含量增高 。当真菌在体内含 量减少时，机体免 疫系统可将其清除 。
在浅部真菌感染 中，(1-3)-β-D葡聚糖未被释放 出来，故其在体 液中的量不增高。