中国药品检验标准操作规程 版

告菌数。
10.3 培养基稀释法
取低稀释级供试液（原液或 1:10 供试液或其他供试液）2 份，每份各 1ml，分别注入平
皿中（每皿 0.5ml、0.2ml 或＜0.2m1），每 1 个平皿倾注营养琼脂培养基约 15ml，混匀，凝
固后，倒置培养，计数。每份供试液所加注平板点计的菌落之和，即为每 lml 菌落数，共
9.4 验证试验可与供试品的细菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。 9.5 注意事项 99.5.2 黑曲霉菌的菌液制备 将黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，于 20～25℃培养 5～7 天，使大量的孢子产生。加入 3～5ml 含 0.05％（ml／m1）聚山梨酯 80 的 0.9％无菌氯化钠溶液，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱。然后可用一支 l0ml 无菌 球形毛细吸管，其管口用无菌棉花或纱布包扎且能过滤菌丝的装置，吸出孢子悬液至无菌 试管内，将孢子悬液稀释至每毫升含 50～l00cfu。 9.5.4 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物 回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀 释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符 合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是 1 克细菌数不
9.2.2 活菌组 取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。 9.2.3 供试品对照组 取最低稀释级的供试液 1ml，按菌落计数方法测定供试品本底 菌数。 9.2.4 稀释剂对照组 为考察供试液制备过程中对微生物影响的程度，可用相应的稀 释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每 1ml 含 50～l00cfu，按供试品组的供试 液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
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微生物限度检查法
微生物限度检查法 一、细菌、霉菌和酵母菌计数 １ 简述 细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。 也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生 状况的重要手段和依据。 细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一。以在琼 脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反 映在该规定条件下所生长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌 落数。一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试 品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu）。 2 设备、仪器 微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。操 作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。 洁净实验室内 的温度应控制在 18～26℃，相对湿度最好在 40％～60％。操作间安装空气除菌过滤层流装 置。洁净度不应低于 10000 级，局部洁净度为 100 级。操作间或净化工作台的洁净空气应 保持对环境形成正压，不低于 10Pa，操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于 5Pa。 操作间和净化工作台采用沉降菌数测定（Ⅱ法）检测其洁净度，分别应达到 10000 级和 100 级。 在每次操作前、后用 0.1％苯扎溴铵溶液擦拭操作台，然后启动层流净化装置。 吸管、培养皿洗净后用牛皮纸包扎，高压蒸汽 121℃灭菌 30min，烘干备用。 3 培养基制备： 采用干燥培养基，按说明配制，在 2h 内灭菌，避免细菌繁殖。 灭菌后的培养基应保 存在 2～25℃，防止被污染，在 3 周内用毕。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分 散失及染菌。采用微波炉加热熔化琼脂培养基，已熔化的培养基应 8h 内一次用完，剩余培 养基不宜再用。 4 供试品抽样、检验量 采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用量（2 个以上最小包装单位）的 3～5 倍量（以 备复试或留样观察）。所有剂型的检验量均需取自 2 个以上包装单位，固体制剂检验量为 10g。检查沙门菌的供试品，其检验量应增加 20g 或 20ml（其中 10g 或 10ml 用于阳性对照 试验）。
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微生物限度检查法
得过 1000cfu，那么最高稀释级是 1:10–3。 若采用允许的最高稀释级供试液进行验证试验还存在一株或多株试验菌的回收率达不
到要求，那么应选择回收情况最接近要求的方法进行供试品的检测。如某种产品对某试验 菌有较强的抑菌性能，采用薄膜过滤法的回收率为 40％，而采用培养基稀释法的回收率为 30％，那么应选择薄膜过滤法进行Fra Baidu bibliotek供试品的检测。在此情况下，生产单位或研制单位应 根据原辅料的微生物质量、生产工艺及产品特性进行产品的风险评估，以保证检验方法的 可靠性，从而保证产品质量。
菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平
板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影
响微生物生长。取试验用的稀释液 1ml 照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照
不得有菌生长，然后培养和计数。 菌数报告规则：以相当于 1g、1ml 或 10cm2 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长， 以＜1 报告菌数（每张滤膜过滤 1g、1ml 或 10cm2 供试品），或＜1 乘以最低稀释倍数的值报
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微生物限度检查法
5 试验准备 将供试品及所有已灭菌的平皿、试管、吸管（1ml、10m1）、稀释剂等移至洁净实验室 内。开启洁净实验室空气过滤装置工作 30min。紫外灭菌 30min。 6.3 操作人员穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。先用乙醇棉球擦手，再擦拭供试品瓶、 盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。 6 供试液的制备和释稀（10 倍递增稀释法） 取供试品 10g，加 pH7.0 无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液至 100ml 水浴振荡混匀（温度 45%）， 作为 1：10 供试液。用 1 支 1ml 灭菌吸管吸 1:10 均匀供试液 1ml，加入装有 9ml pH7.0 氯 化钠－蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂的试管中，混匀，即得 1:100 供试液。以此类推，根据供 试品污染程度，可稀释至 1:103、1:104 等适宜稀释级。每递增 l 稀释级，必须另换一支吸 管。稀释时，吸管插入第 1 级稀释液内不低于液面 2.5cm，反复吸吹约 10 次，完成后将吸 管放入消毒液缸内。 7 计数方法验证 由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时，可 能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。对各 试验菌的回收率应逐一进行验证。 9.1 验证用菌株大肠埃希菌 Escherichia coli [CMCC(B) 44102]，金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus [CCMCC(B) 26003]，枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis [CMCC(B) 63501]，白色念珠菌 Candida albicans [CMCC(F) 98001]，黑曲霉菌 Aspergillus niger [CMCC(F) 98003]。 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤 培养基中或营养琼脂培养基上，培养 18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培 养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养 24～48h。上述培养物用 0.9％无菌氯化钠溶液制成 每 1ml 含菌数为 50～100cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养 基上，培养 5～7 天，加入 3～5ml 含 0.05％（ml／m1）聚山梨酯 80 的 0.9％无菌氯化钠溶 液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05％（ml／ml） 聚山梨酯 80 的 0.9％无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50～l00cfu 的孢子悬液。 菌悬液制备后，若在室温下放置应在 2h 内使用，若保存在 2～8℃的菌悬液可以在 24 小时内使用。黑曲霉菌的孢子悬液保存在 2～8℃，可在验证过的贮存期内替代对应量的新 鲜孢子悬液使用。
得 2 组数据。以 2 份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
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微生物限度检查法
9.2 验证方法 验证试验分 4 组，至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算供试 品组和对照组试验的菌回收率。
9.2.1 供试品组 取最低稀释级的供试液，按每 1ml 供试液加入 50～l00cfu 试验菌， 按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液各 1ml 分别注入平皿中， 立即倾注琼脂培养基；薄膜过滤法计数时，取供试液 2ml 过滤，冲洗液冲洗，并在最后一 次的冲洗液中加入试验菌。
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微生物限度检查法
受损伤。 取相当于每张滤膜含 1g、1ml 或 10cm2 供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，
过滤。若供试品每 1g、1ml 或 10cm2 所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液 1ml，过
滤。用 pH7.0 无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗后取出滤膜，
10 检查法 10.1 平皿法 供试液 10 倍递增稀释后，从高稀释级至低稀释级吸液时用 1 支吸管吸供试液各 1ml 至 每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注 2～3 个平皿。 待各级稀释液注皿完毕后， 用 1 支 1ml 吸管吸取试验用稀释剂（pH7.0 氯化钠－蛋白胨缓冲液）各 1ml，分别注入 4 个 平皿中。其中 2 个作细菌数阴性对照；另 2 个作霉菌、酵母菌数阴性对照。将预先配制好 的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基熔化，冷至 约 45℃时，倾注，快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，后，盖上平皿盖置操 作平台上待凝。细菌计数平板倒置于 30～35℃培养箱中培养 3 天。霉菌、酵母菌计数平板 倒置于 23～28℃培养箱中培养 5 天。逐日观察菌落生长情况，从平板的背面直接以肉眼点 计菌落数。 菌数报告规则：宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于 300cfu、霉菌菌落数平均数小于 100cfu 的平板计数作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。 当仅有 1 个稀释级的菌落数符合上 述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数；当有 2 个或 2 个以上稀释剂的菌落 数符合上述规定，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数值的值报告。如各稀释级的平板均无 菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均茵落数小于 1 时，以小于 1 乘以最 低稀释倍数报告菌数。 10.3 薄膜过滤法 薄膜过滤法主要起到富集微生物、分离去除样品中对微生物生长产生干扰的因素的作 用，可以有效提高检查结果的灵敏度和可靠性。采用不同直径的滤膜，冲洗量应进行相应 的调整。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗 液过滤以润湿滤膜。供试液经薄膜过滤后，用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超 过 100ml，总冲洗量不得超过 1000ml；避免大体积、过高流速的冲洗造成滤膜上的微生物
供试品组的菌回收率 (%) 供试品组平均菌落数 空白组平均菌落数 100% 活菌组平均菌落数
对照组的菌回收率 (%) 对照组平均菌落数 100% 活菌组平均菌落数
9.3 结果判定对照组的菌回收率均应不低于 70％。若供试品组的菌回收率均不低于 70％，则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任 一次试验中供试品组的菌回收率低于 70％，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并 重新验证。