第二十章经典液相色谱法
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经典液相色谱法
例：在薄层板上分离A、B两组分的混合物，当原点至溶剂前沿
距离为16.0 cm 时，两斑点质量重心至原点的距离分别为 6.9 cm 和5.6 cm，斑点直径分别为0.83 cm 和0.57 cm。 求两组分的分离度及Rf 值。 解：
2d 2 (6.9 5.6) R 1.9 W1 W2 0.83 0.57
一般低温展开效果较好 温度 物质极性
•
展开剂极性 展开剂极性↑ Rf 极性物质Rf ↑ 亲脂性组分Rf ↓ 展开剂蒸气
极性大，Rf小 极性小，Rf大
•
对Rf 影响较大，应先让溶剂蒸气将层析缸饱和
例:用纸色谱分离，正丁醇为流动相，比较下面三个化合物的 Rf
CHO HC HO CH HC HC OH OH OH
1 Rf 1 k
k (1 Rf ) / Rf
Vm: 薄层板的死体积; K: 该条件的分配系数
VS: 板固定相体积;
在色谱条件确定的情况下，K大Rf 小，K小Rf 大。
分离物质性质 薄层板性质 Rf 影响因素 展开剂极性 温度 展开剂蒸气饱和程度
(2) 相对比移值 (retardation factor, Rr ) 某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现性差。 可用相对比移值定性。
5.6 0.35 16.0
Rf,A
6.9 0.43 16.0
Rf,B
四. 薄层色谱法
点样
展开
过程：铺板→活化→点样→饱和→展开→显色→定性定量
1. 原理:
将混合组分的试液, 点在铺了吸附剂的玻璃板一端, 在密
闭容器中用适当的溶剂 (展开剂、流动相) 展开, 各组分不断 地被吸附, 解吸附… 随展开剂前移, 利用吸附剂对不同组分 的吸附力 (吸附常数)不同, 产生差速迁移, 而达到分离。
第二十章 高效液相色谱(0512)课件
四、检测器
检测器是液相色谱仪的三大关键部 件之一。对检测器的要求是，灵敏度高 、重复性好、线性范围宽、死体积小以 及对温度和流量的变化不敏感等。
检测器的分类
在液相色谱中，有两种类型的检测器 ，一类是溶质性检测器，它仅对被分离 组分的物理或物理化学特性有响应。属 于这类的检测器有紫外、荧光、电化学 检测器等。另一类是总体检测器，它对 试样和洗脱液总的物理或化学性质有响 应。属于这类的检测器有示差折光检测 器等。
输液泵
输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流 泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定 性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质 的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要 依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两 大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞 往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。
直接紫外检测： 所使用的流动相为在检测 波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接 测定被测组分的紫外吸收强度。
间接紫外检测： 使用具有紫外吸收的溶液 作流动相，间接检测无紫外吸收的组分 。
柱后衍生化光度检测： 对于那些可以与显 色剂反应生成有色配合物的组分，可以 在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适 的显色剂反应，在可见光区检测生成的 有色配合物。
紫外-可见光检测器
原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分 对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组 分浓度成正比。
UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有 很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度 、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所 以还能用于梯度淋洗。
用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度 ，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检 测波长。
经典液相色谱法 ppt课件
和薄层色谱。
ppt课件
3
1.2 吸附色谱法的依据
吸附过程的两个规律： 1）吸附过程是可逆的，存在着吸附 平衡,存在一个吸附平衡常数 解附的动态
K=Cs/Cm
2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异
ppt课件 4
吸附机理
流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流
动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分 子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之， 溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。
SO3H CH CH2 CH
SO 3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H CH2 CH
SO3H
SO3H
SO3H
ppt课件
SO3H
SO3H
50
交换反应： R-SO3-H+ + Na+ + ClR-SO3- Na+ + H+ + Cl-
ppt课件
51
1.2 阴离子交换树脂
根据可交换的离子的不同
低交联度树脂－网状结构疏松，网眼大，具有较好的渗 透性，但存在着易变形和耐压差等缺点。
ppt课件 53
根据分离对象选择树脂交联度：
分离小分子物质（氨基酸） ——选择8%树脂为宜
分离分子量较大的物质（多肽）
——选择2－4%树脂为宜
保留：极性越小的组分保留越强
ppt课件
40
3. 载体
作用：负载固定液 要求：化学惰性，粒度小而均匀，纯净，与固定液间
有较大的分子间作用力。
常用载体：硅胶 、硅藻土 、纤维素
ppt课件
41
4. 固定液相与流动液相
第二十章高效液相色谱(第五版)
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
56
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
48
光电二极管阵列检测器
49
(二) 荧光检测器 fluorophotometric detector 特点： • 灵敏度高（高于紫外检测器）
• 只适用于能产生荧光或其衍生物能发
荧光的物质。
50
(三) 蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector
流动相 （样品）
流动相蒸发除去
加热
组分形成气溶胶
强光
特点： 测定散射光强 • 灵敏度低 I = k mb • 通用型：如糖类、 氨基酸等分析
51
(四) 化学发光检测器
组分 + 发光试剂 激发态产物 光辐射
n1/2 -1 k2 R = —— (——) (——) 4 1+k2
：主要受溶剂种类的影响
k ：主要受溶剂配比的影响
29
选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失； （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
24
第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
一、化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
经典色谱法液相
流动相极性顺序： 石油醚< 环已烷<苯<甲苯<乙醚<三氯甲烷 <乙酸乙酯<丙酮<正丁醇<乙醇<甲醇<水 常用：混合溶剂 如：不同配比的甲醇-水或甲醇 亲脂性成分用氯仿、乙酸乙酯
15
4. 三者关系：
组分 极性大 非(弱)极性 吸附剂 活性小 活性大 流动相 极性 非极性或弱极性
16
（四）、操作方法
37
渗透系数K 溶胶孔穴内外同等大小的溶质 分子处于扩散平衡状态。
Xs K X m
渗透系数K由溶质分子的体积大小与孔穴的孔径大小的 相对关系决定，与流动相的种类无关。 K越大，保留时间越长
38
二、凝胶的分类 （自学） 三、操作方法及应用 （自学）
39
小结
经典液相柱色谱的主要用途：
如：氧化铝一般适合碱性物质和中性物质的分离
硅胶适用于酸性及中性物质的分离
48
1.硅胶：
硅胶H、硅胶G、硅胶HF254、硅胶GF254 G：指含煅石膏(Gypsum)黏合剂 H：不含黏合剂
F254：含一种在254nm下能发出黄绿 色荧光的无机荧光剂 F365：含荧光剂，365nm紫外光照发光
7
1. 硅胶（SiO2· H2O）中等极性吸附剂
吸附机制： 表面的硅醇基，与物质形成氢键 失活：水与硅醇基结合使其失去活性 活化：105-110℃加热30min 适用范围：微酸性（pH=4~5）， 适于酸性和中性物质 粒度：100-200目
8
2. 氧化铝：吸附力较强
碱性氧化铝 pH 9～10 如：生物碱 适于分析碱性、中性物质
41
操作形式:平面
流动相：展开剂
操作：点样、展开 驱动力:毛细管力
15
4. 三者关系：
组分 极性大 非(弱)极性 吸附剂 活性小 活性大 流动相 极性 非极性或弱极性
16
（四）、操作方法
37
渗透系数K 溶胶孔穴内外同等大小的溶质 分子处于扩散平衡状态。
Xs K X m
渗透系数K由溶质分子的体积大小与孔穴的孔径大小的 相对关系决定，与流动相的种类无关。 K越大，保留时间越长
38
二、凝胶的分类 （自学） 三、操作方法及应用 （自学）
39
小结
经典液相柱色谱的主要用途：
如：氧化铝一般适合碱性物质和中性物质的分离
硅胶适用于酸性及中性物质的分离
48
1.硅胶：
硅胶H、硅胶G、硅胶HF254、硅胶GF254 G：指含煅石膏(Gypsum)黏合剂 H：不含黏合剂
F254：含一种在254nm下能发出黄绿 色荧光的无机荧光剂 F365：含荧光剂，365nm紫外光照发光
7
1. 硅胶（SiO2· H2O）中等极性吸附剂
吸附机制： 表面的硅醇基，与物质形成氢键 失活：水与硅醇基结合使其失去活性 活化：105-110℃加热30min 适用范围：微酸性（pH=4~5）， 适于酸性和中性物质 粒度：100-200目
8
2. 氧化铝：吸附力较强
碱性氧化铝 pH 9～10 如：生物碱 适于分析碱性、中性物质
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操作形式:平面
流动相：展开剂
操作：点样、展开 驱动力:毛细管力
【大学课程】分析化学第20章 高效液相色谱法
2021/11/1
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
2021/11/1
（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
2021/11/1
2021/11/1
液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
2021/11/1
液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
2021/11/1
2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
2021/11/1
小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
2021/11/1
（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
2021/11/1
2021/11/1
液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
2021/11/1
液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
2021/11/1
2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
2021/11/1
小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
经典液相色谱法
依据规律：
（1）基本母核相同—基能力越强
共轭双键越多，吸附能力也越强 （3）基团的空间排列—能形成分子内氢键吸附能力较弱
16
液相色谱的固定相和流动相
2. 吸附剂的选择 分离极性小的物质，选用吸附能力强的吸附剂 分离极性大的物质，选用吸附能力弱的吸附剂
常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法
经典柱色谱法 平面色谱法
现代液相色谱法
高压输液泵输送流动相
高效液相色谱法（HPLC）
4
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱
5
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱
溶质基于吸附现象而获得分离的液-固色谱分析方法 分离分析极性至弱极性的化合物
固定相——吸附剂 流动相——有机溶剂
6
液相色谱的固定相和流动相
吸附色谱的固定相 1.对吸附剂的要求 1）有较大表面积和足够的吸附能力，对不同物
质吸附能力不同 2）与洗脱剂、溶剂、样品不起化学反应，且不
溶于洗脱剂和溶剂 3）粒度细而均匀
7
液相色谱的固定相和流动相
2. 常用吸附剂 -有机类：
活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔树脂 -无机类：
亲水性凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
亲脂性凝胶 葡聚糖凝胶LH-20 聚苯乙烯凝胶
28
经典液相柱色谱法
硅胶吸附柱色谱 聚酰胺柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法
平面色谱法
借用毛细作用的原理输送展开剂（流动相），色 谱过程在平面上进行的方法。 固定相成平面状态，试样溶液点于平面一端，在 相对密闭的容器中展开（分离）后，根据组分在 平面上移动的距离和浓度进行分析。 常用有薄层色谱法和纸色谱法
吸附色谱的条件选择 组分在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于： 1. 吸附剂对样品各组分的吸附能力-吸附活性 2. 洗脱剂对各组分的解吸能力-极性大小 3. 待分离各组分本身极性差异-结构性质
（1）基本母核相同—基能力越强
共轭双键越多，吸附能力也越强 （3）基团的空间排列—能形成分子内氢键吸附能力较弱
16
液相色谱的固定相和流动相
2. 吸附剂的选择 分离极性小的物质，选用吸附能力强的吸附剂 分离极性大的物质，选用吸附能力弱的吸附剂
常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法
经典柱色谱法 平面色谱法
现代液相色谱法
高压输液泵输送流动相
高效液相色谱法（HPLC）
4
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱
5
液相色谱的固定相和流动相 吸附色谱
溶质基于吸附现象而获得分离的液-固色谱分析方法 分离分析极性至弱极性的化合物
固定相——吸附剂 流动相——有机溶剂
6
液相色谱的固定相和流动相
吸附色谱的固定相 1.对吸附剂的要求 1）有较大表面积和足够的吸附能力，对不同物
质吸附能力不同 2）与洗脱剂、溶剂、样品不起化学反应，且不
溶于洗脱剂和溶剂 3）粒度细而均匀
7
液相色谱的固定相和流动相
2. 常用吸附剂 -有机类：
活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔树脂 -无机类：
亲水性凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
亲脂性凝胶 葡聚糖凝胶LH-20 聚苯乙烯凝胶
28
经典液相柱色谱法
硅胶吸附柱色谱 聚酰胺柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法
平面色谱法
借用毛细作用的原理输送展开剂（流动相），色 谱过程在平面上进行的方法。 固定相成平面状态，试样溶液点于平面一端，在 相对密闭的容器中展开（分离）后，根据组分在 平面上移动的距离和浓度进行分析。 常用有薄层色谱法和纸色谱法
吸附色谱的条件选择 组分在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于： 1. 吸附剂对样品各组分的吸附能力-吸附活性 2. 洗脱剂对各组分的解吸能力-极性大小 3. 待分离各组分本身极性差异-结构性质
经典液相色谱法
O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C N H n
10
酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中 的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌 类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸 附作用。 （4）大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔 网状结构的高分子吸附剂。理化 性质稳定，不溶于酸、碱及有机 溶剂。大孔树脂可分为非极性和 中等极性两类，在水溶液中吸附 力较强且有良好的吸附选择性， 而在有机溶剂中吸附能力较弱。
一、基本原理 1．分子筛效应
26
体积大的组分完全不能进入凝胶 颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶 颗粒之间的间隙随流动相最先流 出色谱柱；而体积小的组分，可 渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此 在流经凝胶颗粒之间的间隙和全 部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流 出；介于大小分子中间的组分， 只能进入一部分颗粒内较大的孔 隙，在中间时间段流出。
n
n
因为流动相的量很大，Y m Y a 近似于常数，而 且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常 数可写成
n
4
K
X a X m
X X
a
/S
a
Cs Cm
m
/V m
[ X a ]为溶质分子在吸附剂表 面的浓度 [ X m ]为溶质分子在流动相中 的浓度
Sa 为吸附剂表面面积 Vm为流动相的体积
加热除水，活性提高，吸附力加强（活化） 吸水，活性下降，吸附力减弱。 三、色谱条件的选择 选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物 质、流动相(洗脱剂)三方面进行综合考虑。
13
1. 被分离物质的极性 被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢! 常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂 类 < 酮类< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类 被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。 (2) 分子双键多, 吸附力 ↑。 (3) 空间排列 , 影响极性。
10
酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中 的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌 类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸 附作用。 （4）大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔 网状结构的高分子吸附剂。理化 性质稳定，不溶于酸、碱及有机 溶剂。大孔树脂可分为非极性和 中等极性两类，在水溶液中吸附 力较强且有良好的吸附选择性， 而在有机溶剂中吸附能力较弱。
一、基本原理 1．分子筛效应
26
体积大的组分完全不能进入凝胶 颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶 颗粒之间的间隙随流动相最先流 出色谱柱；而体积小的组分，可 渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此 在流经凝胶颗粒之间的间隙和全 部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流 出；介于大小分子中间的组分， 只能进入一部分颗粒内较大的孔 隙，在中间时间段流出。
n
n
因为流动相的量很大，Y m Y a 近似于常数，而 且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常 数可写成
n
4
K
X a X m
X X
a
/S
a
Cs Cm
m
/V m
[ X a ]为溶质分子在吸附剂表 面的浓度 [ X m ]为溶质分子在流动相中 的浓度
Sa 为吸附剂表面面积 Vm为流动相的体积
加热除水，活性提高，吸附力加强（活化） 吸水，活性下降，吸附力减弱。 三、色谱条件的选择 选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物 质、流动相(洗脱剂)三方面进行综合考虑。
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1. 被分离物质的极性 被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢! 常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂 类 < 酮类< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类 被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。 (2) 分子双键多, 吸附力 ↑。 (3) 空间排列 , 影响极性。
第二十章高效液相色谱法
φ A , φB
—每个溶剂体积分数。
例如：如何用水和乙腈配制 P ' 值为6.9二元溶剂？
' ' ' 已知： PH2O 10.2; PACN 5.8; PIPA 3.9.
' ' ' 解： PAB φ A PA φB PB ' ' φH2O PH2O φ ACN PACN ' ' φH2O PH2O (1 φH2O )PACN
φH2O 10.2 (1 φH2O ) 5.8 6.9 φH2O 0.25
水：乙腈=25：75
3. 溶剂强度参数（表20-1）
（2）溶剂强度参数 ε
*
定义：溶剂分子在单位吸附剂表面的吸附能。
ε* 2 0.8ε* 2O3 SiO Al
使用于吸附色谱或正相色谱
3. 溶剂强度参数（表20-1）
2. 进样系统
1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简 单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进 样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，
如图。
装入样品 采样环 进样
进色谱柱 泵入溶剂 出口
3. 分离系统（色谱柱）
1）柱材料：
常用内壁（抛光）光滑的优质不锈钢柱，使用前
三. 应用
由于HPLC分离分析的高 灵 敏 度 、 定量 的 准 确 性 、
适 于 非挥发性 和 热不稳定
组 分 的 分 析， 因 此 ， 在工 业 、 科 学 研究 ， 尤 其 是在 生 物 学 和 医学 等 方 面 应用 极 为 广 泛 。如 氨 基 酸 、蛋 白 质 、 核 酸、 烃 、 碳 水化 合 物 、 药 品、 多 糖 、 高聚
高效液相色谱法习题答案
第二十章高效液相色谱法思考题和习题1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点：2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。
优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。
目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。
①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。
3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。
用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。
反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。
用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。
4．简述反相键合相色谱法的分离机制。
典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。
固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。
非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。
反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。
硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。
对于反相色谱的分离机制目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。
第二十章经典液相色谱法
第
二 十
柱色谱的制备流程
章
经
典
液
相
色
谱
法
(1)玻璃柱
装柱
(2)尼龙柱
(四步曲）
（1）溶解样品 （2）上样 （3）洗脱
采用相应的物理和化 学方法进行检出。
常用的检出方法很多 ，如化学反应法、 TLC及其它方法
1.色谱柱的制备 2. 加样 3.洗脱
4．检 出
第
二
十
章
经
典 液
❖ 2.
相
色
谱
法
第
二
十 (二)薄层色谱 (thin layer chromatography)
第二十章经典液相色谱法
《现代仪器分析》 经典液相色谱法
第
二 十
经典液相色谱法
章
经
典
液 相 色
❖包括经典柱色谱法和平面色谱法。
谱
法 ❖经典液相色谱法是在常压下靠重力或
毛细作用输送流动相的色谱方法。
❖经典色谱法与现代色谱法的区别：
主要在于输送流动相方式、固定相 种类和规格、分离效能、分析速度和 检测灵敏度等方面。
适用范围：具微酸性，适于酸性和中性物质
粒度：100~200目
第
二
十
章
经
典 液
硅醇基的两种形式:
相
1.
色 谱
H
法游
O
离
O
型
Si
△到 200℃
Si Si
2.
HH 键O O
硅醚结构
合 型
Si Si
非极性，不再对极性化合物 有选择性保留作用而失去色 谱活性
第
二
十
《液相色谱法》课件
DATE
ANALYSIS
SUMMAR Y
REPORT
CATALOG
DATE
ANALYSIS
SUMMAR Y
05
液相色谱法的优化与注 意事项
实验条件的优化
1 2
流动相的选择
根据分析物的性质选择合适的流动相，如有机溶 剂、缓冲液等，以达到最佳分离效果。
流速的优化
流速对色谱分离效果有重要影响，需根据实际情 况调整流速，以达到最佳分离效果。
3
柱温的优化
柱温会影响物质的吸附和扩散速度，适当提高柱 温可以加快分析速度，但过高的温度可能导致柱 效降低。
液相色谱柱的维护与保养
使用前清洗
新柱子使用前需进行彻底清洗，以去除残留物和 污染物。
使用中维护
使用过程中应定期清洗和再生色谱柱，以保持其 性能和寿命。
储存条件
色谱柱应存放在干燥、避光的地方，避免直接阳 光照射和高温。
反相色谱法
总结词
反相色谱法是利用非极性固定相和极性流动相之间的相互作用来分离物质的分离 模式。
详细描述
反相色谱法中，固定相通常是烷基键合硅胶，流动相则是极性的溶剂，如水、甲 醇等。在分离过程中，非极性或弱极性的组分更容易被固定相吸附，因此会先被 洗脱出来。
离子交换色谱法
总结词
离子交换色谱法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间的相互作用来分离物质的分离模 式。
动相。
流动相的流速和组成对分离效果 也有影响，需根据实际情况调整
。
固定相
固定相是色谱柱中的填料，用于吸附样品中的组分。
常见的固定相有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的固定相。
固定相的粒径和性质对分离效果有影响，粒径越小，性质越均匀，分离效果越好。
第二十章高效液相色谱法
第二十章 高效液相色谱法思考题和习题1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？4．简述反相键合相色谱法的分离机制。
5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别？6．亲合色谱的分离机制是什么？有何特点？7．速率理论方程式在HPLC 中与在GC 中有何异同？如何指导HPLC 实验条件的选择？8．试讨论影响HPLC 分离度的各种因素，如何提高分离度？9．试讨论反相HPLC 的分离条件的选择。
10．在正、反相HPLC 中流动相的强度是否相同？11．什么叫梯度洗脱？它与GC 的程序升温有何异同？12．蒸发光散射检测器的原理及特点是什么？13．常用的HPLC 定量分析方法是什么？哪些方法需要用校正因子校正峰面积？哪些方法可以不用校正因子？14．指出苯、萘、蒽在反相色谱中的洗脱顺序并说明原因。
15．宜用何种HPLC 方法分离下列物质？（1）乙醇和丁醇；（2）Ba 2+和Sr 2+；（3）正戊酸和正丁酸；（4）高摩尔质量的葡糖苷。
16．欲测定二甲苯的混合试样中的对－二甲苯的含量。
称取该试样110.0 mg ，加入对－二甲苯的对照品30.0 mg ，用反相色谱法测定。
加入对照品前后的色谱峰面积(mm 2)值为，对－二甲苯：对A 40.0，'对A 104.2；间－二甲苯：间A 141.8，'间A 156.2。
试计算对－二甲苯的百分含量。
（20.0%）17．计算例2中炔雌醇的校正因子及含量。
（3.02, 0.0369mg/片）18．测定黄芩颗粒中的黄芩素的含量，实验方法同例1。
测得对照品溶液（5.98µg/ml ）和供试品溶液的峰面积分别为：706436和458932，求黄芩颗粒中黄芩素的含量。
（1.55%）19．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g 配成混合溶液。
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第一节 吸附色谱法
(一)常用的吸附剂 吸附剂可分为有机和无机两大类。其中以硅
胶和氧化铝、聚酰胺较为常用。 1.硅胶 2. 氧化铝
第一节 吸附色谱法
1.硅胶 其骨架表面的硅醇基，能吸附大量水分，这
种表面吸附水称为“结合水”，加热至105℃～ 110℃左右能除去，除去的水分越多，吸附能力 越强。
硅胶的活性与含水量有关，“结合水”高达 17%以上时，吸附能力降低。
第一节 吸附色谱法
4 （1
②有些化合物在可见光下不显色，但可吸收紫外光，且 能发射更长波长的光而显示不同颜色的荧光斑点，故 在紫外灯下显现不同颜色。紫外分析仪有短波型 (254nm)和长波型(366nm)两种灯。
③在可见紫外光下都不显色，也没有合适显色方法的化 合物，可以用荧光薄层进行分离。化合物在紫外光灯 下可在发亮的背景上显示暗斑。
预制板是由工厂生产出来的商品板，使用方便，涂 布均匀，薄层光滑，牢固结实，分离效果及重现性好。 品种繁多，规格齐全，能满足不同的分析要求。
第一节 吸附色谱法
2 点样体积：经典薄层一般为1～10μL，高效薄层为
100～500nL； 点样形状：一般为圆形点，点样基线距底边1.0～
1.5cm，样点直径为2～3mm，高效薄层原点直径 约为1mm，要尽可能避免多次点样； 点间距离：可视斑点扩散情况而定。一般经典薄层为 1～2cm，高效薄层为0.5cm； 常用的点样器具：定量毛细管（0.5、1、2、3、4、5和 10μL）和铂铱合金毛细管（100nL和200nL），另 一类是注射器式的可变体积 微量点样器和毫微点样 器，用手工点样时常用定量毛细管。
第一节 吸附色谱法
2. 首先将被分离样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶
剂极性应低，体积要小。 上样前，应将柱上端的溶剂放出至近吸附剂表面。沿
管壁加入样品溶液，溶液加完后，打开活塞使液体慢慢放
在洗脱时，用分液漏斗连续不断地加入洗脱剂，并保 持一定高度的液面。在收集洗脱液时，应采用等份集。 3
可以通过分段收集流出液，采用相应的物理和化学方 法进行检出。常用的检出方法很多，如化学反应法、TLC 及其它方法。
Rf =1，表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶 剂同步移动。
一般要求Rf值在0.2～0.8之间。
第一节 吸附色谱法
影响Rf值最重要的因素是吸附剂的性质与展开 剂的极性和溶解能力。
当应用同一种吸附剂和同一种展开系统时，被
测物质的Rf 1．薄层厚度 2．展开距离 3．展开容器中展开剂蒸气的饱和度 4．点样量 5．薄层含水量
锯齿形扫描方式能消除展开后斑点形状不规则而引 起的误差，可获得满意的定量结果。 ③双波长法扫描
光源的光分两路，通过两个分光器出来两束不同波 长的光。一路用于测量样品，称样品波长λS；另一路 做为对照，称参比波长λR。 双波长法可以消除斑点处薄层本身的干扰，消除薄 层厚度不均匀引起的基线波动，能可靠地检测痕量组分.
第二十章经典液相色谱法
经典液相色谱法
经典液相色谱法包括经典柱色谱法和平面色谱法。 经典色谱法与现代色谱法的区别主要在于输送流动
相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度 和检测灵敏度等方面。 现代色谱法灵敏度高，分离效率高。但经典色谱法 也有许多优点，设备简单，操作方便，分析速度快。
第一节 吸附色谱法
第一节 吸附色谱法
（2 ①喷雾显色 将显色剂用电动薄层喷雾器直接喷洒于硬
板上，根据显色剂的不同，可直接显色或加热显色。 ②浸渍显色 也可用浸渍法处理薄层，使生成颜色稳
定、轮廓清楚、灵敏度高的色斑。利用某些物质的蒸 气与样品作用生成不同颜色或产生荧光，也可用于斑 点的检出。 ③蒸气检出法 多数有机化合物能吸附碘蒸气而显示黄 色斑点。有些化合物遇碘蒸气后发生紫外吸收的变化
第一节 吸附色谱法
2.相对比移值Rst
为了解决由于Rf值重现性差，进行定性困难的
问题，常采用相对比移值Rst来定性。 相对比移值Rst
原点至样品斑点中心 距的 离 Rst 原点至参考物斑点中 的心 距离
Rst值是相对Rf值，是样品与参考物移动距离之
比，可消除许多系统误差。参考物是另外加入也可 以直接以样品中某一组分作为参考物。
第一节 吸附色谱法
（2）定量方法 ①外标法 分为外标一点法和外标二点法。 A 外标一点法
工作曲线通过原点（截距为零） 时可用外标一点法定量，需点一种 浓度的对照品溶液。
C＝F1·A
C为样品的浓度或重量，A为样品的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数
B 外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定
A. 线型 B. 凸型 C.凹型 a. 吸附等温线 b. 相应的洗脱峰型
第一节 吸附色谱法
二、吸附剂 吸附色谱法对吸附剂有下面几点基本要求： ① 有较大的表面积，有足够的吸附能力，但对 不同物质其吸附能力又不一样； ②与洗脱剂、溶剂及样品不起化学反应，并在 所用溶剂和洗脱剂中不溶解； ③ 粒度均匀，粒度要细。
愈高，其吸附活性愈低，活性级数愈大，吸附力就 愈弱。反之亦然，含水量愈低，其活性愈高，活性 级数愈小，吸附力就愈强。
吸附剂使用前必须先经过活化处理。在一定 温度下，加热除去水分以增强活性的过程称之为活 化。反之，加入一定量水分便可使其活性降低，亦
分离极性小的物质，一般选用吸附活性大的吸 附剂，反之，分离极性大的物质则应选用活性小的 吸附剂。
第一节 吸附色谱法
制备含粘合剂的硬板，要先制备固定相的匀浆，调 制固定相的匀浆时可将一定量的固定相按上表比例加入 适量水或粘合剂，在研钵中或在匀浆器中调匀，倒入手 动或自动涂布器中涂布。室温下阴干后，活化后备用。
定性定量分析时薄层厚度为0.3～0.5mm，制备薄 层厚度为0.5～2mm。 （2）预制板
Rst值可以大于1
第一节 吸附色谱法
1．间接定量法 (洗脱测定法) 薄层展开后，将被测物
斑点或区带捕集，用溶剂洗 脱，然后再用适当的分析方 法(比色法、分光光度法、 气相色谱、荧光分析法等)
2．薄层扫描法 该法快速、简便，结果灵敏、准确，适用于多
组分物质和微量组分的定量。 （1）薄层扫描仪
薄层扫描仪光学 系统结构示意图
第一节 吸附色谱法
F
d3
薄层点样示意图
××××××
s1 2s 12
d2
d1
S-对照品溶液； 1.2-样品溶液；×－原点； d1-点间距离；
d2-原点与板底边距离；d3-展距；F-溶剂前沿
第一节 吸附色谱法
3 点样后的薄层，置密闭的玻璃槽中，用合适的
展开剂展开。展开剂浸入薄层下端高度不应超过 0.5cm。点样处不可接触展开剂，展距一般为8～ 15cm。
第一节 吸附色谱法
选择色谱分离条件时， 必须从吸附剂、被分离 物质、流动相（展开剂） 三方面综合考虑。
组分
吸附剂 流动相
极性
活性小
极性
非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性
第一节 吸附色谱法
(一) 1. 色谱柱的制备 (1)玻璃柱 干装法
湿装法 (2) 尼龙柱 用于色谱分离的尼龙柱，应具备下列条件： ①应有一定的强度，且易于切割； ②对有机溶剂呈惰性，且能用手工热封；
对于样品成分复杂的 混合物，可采用双向展开法。
第一节 吸附色谱法
点于同一薄层的同一物质的斑点，在色谱展开 过程中，靠薄层边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点 的Rf值有所不同，此称边缘效应。
第一节 吸附色谱法
为了减少边缘效应，可采取下列办法： (1)最好用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一
定时间，待溶剂蒸汽达到饱和后再行展开； (2)在展开缸内壁贴上浸 湿展开剂的滤纸条； (3)如采用3cm以下的狭 小薄板，只点2～3个点。
第一节 吸附色谱法
五、定性与定量分析 (一) 1.比移值Rf
在薄层色谱法中，常用 比移值Rf来表示各组分在 色谱中的位置。
原点至斑点中心的距离
Rf 原点至溶剂前沿的距离
Байду номын сангаас
Rf与分配系数K及容量因子k之间的关系为：
Rf
1 1 1 K Vs 1 k
Rf值为常数，V其m 值在0～1之间。
Rf =0，表示化合物在薄层上不随溶剂的扩散而移 动，仍在原点位置；
1．线型吸附等温线 是理想的等温线 当吸附平衡常数K一定时，其吸附等温线为
线型，即达到平衡时，组分在固定相中的浓度 Cs与其在流动相中浓度Cm成正比，直线的斜率 为K。
第一节 吸附色谱法
2 在几乎所有的实际情况下，吸附等温线都有
些弯曲而呈非线型。一般液-固吸附色谱系统大 多呈现凸形吸附等温线。
第一节 吸附色谱法
第一节 吸附色谱法
(二)薄层色谱 按薄板的分离效能，可分为经典薄层色谱法(TLC)
及高效薄层色谱法(HPTLC)两类。 薄层色谱有下列一些特点：
(1)展开时间短，一般只需十几分钟到几十分钟； (2)分离能力较强，一块板可分离多达约20个组分； (3)灵敏度高，通常使用的样品量为几至几十微克； (4)显色方便，可直接喷洒腐蚀性的显色剂； (5)所用仪器简单，操作方便； (6)
外标法是更为常用的定量方法。
第一节 吸附色谱法
六、高效薄层色谱(HPTLC) 高效薄层色谱法是在七十年代中期由常规TLC
发展形成的，也称毫微(克)量薄层色谱(nano－ TLC)。
高效薄层色谱法具有快速、高效、灵敏的特点。 高效薄层色谱之所以能达到高效，主要取决于 吸附剂的性能及涂板、点样和展开等微量操作技术。 高效薄层色谱法定量多用薄层扫描法。
第一节 吸附色谱法
硅醇基有两种形式，一种是游离羟基(Ⅰ)，另一
种是键合羟基(Ⅱ)，当硅胶加热到200℃以上时，失
去水分，使表面羟基变为硅醚结构(Ⅲ)，后者为非
极性，不再对极性化合物有选择性保留作用而失去