免疫组织化学及HE染色实验步骤教学文案

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HE染色与免疫组化

HE染色与免疫组化实验步骤：1)取材与固定用小号解剖针挑取一定量本室培养之成螨，雌雄各半，用PBS洗去培养物后用擦镜纸包裹，常温浸没于Bouin固定液中24小时。

2)盐酸预处理固定后的粉尘螨以PBS清洗后挑入4％的盐酸溶液中浸泡半小时。

3)琼脂预包埋A.配臵 1.5％琼脂溶液，微波炉中加热至完全溶解，稍冷却后注入自制包埋器。

B.将盐酸处理后的粉尘螨以PBS清洗后挑入琼脂溶液中，让其自然凝固。

C.解剖镜下修整琼脂块，形成边长与虫体对称轴相一致的长方体，虫体位于琼脂块中央。

4) 脱水、透明与浸蜡A.将预包埋的尘螨臵于50％乙醇中2小时（中间换液一次），然后臵于70％乙醇中室温过夜。

B.第二天取出后依次入梯度乙醇脱水并以二甲苯透明：80％乙醇I（1小时）80％乙醇II（1小时）95％乙醇I（30分钟）95％乙醇II（30分钟）100%乙醇I（15分钟）100%乙醇II（15分钟）乙醇：二甲苯（1：1）混合液（10分钟）二甲苯I、II透明（共约15分钟）镜下观察至虫体透明即可终止c．将经透明的琼脂块取出，按如下流程浸蜡：二甲苯：塑化石蜡（1：1）混合液（10分钟）塑化石蜡I、II、III（各一小时）5) 塑化石蜡包埋折叠大小适中的纸盒进行包埋。

用镊子轻轻夹取琼脂块，臵于纸盒底部并注满石蜡。

解剖镜下迅速摆正琼脂块的位臵，以便准确选取不同的方向进行切片。

待蜡块表面稍凝固后，连同纸盒一起沉入水中，使其迅速冷却。

6) 切片与展片先对蜡块进行修整，使其边与琼脂块的边相平行。

使用手摇轮转式切片机，调整切片厚度为4-6μm，连续切片。

将恒温水浴箱加热至45℃左右，同时将已包被Poly-L-lysine的载玻片预热。

在载玻片上滴加少许温水，截取适当长度的蜡带，在载玻片上进行展片。

晾干后臵于60℃烤箱中2小时，使蜡带贴附牢固。

7) HE染色按常规方法进行染色。

由于尘螨体积微小，在染色过程中容易掉片，而且各组织嗜染性不同，故在试验中对各步骤进行了一些调整，获得较满意的效果。

免疫组织化学及HE染色实验步骤

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。

免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。

HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。

下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。

1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。

固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。

2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。

切片厚度一般为3-5微米。

3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。

4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。

修复液的选择和具体实验要求有关。

5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。

6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。

根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。

7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。

8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。

常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。

9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。

HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。

2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。

切片厚度一般为3-5微米。

3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。

4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。

5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。

免疫组织化学染色实验步骤

免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。

主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。

器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。

设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。

2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。

通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。

固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。

切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。

3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。

选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。

之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。

5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。

封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。

6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。

抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。

覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。

7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。

洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。

8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。

二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。

孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。

9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。

洗涤操作与步骤7相同。

10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。

免疫组织化学及HE染色实验步骤复习过程

免疫组织化学及H E 染色实验步骤免疫组织化学（ immunohistochemistry）1组织脱水、包埋及切片（1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月；（2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—二甲苯浸泡30min—二甲苯浸泡30min；（3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜；（4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块；（5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5µm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。

2免疫组化染色（1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯浸泡10min—二甲苯浸泡10min—无水乙醇浸泡5min—无水乙醇浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min；（2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min；（3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min；（4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h；（5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜；（6）将组织切片从冰箱中取出，放于室温静置至室温，用PBS摇床清洗3次，每次10min，用5%山羊血清稀释生物素标记的二抗覆盖组织表面，室温孵育45min，PBS 摇床洗3次，每次10min；（7）组织表面滴加适量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min；（8）DAB显色：配制DAB显色液，滴加至组织表面，在显微镜下观察着色，待出现明显棕色且背景无明显着色时放于自来水中终止显色；（9）苏木素染核1-2min，用自来水冲洗终止染色；（10）将组织依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇各5min，再放入二甲苯10min，二甲苯 10min，完成组织脱水和透明；（11）滴加一滴中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。

免疫组组织化学染色操作过程

1.接蒸馏水1L2.PBST配置：PBS ：Tween20=1000：1 （PBS 2000mL-其中用1000mL配PBST）3.30%的过氧化氢配成3%的过氧化氢(200ml）4.配DAB 第二天配(1滴:1000ul)5.一抗稀释（当天用当天配）第一天1．烤片：石蜡切片，烘烤箱内60度，3到5小时（目的使组织与玻片牢固结合）2．脱蜡：二甲苯(10min×3)3．复水：无水乙醇5min×3，然后95%，75%，50%乙醇各5min。

(目的是利用乙醇的双溶性，使得切片跟后续的水溶性实验体系相容）4．自来水冲洗5min，蒸馏水浸泡5min5．抗原修复：热修复（目的是将抗原表位暴露，使得后续的一抗可以结合上去）。

①配置修复液：修复液主要有柠檬酸钠缓冲液（pH=6.0），EDTA（pH=8.0）和TE（pH=9.0）三种，其酸碱度不同，不同抗体的要求不同，要根据抗体和试剂的说明书来配；②高压锅：半锅抗原修复液，蒸汽鸣笛开始算时间，进行3min，5mim，10min，15min进行摸索时间（如果是电热锅从沸腾开始算时间，修复时间要久一些）。

煮完自然冷却。

6.洗涤：①蒸馏水5min，②PBST：3min × 2 ③ PBS：3min× 17.免疫组化笔画圈：切片置于湿润操作盒上。

（若要破膜的话，移液枪滴0.3%Triton溶液于标本上45min）8.淬灭（阻断）:（目的去除内源性过氧化物酶），30%过氧化氢加蒸馏水配成3%溶液，切片浸泡15min。

9.洗涤：①PBST：3min × 2 ② PBS：3min× 110.生物素阻断，依次滴A，B剂切片浸泡，各10min，依次洗涤：①PBST：5min × 2 ，②PBS：5min× 111．封闭（目的为了减少二抗与组织的非特异蛋白结合，需用二抗来源的血清进行封闭）。

羊血清，移液枪。

HE染色加免疫组化方法

HE染色加免疫组化方法组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。

固定时间以12-24h为宜。

（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min, 无水乙醇Ⅱ30min。

可将组织放于70%酒精中过夜。

5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。

6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。

先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。

（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。

7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。

（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。

一般切片厚度为4-6μm。

贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。

做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。

HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。

免疫组织化学及HE染色实验步骤

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。

本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。

IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。

可以选择使用高温或酶解等方法。

3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。

4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。

5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。

6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。

7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。

8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。

HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。

3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。

4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。

5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。

6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。

7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。

8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。

以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。

通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。

免疫组化HE染色步骤

免疫组化HE染色步骤免疫组化和HE染色是在病理学中常用的技术，用于对组织样本进行分析和诊断。

下面将详细介绍免疫组化和HE染色的步骤。

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织样本中特定抗原的技术。

它可以用于确定细胞或组织中特定蛋白质的位置和表达水平。

免疫组化主要包含以下步骤：1.取得组织样本：首先需要从患者的切除组织或活检组织中获取样本。

样本通常以固定和包埋的形式保存在蜡块中。

2. 切片：将蜡块切割成非常薄的切片（通常为4-5um）。

这些切片通常被放置在载玻片上。

3.去蜡和脱水：跳过这一步，因为该步主要是用于从蜡中去除组织样本。

已经固定在切片上的组织样本无需这一步。

4.抗原检出：在这一步中，需要使用一种抗体来标记想要检测的抗原。

这个抗体会与目标蛋白质结合，并形成一种可以用来检测的复合物。

5.清洗：使用缓冲液对切片上的抗体复合物进行清洗，以去除未结合的抗体。

6.显色：在这一步中，需要使用一种可独特识别的物质来标记已结合的抗体。

典型的显色素有DAB、VIP等。

7.顶气及封片：使用适当的溶剂和覆盖剂对切片进行顶气和封片，以保护其结构并使其可供观察。

通过观察组织样本中的抗原的显色情况，可以确定抗原在组织中的分布和表达水平。

免疫组化广泛应用于病理学诊断中，可以帮助医生进行肿瘤分类、病理分级以及预后评估等。

HE染色（Hematoxylin and Eosin staining）是一种常用的组织染色技术，主要用于病理学的初步观察和诊断。

HE染色主要包含以下步骤：1.取得组织样本：与免疫组化相同，首先需要从患者的切除组织或活检组织中获取样本。

样本通常以固定和包埋的形式保存在蜡块中。

2. 切片：将蜡块切割成非常薄的切片（通常为4-5um）。

这些切片通常被放置在载玻片上。

3.去蜡和脱水：类似于免疫组化，这一步主要用于从蜡中去除组织样本。

4.染色：在这一步中，使用两种染色剂：血红素和紫杉醇。

免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤

免疫组化之组织处理、切片和染色实验技术步骤展开全文1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。

如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。

1) 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm× 0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。

固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。

从而完好的保存抗原和组织细胞形态。

对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h 内，一般固定时间不应超过24小时。

随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。

2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。

掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh×3次，二甲苯透明lh×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。

免疫组织化学染色技术演示文稿

以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为 -D- 葡萄糖 67mg 、 NBT 6.7mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazine methyl-sulfate) 0.167mg、
0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml，37ºC孵育1小时，生成蓝色不溶性沉淀物，该终产物不溶于有机溶剂，切片可经脱水、透明后封片，长期保存。
同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原
异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原
第8页，共92页。
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋
巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白，称为抗体。
大部分抗体电泳后位于区带，1972年国际免疫学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序
1抗孵育切片或细胞涂片
2抗（酶标抗体）孵育切
片发色剂显色（核复染）
第12页，共92页。
（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）
HRP + H2O2
HRP ·H2O2 + DH2
第18页，共92页。
尸检组织
由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同程度自溶，其抗原或变性消失或有严重的弥散现象。法医尸检一般多在24小时以上，甚至数月后，检材受死后变化影响严重，而影响染色结果。手术切除的组织较新鲜，取材后应立即固定，以保存组织结构和抗原。

免疫组化HE染色步骤

骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。

2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。

4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。

5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。

6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。

7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。

免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。

2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min)。

3.PBS冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min,自然冷却至室温。

5.PBS冲洗3次，每次5min。

6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。

7.PBS冲洗3次，每次5min。

8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。

10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。

11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。

12.DAB显色5min。

13.自来水冲洗10min。

14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。

15.自来水冲洗10min。

16.常规脱水，透明，封片，镜检。

HE染色试验技术及注意事项

HE染色试验技术及注意事项HE染色是一种常用的细胞和组织染色技术，被广泛应用于组织学、病理学以及生物学研究中。

本文将介绍HE染色试验的技术步骤和注意事项。

1.取得组织标本：首先需要取得待染色的组织标本。

一般情况下，可选择人体组织或动物组织。

组织标本应尽可能新鲜，并采用适当的方法进行保存。

2.固定组织标本：将组织标本固定在染色盘或载玻片上，以便后续的染色过程。

一般可选择使用福尔马林等化学物质进行固定，固定时间根据组织类型和标本大小而有所差异。

3.脱水：将固定的组织标本逐渐脱水，以去除组织中的水分。

这一步骤可以通过使用乙醇或异丙醇等溶剂进行。

4.渗透：在脱水之后，组织标本需要通过将其浸入合适的介质中进行渗透。

一般可使用有机溶剂，如丙酮或二甲苯。

5.制片：将渗透的组织放置在试管或盛有液体的容器中，然后将其切割成较薄的切片。

切片的厚度一般为3-5微米。

切片可以使用组织切割机或手工切片进行。

6.上染剂：将切片放入HE染色试剂中，浸泡一定时间以完成染色。

HE染色试剂主要由酸性染料和碱性染料组成，其中酸性染料为苏木精，碱性染料为伊红。

7.清洗：用去离子水或蒸馏水轻轻冲洗染色后的切片，以清除未结合的染色剂。

8.脱水：将染色后的切片通过逐渐浸入不同浓度的醇溶液中进行脱水，去除多余的水分。

9.透明化：使用透明介质，如柳酮或醋酸酯，使切片透明并保护其结构。

10.固定封片：将透明的切片放置在载玻片上，涂上适当的封片胶固定。

然后将载玻片放至烘箱中，进行封片胶的固化。

1.样本的存放：取得的组织标本必须及时固定和保存，以避免样本的腐败和变形。

2.染色时间控制：染色时间的长短会影响到最终染色结果的清晰度。

过长或过短的染色时间都会导致结果模糊不清。

3.清洗彻底：在清洗环节，要确保切片上的染色剂完全被清洗干净，以避免染色剂残留影响结果。

4.切片的薄度：切片的厚度直接影响到染色结果的清晰度和质量，因此需要掌握好切片的技巧和标本的处理。

免疫组织化学及HE染色实验步骤

免疫组织化学及HE染色实验步骤1.取得组织标本：首先需要从患者或动物身上获得组织标本。

在手术过程中或尸检后，将组织标本取出并固定。

2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，常用的固定剂有10%的中性缓冲甲醛。

需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。

3.嵌入和切片：将固定处理后的组织标本进行脱水和透明处理，然后用蜡块将其嵌入。

嵌入后的标本可以使用旋转式微切机进行切片，切片厚度通常为4-6微米。

4.脱蜡：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。

5.抗原检出：用特异性抗体结合试剂来检测组织中的特定抗原。

将切片在温床上恢复，然后用蛋白酶消化膜蛋白，以增强抗原的敏感性。

之后，使用特定的一抗（主抗体）与待检测的抗原结合，形成特异性抗原-抗体复合物。

6.二抗检出：使用特异性标记的二抗来检测抗原-抗体复合物。

通常，二抗为小鼠单克隆抗体，与抗体结合后，可通过酶标记法、光学染色或荧光染色等方法来检测二抗信号。

7.显色和镜检：通过给予染色剂，如DAB和H2O2溶液，产生可见的显色反应。

显色后的标本可以用显微镜进行观察和评估。

HE染色实验步骤：1.取得组织标本：与免疫组织化学实验类似，首先需要从患者或动物身上获得组织标本。

2.标本处理：将取出的组织标本进行固定处理，使用10%的中性缓冲甲醛溶液进行固定。

需要将标本完全浸泡在固定液中，并确保标本完整。

3.组织处理：将固定处理后的组织标本进行脱水，以至能够与石蜡亲和。

4.嵌入和切片：将脱水的组织标本注入熔化的石蜡中，以便于嵌入。

然后，使用旋转式微切机将嵌入后的标本切为薄片，厚度通常为4-6微米。

5. 脱蜡和染色：将蜡包围的组织切片放入脱蜡剂中，蜡会被溶解并去除，以使细胞可被染色剂染色。

接下来，将切片放入hematoxylin染色剂中，染出细胞核的蓝色。

6. 酸性染色：将切片转移到eosin染色剂中，以染出细胞质和胞外基质的红色。

7.脱水和渗透：将染色后的切片依次浸泡在动物级乙醇溶液中，然后放入橄榄油中进行清晰度处理。

免疫组织化学染色步骤

免疫组织化学染色步骤免疫组织化学染色（IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法。

该技术广泛应用于医学研究和临床诊断中，可以帮助医生确定肿瘤类型、评估疾病进展和预测患者预后。

本文将介绍IHC的步骤和其原理。

IHC步骤：1. 取得组织样本：将需要检测的组织切片取出，并进行脱水、脱脂和固定处理。

2. 制备切片：将处理后的组织样本切成薄片，并将其放置在载玻片上。

3. 抗体染色：将需要检测的抗体与组织样本接触，使其结合。

4. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的抗体。

5. 二抗染色：将特异性二抗与已结合的第一抗体结合。

6. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的二抗。

7. 标记染色：将标记物与已结合的二抗结合，例如使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。

8. 洗涤：将切片在洗涤缓冲液中清洗，去除未结合的标记物。

9. 显色：加入染色剂使标记物呈现颜色。

10. 封片：将切片加入封片剂中，封闭切片，并进行显微镜检查。

IHC原理：IHC的原理基于抗体-抗原结合反应。

当抗体与特定蛋白质结合时，可以使用二抗与已结合的第一抗体结合，二抗带有标记物，可以让我们对这些特定蛋白质进行检测。

标记物常用的有HRP、AP等，它们可以被染色剂显色使得特定蛋白质呈现颜色。

需要注意的是，IHC检测的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、染色剂的选择等。

因此，在进行IHC检测时需要进行严格的质量控制，确保结果的准确性和可靠性。

总结：免疫组织化学染色是一种广泛应用于医学研究和临床诊断中的技术。

通过对组织切片进行抗体染色和标记物显色，可以检测特定蛋白质的存在和表达情况。

IHC步骤包括取得组织样本、制备切片、抗体染色、洗涤、二抗染色、标记染色、洗涤、显色和封片。

IHC的原理基于抗体-抗原结合反应，检测结果受到多种因素的影响，需要进行严格的质量控制。

he染色方法及步骤

he染色方法及步骤HE 染色啊，这可是病理实验里常用的染色方法呢！它就像是给细胞和组织化了个美美的妆，让我们能更清楚地看清它们的模样。

首先呢，得准备好切片。

这切片就像是一张等待上色的画布。

然后把切片放进二甲苯里，让它好好泡个澡，把上面的脏东西都洗掉。

接下来就是染色的关键时刻啦！把切片放进苏木精溶液里，这苏木精就像是神奇的魔法药水，能把细胞核染得蓝蓝的，就像给细胞核戴上了一顶蓝色的小帽子。

染完之后，再用水冲洗一下，把多余的苏木精冲掉。

然后呢，把切片放进盐酸酒精里分化一下，让细胞核的颜色更加清晰、分明。

再用水冲洗干净。

这时候，该伊红上场啦！伊红就像是给细胞穿上了一件红色的外衣，让细胞质变得红红的。

把切片放进伊红溶液里泡一泡，然后再冲洗干净。

经过这么一番折腾，切片就像是化好了妆的美人，变得格外动人啦！你想想啊，这就好像是给细胞举办了一场盛大的化妆舞会。

细胞核穿着蓝色的礼服，细胞质穿着红色的裙子，在显微镜下翩翩起舞。

染完色后，还要把切片进行脱水、透明。

就像是给化好妆的美人再喷上一层定妆喷雾，让妆容更加持久。

最后呢，用中性树胶封片，把这美丽的画面永远地保存下来。

HE 染色方法虽然看起来步骤挺多，但只要我们认真细心地去做，就一定能染出漂亮的切片。

这就像是我们做一件事情，只要有耐心，肯下功夫，就一定能做好。

而且啊，HE 染色对于病理诊断来说可是非常重要的呢！医生们通过观察染色后的切片，就能判断出细胞有没有病变，病情严不严重。

所以说呀，HE 染色可真是个神奇的技术呢！它让我们能更深入地了解细胞的世界，为医学研究和临床诊断提供了重要的帮助。

你说，这是不是很厉害呢？。

HE染色与免疫组织化学染色实验报告

HE染色与免疫组织化学染色实验报告华中农业大学动物科技动物医学院HE染色与免疫组织化学染色实验报告1实验目的及意义1.1了解石蜡切片的制作过程1.2 掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法1.3 熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识2 实验方法及步骤2.1 石蜡切片制作及HE染色步骤2.1.1取材与固定：从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2.1.2脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。

再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

2.1.3浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。

待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。

冷却凝固成块即成。

包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。

2.1.4切片前的准备工作：先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。

将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。

2.1.5切片与贴片：将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。

切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

2.1.6 脱蜡至水华中农业大学动物科技动物医学院二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.7染色：苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

免疫组化HE染色FISHISH演示文稿

组织的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。 3、石蜡切片为常规制片技术，切片厚度2～7μm，应用范围广，不影响
抗体的穿透性，染色均匀一致。
4、组织的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小时。固定后经充分的流水冲洗后进行脱水包埋。
5、组织脱水：主要用不同梯度的酒精进行脱水。一般情况下，组织经过 70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
3、弹性纤维的染色方法：维格特氏雷锁辛品红法、Gomori‘s醛品红法、地衣红技术、费尔霍夫氏酒精苏木素技术。
二、Masson染色
Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。一般的Masson 染色用的是三色法，苯胺蓝染液使胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色(如光绿液染色为绿色)，Masson 丽春红酸性复红液使胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，Regaud 氏苏木精染液使细胞胞核黑蓝色。
2、弹性纤维染色的临床应用 1）用于区别正常的动脉和静脉以及观察动脉有病变时血管壁各层的情况，
如动脉粥样硬化时的各类变化。 2）用于区别观察各种疾病对弹性纤维的影响及变化，如原发性或继发性
高血压可见主动脉弹力纤维增生，老年弹力纤维增多症。心内膜弹力纤维增生症常都可见到弹力纤维断裂，梅毒性主动脉炎和皮肤的环状肉芽肿，动脉粥样硬化均可见到裂解，崩解的弹力纤维。 3）用于弹力纤维性假黄瘤的诊断。该病镜下见真皮中下部结缔组织变性，呈团块状或条索状，弱嗜碱性用弹力纤维染色法可以鉴别。
3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常有效。

免疫组织化学及HE染色实验步骤

免疫组织化学（immunohistochemistry）1组织脱水、包埋及切片（1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月；（2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡30min；（3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜；（4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块；（5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5µm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。

2免疫组化染色（1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min；（2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min；（3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min；（4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h；（5）封闭结束后，甩干载玻片，用吸水纸吸去残留液体，将载玻片放人湿盒内，滴加由5%山羊血清稀释的一抗，一抗液体要完全覆盖组织，放入4℃冰箱内孵育过夜；（6）将组织切片从冰箱中取出，放于室温静置至室温，用PBS摇床清洗3次，每次10min，用5%山羊血清稀释生物素标记的二抗覆盖组织表面，室温孵育45min，PBS摇床洗3次，每次10min；（7）组织表面滴加适量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温孵育30min，PBS洗3次，每次5min；（8）DAB显色：配制DAB显色液，滴加至组织表面，在显微镜下观察着色，待出现明显棕色且背景无明显着色时放于自来水中终止显色；（9）苏木素染核1-2min，用自来水冲洗终止染色；（10）将组织依次放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇II各5min，再放入二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，完成组织脱水和透明；（11）滴加一滴中性树胶封片，显微镜下观察并拍照，室温保存。