免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术是一项转化细胞学的发展技术，其核心理念是运用免疫细胞化学方法，通过使用抗体和染色试剂对细胞内物质（如蛋白质、激素和极性细胞分子）进行细胞定位。
免疫细胞化学技术可以用来研究非常不同的生物学过程，例如调节细胞凋亡和增殖，诊断疾病和研究最新的蛋白调控理论。
给定一些抗体和染色试剂，免疫细胞化学技术可以在实验室中创建复杂的模拟条件，以识别和检测细胞内的特定活性分子。
此外，它还可以根据其特定结构，从细胞膜上提取出已知和未知的蛋白分子，以有效揭示细胞功能全貌。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫荧光细胞化学技术
免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术就像是细胞世界里的一场绚丽灯光秀。
想象一下，细胞们不再是那些只能在显微镜下灰扑扑地被观察的小不点，而是摇身一变成为舞台上闪耀的明星。
这个技术就像是给细胞们穿上了五彩斑斓的荧光衣裳。
那些抗体就如同超级精确的裁缝，专门为细胞量身定制“荧光服饰”。
它们能精准地找到细胞上特定的蛋白质分子，就像最厉害的寻宝猎人，在细胞这个大迷宫里一下子就能锁定目标。
如果把细胞比作一个装满各种小物件的大盒子，免疫荧光细胞化学技术就是那盏超级亮的手电筒，一下子就能照出我们想要找到的特定小物件（也就是特定的蛋白）。
而且这个“手电筒”还特别炫酷，发出的是五颜六色的荧光。
它的检测过程就像是一场神秘的魔法仪式。
各种试剂在细胞周围穿梭，就像一群忙碌的小精灵，在为细胞打造独特的荧光效果。
有时候感觉那些荧光标记就像是细胞的秘密纹身，只不过这个纹身是为了让科学家们更好地了解细胞的秘密。
当我们在显微镜下看到被标记后的细胞时，那简直就像是看到了一个微观的梦幻星球。
那些发着荧光的细胞结构就像星球上独特的地貌，有明亮的山脉（可能是细胞膜），有闪烁的湖泊（或许是细胞质中的某些结构）。
这个技术还特别爱搞“微观cosplay”呢。
它能把细胞模仿成我们想要研究的各种状态，通过荧光标记的变化，就像细胞在说：“看，我现在是生病的状态啦”或者“我现在正在努力分裂繁殖呢”。
要是细胞会说话，它们肯定会对免疫荧光细胞化学技术又爱又恨。
爱的是它们可以借此展示自己独特的魅力，恨的是自己的小秘密都被这个技术暴露无遗。
在科学研究的大舞台上，免疫荧光细胞化学技术就像一个多才多艺的明星。
它既可以在基础医学研究里当主角，帮我们弄清楚细胞的正常生理机能；又能在疾病研究中大展身手，就像一个超级侦探，追踪那些病变细胞的蛛丝马迹。
不过这个技术有时候也有点小脾气。
如果操作不当，就像一个被打乱节奏的乐队，整个荧光标记就会乱套，给研究者们带来一堆头疼的问题。
(整理)免疫组化知识
免疫组织化免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
1．发展简史——1941年Coons首先用荧光素标记抗体一检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。
——70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
——80年代Hsu等建立了抗生物素一生素（ABC）法之后，免疫金一银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
2．免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成：①贴片染色；②漂浮染色。
（2）根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法；②间接法；③多层法。
（3）按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）；②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）；③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。
3．标记物（1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damineRB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
③生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。
其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4．应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
免疫细胞化学染色法的原理
免疫细胞化学染色法的原理免疫细胞化学染色法是一种常用的实验技术，用于检测细胞中特定蛋白质的存在和定位。
其原理基于免疫学和细胞生物学的知识，可以通过以下步骤来解释：1. 抗原抗体反应，首先，我们需要选择一个特定的抗体，该抗体能够与我们感兴趣的蛋白质（即抗原）发生特异性的结合。
这个抗体可以是由动物免疫产生的多克隆抗体或单克隆抗体，也可以是经过重组技术获得的单克隆抗体。
2. 细胞固定，接下来，我们需要将待染色的细胞固定在载玻片上，通常使用甲醛或乙醛进行固定。
固定可以保持细胞的形态结构和蛋白质的空间位置。
3. 渗透化处理，为了使抗体能够渗透到细胞内部，我们需要对细胞进行渗透化处理。
一般常用的方法是使用洗涤剂（如TritonX-100）或酸性溶液（如盐酸）来破坏细胞膜，使抗体能够穿过细胞膜进入细胞内。
4. 抗体结合，将选择的抗体加入到载玻片上的细胞上，抗体会与细胞内的特定抗原结合。
这种抗原-抗体的特异性结合可以帮助我们检测和定位感兴趣的蛋白质。
5. 二抗结合，由于直接观察抗原-抗体结合并不容易，我们需要使用一个与第一抗体结合的二抗体。
这个二抗体通常是由动物免疫产生的，可以与多种不同种类的抗体结合。
二抗体通常被标记上一种可视化信号，如荧光染料或酶标记物。
6. 可视化信号检测，根据实验需要，我们可以选择不同的方法来检测二抗体的存在。
如果使用的是荧光染料，我们可以使用荧光显微镜来观察染色结果。
如果使用的是酶标记物，我们可以添加适当的底物，使其产生可见的色素反应。
通过以上步骤，免疫细胞化学染色法可以帮助我们检测和定位细胞中特定蛋白质的存在。
这种方法在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域具有广泛的应用。
4.免疫电镜细胞化学技术
2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。 冰冻切片 8µm ，震动切片20～80µm。
用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂 块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收， 浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察
。
3、假复型技术：
琼脂或琼脂糖表面上粘附的病毒颗粒，以假复型的 形式转移到火棉胶膜上或Formvar膜上。 此种方法：能去除标本中的盐分、浓缩病毒；减少不 必要的杂质；比较费时。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固 定0.5～1h），制成厚切片。 ② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次15min。 ③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
免疫电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合 产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。
目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞 超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核 酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物 质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与 功能的相互关系。
基本原理：
铁蛋白是一种直径10～12nm的球形的蛋白质（分 子量450kD）,它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm ），该核心含2000～5000个铁原子，分布于四个区域 ，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此 可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联 剂形成抗体-铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免 疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核 心，便于电镜观察。
免疫细胞化学实验技能总结概要
透明
置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用； 二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能 和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才
能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；
其最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在 其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的 组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不 宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对
粘膜有刺激作用。
浸蜡
（1）浸蜡的目的 置换组织中的透明剂，为包埋做准备。 （2）注意事项 温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能 超过60℃；浸蜡时间不宜过长。 浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆 变。
价格昂 贵；有 毒
混合固定剂 （1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快， 组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度， 对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，
固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度
酒精也可洗去黄色。 （2）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、 粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。 （3）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好， 固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定 时间较长对组织亦无损害。
(horseradish peroxidase)等。
标记同位素的称为 放射免疫法 ，常用的同位素有 3H 、
14C、32S和31P等。
讲解提纲
一、石蜡切片/冰冻切片
二、免疫酶/免疫荧光 三、酶联免疫吸附试验
（1）石蜡切片的制作
取材、固定 洗涤 酒精脱水
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
免疫组织化学、免疫荧光染色
免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光染色（Immunofluorescence，简称IF）是两种常用的免疫细胞化学技术，用于在组织切片或细胞涂片上检测特定蛋白质或抗原的存在和分布。
这两种技术都依赖于抗体与抗原之间的特异性结合反应。
免疫组织化学是一种使用酶标记抗体来检测抗原的方法。
在这个过程中，首先将组织切片与特定的初级抗体（针对目标抗原的抗体）孵育，然后洗涤以去除未结合的抗体。
接下来，将切片与带有酶标记的次级抗体（针对初级抗体的抗体）孵育。
再次洗涤后，加入酶的底物，它会在酶的作用下产生颜色沉淀，使得抗原的位置在显微镜下可见。
常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。
这种方法的优点是可以产生永久性的记录，因为颜色沉淀是稳定的。
免疫荧光染色则涉及使用荧光染料标记的抗体来检测抗原。
在这个过程中，初级抗体和次级抗体都带有荧光标记。
当这些抗体与抗原结合时，它们发出的荧光可以在荧光显微镜下观察到。
这种方法的优点是可以同时使用多种颜色的荧光染料来检测多个不同的抗原，而且荧光信号通常比免疫组织化学的颜色反应更强。
两种技术都有其应用范围。
免疫组织化学常用于病理学诊断，因为它可以用于存档的组织样本，并且结果可以用常规显微镜观察。
而免疫荧光染色则更适合于研究目的，特别是在活细胞成像和多标记实验中，因为它可以提供更丰富的信息和更高的灵敏度。
总之，免疫组织化学和免疫荧光染色都是强大的工具，它们使得科学家能够在细胞和组织水平上可视化蛋白质的表达和定位。
选择哪种技术取决于实验的具体需求和可用的设备。
免疫细胞化学步骤及说明
1. 细胞爬片制备盖玻片在75%酒精浸泡24h以上，超净台内酒精灯上烤干。
六孔板内分别滴入一滴培养液，盖上盖玻片。
分别加入等量细胞，常规培养至细胞70%左右融合。
关于盖玻片的准备，有很多种说法，但我的做法比较简单，这样做不会脱片，也不影响观察。
2. 细胞固定6孔板置冰上冷却，吸尽培养液。
4℃PBS，洗5min×3次。
吸去残留PBS，空气干燥，细胞面微潮湿时，加入预冷95%酒精固定液，浸没细胞面，更换预冷95%酒精2次，第三次在-20℃静置20min。
这一步用4%多聚甲醛可能更省时省事。
3. SP法免疫组化染色步骤(1)细胞爬片蒸馏水洗5min×1次，PBS浸泡5min。
固定之后的细胞一般不会脱落，可以放在摇床上洗。
(2)滴加3%H2O2去离子水，室温孵育30min。
PBS洗5min×3次。
(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸馏水稀释）通透30min。
PBS洗5min×3次。
细胞通透很重要，因为蛋白在胞内，我第一次做时没有通透，结果什么都没有。
(4)BSA封闭，室温10min。
倾去，勿洗。
(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4℃过夜。
PBS洗5min×3次。
抗体的浓度是自己摸索出来的，还有听说4℃过夜是比较合适的做法。
(6)滴加二抗(聚合HRP标记抗小鼠IgG)，室温30min。
PBS洗5min×3次。
(7)按1mL蒸馏水+A、B、C（DAB试剂盒，要按顺序滴加）各一滴，混匀，镜下显色观察，注意避光。
蒸馏水充分冲洗。
(8)苏木素染2min。
自来水充分冲洗。
(9)依次在75%→85%→95%→100%浓度酒精中浸泡2min脱水。
封片之前常规有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子变得很脏，不知什么原因。
后来就不加了，直接脱水后封片，现在看来片子还不错啊。
而且二甲苯太呛人了。
(10)中性树胶封片。
免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术免疫细胞化学，与免疫组织化学（Immunohistochemistry）相同，它是组织化学的分支，它是用标志的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的散布进行组织和细胞原位检测技术。
免疫组化，是应用免疫学基根源理——抗原抗体反响，即抗原与抗体特异性联合的原理，经过化学反响使标志抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确立组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
抗原和抗体的要求·拥有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
–抗衡体的要求：纯度高、比活性强；·高度特异性抗体的获取，取决于抗原的纯度。
–抗衡原的要求：纯度高，免疫原性强，稳固无变化。
抗原(antigen,Ag)·抗原的观点：凡是在机体内惹起体液免疫和(或)细胞免疫反响的物质，称为抗原。
抗原拥有两个方面的特征：–免疫原性：惹起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特征；–免疫反响性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的联合或反响的特征。
·依据抗原能否显示免疫原性分为：–完整抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并拥有较复杂的化学构成。
·免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必要和蛋白质及多糖形成复合物才拥有优秀的免疫原性。
–半抗原：又称为不完整抗原，分子量较小。
比如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
·半抗原必要与载体联合，才能获取免疫原性。
载体·往常是拥有高度免疫原性的大分子物质，拥有将免疫原性传达给耦联的半抗原能力。
–常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA) 、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
免疫细胞化学染色鉴定
免疫细胞化学染色鉴定
免疫细胞化学染色是一种用于鉴定和定量特定细胞类型或蛋白质表达的方法。
它可以帮助科学家和医生确定组织或细胞样本中特定免疫细胞的存在和分布情况，以及这些细胞中特定蛋白质的表达水平。
在免疫细胞化学染色中，通常会使用特定抗体来与目标蛋白质结合，然后通过染色试剂使这种结合可见。
这种方法可以通过显微镜观察细胞或组织样本，并根据染色的强度和位置来确定目标蛋白质的表达情况。
免疫细胞化学染色的过程包括样本制备、抗体处理、染色和显微镜观察。
在样本制备阶段，组织样本通常需要被固定、切片和固定在载玻片上。
接下来，样本会被暴露在特定的抗体溶液中，抗体会与目标蛋白质结合。
随后，样本会经过染色试剂的处理，使得目标蛋白质呈现出可见的颜色或信号。
最后，样本会被放置在显微镜下观察和分析。
免疫细胞化学染色在医学诊断和科学研究中具有广泛的应用。
它可以帮助医生诊断肿瘤、炎症和感染疾病，也可以帮助科学家研
究免疫系统的功能和疾病机制。
通过对免疫细胞化学染色结果的分析，人们可以更好地理解细胞和组织中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病诊断和治疗提供重要信息。
总之，免疫细胞化学染色是一种重要的实验技术，它通过特定抗体的使用和染色试剂的处理，帮助科学家和医生鉴定和定量特定细胞类型或蛋白质表达，为医学诊断和科学研究提供重要的帮助。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
免疫组织化学(immunohistochemistry)，也称免疫细胞化学(immunocytochemistry)，是由免疫学和传统的组织化学方法相结合发展形成的研究方法，能定位、定性或定量检测组织切片上的特殊蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体、病原体等。
利用抗原与抗体能特异性结合的原理，用标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的特定抗原(或抗体)结合，形成带有标记物的抗原抗体复合物。
通过普通显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察标记物，从而证明这些抗体或抗原物质在组织细胞内的分布。
根据标记物的不同，免疫组织化学染色可分为免疫荧光组织化学技术、免疫酶组织化学技术、亲和免疫组织化学技术、免疫金银及铁蛋白标记技术等。
免疫组织化学方法将形态学改变与功能和代谢结合起来，既保持了传统形态学对组织和细胞的客观、细致形态观察的优点，又克服了生物化学、免疫学反应只能定性和定量不能定位的缺点，已成为生物医学各学科领域的重要研究手段。
在生物学、医学等领域的研究和诊断中日以显出巨大的实用价值，尤其在肿瘤病理学中已成为常规的诊断方法。
标记在抗体上的荧光素
荧光素标记的羊抗兔IgG (间接荧光抗体)
兔抗人角蛋白的IgG(特异性抗体)
人组织细胞中的抗原(如角蛋白)
直接法间接法
免疫荧光组织化学方法示意图
组织切片的免疫酶组织化学染色培养细胞的亲和免疫组织化学染色
免疫荧光染色免疫荧光染色
(兰色为细胞核，红色为角蛋白) (兰色为细胞核，绿色为上皮膜抗原)。
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免疫细胞化学技术免疫细胞化学，与免疫组织化学（Immunohistochemistry）相同，它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
抗原和抗体的要求·具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
–对抗体的要求：纯度高、比活性强；·高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
–对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
抗原(antigen, Ag)·抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。
抗原具有两个方面的特性：–免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；–免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
·根据抗原是否显示免疫原性分为：–完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
·免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
–半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。
例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
·半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载体·通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
–常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
–用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。
结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体(antibody, Ab)1、抗体的概念：免疫球蛋白·机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
–抗体主要存在于血清内；–抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
–免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
·单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
–特异性强、抗体产量高。
·多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
–特异性低，会产生抗体的交叉反应。
–多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
–抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备·动物的选择·佐剂(adjuvant)·免疫方法·免疫剂量·抗体效价的测定·放血或定期抽血(1) 动物的选择选择什么动物来免疫取决于：·所需抗血清的量–小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
·能供免疫用的抗原量–小鼠50 g足够，而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择(续)·动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
–例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
–常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。
(2) 佐剂(adjuvant)·一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。
佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。
因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
·最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:–弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)–弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant, FIA)·是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
·使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant, FCA)·在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。
·免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。
–一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法·研磨法：适于制备大量的佐剂抗原–先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
–按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。
滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
·缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法(续)·注射器混合法–将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
·优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
·缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法(续)·快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
–将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
–每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右。
反复乳化3～4次即可完全乳化。
管内残余量800r/min离心5～10min收集。
·优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定·判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
(3) 免疫方法——免疫途径·常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
·一般采用多点注射方法–常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
–皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
(3) 免疫方法——免疫途径(续)·几点说明：–大动物一般不用腹腔注射–颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射–抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100 g抗原即可获得较好的免疫效果。
–皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
(3) 免疫方法——次数及间隔时间·次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)–首次注射后，10～15天再加强注射；–剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
·间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长–豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；–第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫·初次免疫–用50～200 g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；·两周后，加强免疫–将50～200 g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；·抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血–抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。
前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔·一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔–先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；– 10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；–以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50 g；–末次注射两周后兔耳放血测价(可达1:128)。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫·初次免疫–用10～100 g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点0.lml，也可肌肉内或皮下注射；·加强免疫–每隔7～8天，将10～50 g Ag于PBS或FIA中。
在肌肉、皮下或静脉注射；·抗体效价的检测(4) 免疫剂量·抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；·免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
(4) 免疫剂量(续)·各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量(5) 抗体效价的检测多采免疫双向扩散法【基本原理】·指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
–将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
·优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤·将玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
·将l % agar 融化后，置56 C水浴。
·在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径3rnm)，孔间距10mm。
·中心孔加5 l 抗原样品，周围孔内每孔加5 l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。
·凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
·观察结果。
抗体效价检测的其它方法·环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；·对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；·酶联免疫吸附试验(ELISA)。
(6) 放血或定期抽血常用以下3种方法·颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。
例如：2.5kg白兔可放血约80ml。
家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
·心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
·静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。