第二十章经典液相色谱法

第一节 吸附色谱法
（2 ①喷雾显色 将显色剂用电动薄层喷雾器直接喷洒于硬
板上，根据显色剂的不同，可直接显色或加热显色。 ②浸渍显色 也可用浸渍法处理薄层，使生成颜色稳
定、轮廓清楚、灵敏度高的色斑。利用某些物质的蒸 气与样品作用生成不同颜色或产生荧光，也可用于斑 点的检出。 ③蒸气检出法 多数有机化合物能吸附碘蒸气而显示黄 色斑点。有些化合物遇碘蒸气后发生紫外吸收的变化
Rst值可以大于1
第一节 吸附色谱法
1．间接定量法 (洗脱测定法) 薄层展开后，将被测物
斑点或区带捕集，用溶剂洗 脱，然后再用适当的分析方 法(比色法、分光光度法、 气相色谱、荧光分析法等)
2．薄层扫描法 该法快速、简便，结果灵敏、准确，适用于多
组分物质和微量组分的定量。 （1）薄层扫描仪
薄层扫描仪光学 系统结构示意图
第一节 吸附色谱法
4 （1
②有些化合物在可见光下不显色，但可吸收紫外光，且 能发射更长波长的光而显示不同颜色的荧光斑点，故 在紫外灯下显现不同颜色。紫外分析仪有短波型 (254nm)和长波型(366nm)两种灯。
③在可见紫外光下都不显色，也没有合适显色方ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的化 合物，可以用荧光薄层进行分离。化合物在紫外光灯 下可在发亮的背景上显示暗斑。
预制板是由工厂生产出来的商品板，使用方便，涂 布均匀，薄层光滑，牢固结实，分离效果及重现性好。 品种繁多，规格齐全，能满足不同的分析要求。
第一节 吸附色谱法
2 点样体积：经典薄层一般为1～10μL，高效薄层为
100～500nL； 点样形状：一般为圆形点，点样基线距底边1.0～
1.5cm，样点直径为2～3mm，高效薄层原点直径 约为1mm，要尽可能避免多次点样； 点间距离：可视斑点扩散情况而定。一般经典薄层为 1～2cm，高效薄层为0.5cm； 常用的点样器具：定量毛细管（0.5、1、2、3、4、5和 10μL）和铂铱合金毛细管（100nL和200nL），另 一类是注射器式的可变体积 微量点样器和毫微点样 器，用手工点样时常用定量毛细管。
第一节 吸附色谱法
(二)薄层色谱 按薄板的分离效能，可分为经典薄层色谱法(TLC)
及高效薄层色谱法(HPTLC)两类。 薄层色谱有下列一些特点：
(1)展开时间短，一般只需十几分钟到几十分钟； (2)分离能力较强，一块板可分离多达约20个组分； (3)灵敏度高，通常使用的样品量为几至几十微克； (4)显色方便，可直接喷洒腐蚀性的显色剂； (5)所用仪器简单，操作方便； (6)
透射法测定时，SX值越大，吸光度越大；反射法测 定时，SX值越大，反射度越小。
SX值取决于薄层吸附剂的性能、粒度和分布情况。 SX值要预先测定，通过仪器的线性补偿器，用电路系统 将弯曲的曲线校正为直线后用于定量。
线形校正 1-校正前的标准曲线 2-校正后的标准曲线
第一节 吸附色谱法
②扫描方式 扫描方式分线性(直线)扫描和锯齿(曲折)扫描法。
外标法是更为常用的定量方法。
第一节 吸附色谱法
六、高效薄层色谱(HPTLC) 高效薄层色谱法是在七十年代中期由常规TLC
发展形成的，也称毫微(克)量薄层色谱(nano－ TLC)。
高效薄层色谱法具有快速、高效、灵敏的特点。 高效薄层色谱之所以能达到高效，主要取决于 吸附剂的性能及涂板、点样和展开等微量操作技术。 高效薄层色谱法定量多用薄层扫描法。
第一节 吸附色谱法
F
d3
薄层点样示意图
××××××
s1 2s 12
d2
d1
S-对照品溶液； 1.2-样品溶液；×－原点； d1-点间距离；
d2-原点与板底边距离；d3-展距；F-溶剂前沿
第一节 吸附色谱法
3 点样后的薄层，置密闭的玻璃槽中，用合适的
展开剂展开。展开剂浸入薄层下端高度不应超过 0.5cm。点样处不可接触展开剂，展距一般为8～ 15cm。
第一节 吸附色谱法
制备含粘合剂的硬板，要先制备固定相的匀浆，调 制固定相的匀浆时可将一定量的固定相按上表比例加入 适量水或粘合剂，在研钵中或在匀浆器中调匀，倒入手 动或自动涂布器中涂布。室温下阴干后，活化后备用。
定性定量分析时薄层厚度为0.3～0.5mm，制备薄 层厚度为0.5～2mm。 （2）预制板
(二)吸附等温线 吸咐等温线是指在一定温度下，某一组分在固定
相和流动相之间达到平衡时，以组分在固定相中的浓 度Cs为纵坐标，以组分在流动相中的浓度Cm为横坐 标得到的曲线。
等温线的形状是重要的色谱特性之一，它有三种 类型：线型、凸型和凹型。
通常在低浓度时，每种等温线均呈线型，而高
第一节 吸附色谱法
第一节 吸附色谱法
（2）定量方法 ①外标法 分为外标一点法和外标二点法。 A 外标一点法
工作曲线通过原点（截距为零） 时可用外标一点法定量，需点一种 浓度的对照品溶液。
C＝F1·A
C为样品的浓度或重量，A为样品的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数
B 外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定
量，至少要点在同一薄层板上二种不同浓度的对照 品溶液(或一种浓度两种点样量) 。
CF1AF2
F1 和F2都是通过测量随行的对照品溶液的浓度（C1和C2）和 峰面积（A1和A2）求出，所以这种方法又叫随行标准法。
第一节 吸附色谱法
②内标法 本法与外标法的主要区别，在于用内标法时面
积累计值为被测样品和内际物的面积之比。由于内 标物与被测物的测定是在同—通道上，因此要求内 标物的吸收波长接近被测物质的吸收波长，并与被 测物质的斑点要完全分开。因而，内标物的选择比 较困难。
锯齿形扫描方式能消除展开后斑点形状不规则而引 起的误差，可获得满意的定量结果。 ③双波长法扫描
光源的光分两路，通过两个分光器出来两束不同波 长的光。一路用于测量样品，称样品波长λS；另一路 做为对照，称参比波长λR。 双波长法可以消除斑点处薄层本身的干扰，消除薄 层厚度不均匀引起的基线波动，能可靠地检测痕量组分.
Rf =1，表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶 剂同步移动。
一般要求Rf值在0.2～0.8之间。
第一节 吸附色谱法
影响Rf值最重要的因素是吸附剂的性质与展开 剂的极性和溶解能力。
当应用同一种吸附剂和同一种展开系统时，被
测物质的Rf 1．薄层厚度 2．展开距离 3．展开容器中展开剂蒸气的饱和度 4．点样量 5．薄层含水量
第一节 吸附色谱法
五、定性与定量分析 (一) 1.比移值Rf
在薄层色谱法中，常用 比移值Rf来表示各组分在 色谱中的位置。
原点至斑点中心的距离
Rf 原点至溶剂前沿的距离
Rf与分配系数K及容量因子k之间的关系为：
Rf
1 1 1 K Vs 1 k
Rf值为常数，V其m 值在0～1之间。
Rf =0，表示化合物在薄层上不随溶剂的扩散而移 动，仍在原点位置；
愈高，其吸附活性愈低，活性级数愈大，吸附力就 愈弱。反之亦然，含水量愈低，其活性愈高，活性 级数愈小，吸附力就愈强。
吸附剂使用前必须先经过活化处理。在一定 温度下，加热除去水分以增强活性的过程称之为活 化。反之，加入一定量水分便可使其活性降低，亦
分离极性小的物质，一般选用吸附活性大的吸 附剂，反之，分离极性大的物质则应选用活性小的 吸附剂。
第一节 吸附色谱法
1 （1）手工制板
手工制板所用的玻璃板，除另有规定外，一般 为10cm×10cm,10cm×15cm,20cm×10cm或 20cm×20cm的2mm厚规格，要求板面平整，洗净 后放置在薄层板放置架上备用。然后用手动或自动 涂布器将已调好的固定相均匀地涂铺在玻璃板上。 最好用自动涂布器。
第一节 吸附色谱法
①测定方式及原理 A 吸收测定法
可见区(370～700 nm)用钨灯，紫外区 (200～370nm)用氘灯为光源。 B 反射测定法
光束照到薄层斑点上测量，反射光强度。 C 透射测定法
光束照到薄层斑点上，测量透射光强度。 D 荧光测定法
用汞灯或氙灯(200～700 nm)为光源。
吸收参数（KX）与样品浓度成正比，所以无论是反 射法还是透射法，测得值与样品之间都不呈线性。
对于样品成分复杂的 混合物，可采用双向展开法。
第一节 吸附色谱法
点于同一薄层的同一物质的斑点，在色谱展开 过程中，靠薄层边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点 的Rf值有所不同，此称边缘效应。
第一节 吸附色谱法
为了减少边缘效应，可采取下列办法： (1)最好用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一
定时间，待溶剂蒸汽达到饱和后再行展开； (2)在展开缸内壁贴上浸 湿展开剂的滤纸条； (3)如采用3cm以下的狭 小薄板，只点2～3个点。
第一节 吸附色谱法
2. 首先将被分离样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶
剂极性应低，体积要小。 上样前，应将柱上端的溶剂放出至近吸附剂表面。沿
管壁加入样品溶液，溶液加完后，打开活塞使液体慢慢放
在洗脱时，用分液漏斗连续不断地加入洗脱剂，并保 持一定高度的液面。在收集洗脱液时，应采用等份集。 3
可以通过分段收集流出液，采用相应的物理和化学方 法进行检出。常用的检出方法很多，如化学反应法、TLC 及其它方法。
A. 线型 B. 凸型 C.凹型 a. 吸附等温线 b. 相应的洗脱峰型
第一节 吸附色谱法
二、吸附剂 吸附色谱法对吸附剂有下面几点基本要求： ① 有较大的表面积，有足够的吸附能力，但对 不同物质其吸附能力又不一样； ②与洗脱剂、溶剂及样品不起化学反应，并在 所用溶剂和洗脱剂中不溶解； ③ 粒度均匀，粒度要细。
第一节 吸附色谱法
硅醇基有两种形式，一种是游离羟基(Ⅰ)，另一
种是键合羟基(Ⅱ)，当硅胶加热到200℃以上时，失
去水分，使表面羟基变为硅醚结构(Ⅲ)，后者为非
极性，不再对极性化合物有选择性保留作用而失去
色谱活性。
H
HH
O
OO
S i (Ⅰ) S i S i (Ⅱ)
O
Si Si
(Ⅲ)
由于硅胶具有弱酸性，所以选择性地保留胺类
1．线型吸附等温线 是理想的等温线 当吸附平衡常数K一定时，其吸附等温线为
线型，即达到平衡时，组分在固定相中的浓度 Cs与其在流动相中浓度Cm成正比，直线的斜率 为K。
第一节 吸附色谱法
2 在几乎所有的实际情况下，吸附等温线都有
些弯曲而呈非线型。一般液-固吸附色谱系统大 多呈现凸形吸附等温线。
第一节 吸附色谱法
第一节 吸附色谱法
(一)常用的吸附剂 吸附剂可分为有机和无机两大类。其中以硅
胶和氧化铝、聚酰胺较为常用。 1.硅胶 2. 氧化铝
第一节 吸附色谱法
1.硅胶 其骨架表面的硅醇基，能吸附大量水分，这
种表面吸附水称为“结合水”，加热至105℃～ 110℃左右能除去，除去的水分越多，吸附能力 越强。
硅胶的活性与含水量有关，“结合水”高达 17%以上时，吸附能力降低。
第一节 吸附色谱法
选择色谱分离条件时， 必须从吸附剂、被分离 物质、流动相（展开剂） 三方面综合考虑。
组分
吸附剂 流动相
极性
活性小
极性
非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性
第一节 吸附色谱法
(一) 1. 色谱柱的制备 (1)玻璃柱 干装法
湿装法 (2) 尼龙柱 用于色谱分离的尼龙柱，应具备下列条件： ①应有一定的强度，且易于切割； ②对有机溶剂呈惰性，且能用手工热封；
第一节 吸附色谱法
2.相对比移值Rst
为了解决由于Rf值重现性差，进行定性困难的
问题，常采用相对比移值Rst来定性。 相对比移值Rst
原点至样品斑点中心 距的 离 Rst 原点至参考物斑点中 的心 距离
Rst值是相对Rf值，是样品与参考物移动距离之
比，可消除许多系统误差。参考物是另外加入也可 以直接以样品中某一组分作为参考物。
和其它碱性化合物。
第一节 吸附色谱法
2. 氧化铝
碱性氧化铝(pH9～10)适用于碱性和中性化合物
中性氧化铝(pH7.5)适用范围广，凡是酸性、碱 性氧化铝可以使用的，中性氧化铝也都适用。
酸性氧化铝(pH5～4)适用于分离酸性化合物。
第一节 吸附色谱法
(二) 吸附剂的活性和含水量有一定的关系。含水量
第二十章经典液相色谱法
经典液相色谱法
经典液相色谱法包括经典柱色谱法和平面色谱法。 经典色谱法与现代色谱法的区别主要在于输送流动
相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度 和检测灵敏度等方面。 现代色谱法灵敏度高，分离效率高。但经典色谱法 也有许多优点，设备简单，操作方便，分析速度快。
第一节 吸附色谱法