贴壁细胞培养流程
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤
一、必要预备材料：
1.黏贴培养基；
2.细胞品系；
3.无菌棉签；
4.注射器；
5.脱硫酸盐卤素灯；
6.无菌细胞刀；
7.培养皿；
二、准备培养基:
1. 将黏贴培养基进行解冻，准备好用于细胞传代培养；
2. 用无菌棉签从瓶口处取出50 µl 培养基，用注射器注入培养皿中；
3. 使用脱硫酸盐卤素灯查看培养皿内的培养基，待培养基稳定后，将其置入培养箱中培养。
三、传代培养：
1. 进行一代细胞培养：将100 μl 细胞品系加入培养基，置入培养箱中培养；
2. 收集细胞：在品系培养至90%~100%阶段时，用无菌细胞刀将培养基连同其中的细胞一起取出；
3. 再生细胞：将细胞回收液均匀分散于新培养皿中，培养至细胞分裂
成熟；
4. 用冷冻融解法进行传代：将细胞悬液的容量加入超净水稀释，冷冻至-80℃后融解，充分混匀均匀后加入培养基中，开始进行传代培养。
四、最终传代注意事项：
1. 使用消毒过的相关器具，保证细胞不受污染；
2. 使用玻璃制品，避免细胞停滞或污染；
3. 确保培养箱的清洁，以免细胞污染；
4. 要保证培养条件的稳定,合理检查、温度、湿度及其他有效细胞培养条件；
5. 按时调整培养液、细胞活力，确保细胞传代培养质量。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤贴壁细胞传代培养是一项细胞学技术，用于繁殖选定细胞，其目的是在同一种细胞中完成繁殖。
此技术对于基础研究、比较生物学和临床诊断都具有重要意义。
在贴壁细胞传代培养过程中，可以形成一系列细胞系供后续的研究使用，因此这一技术在细胞学研究中扮演着至关重要的角色。
贴壁细胞传代培养具体步骤如下：第一步：首先，将细胞从初始培养基中分离出来，用活细胞物镜观察，查看细胞形态是否正常，结果显示细胞有正常分裂。
第二步：将第一步中分离出的细胞悬浮液转移到饱和细胞悬浮液中，一般采用0.25%的胨酶，将细胞细胞壁分裂，使细胞形成悬浮状态，这一步称为“贴壁”。
第三步：将贴壁后的细胞悬浮液转移到新培养皿中，一般采用Trypsin EDTA抑制剂，使悬浮的细胞不能再分裂，形成不可见的“细胞溶液”，这一步称为“传代”。
第四步：缓慢地用微量移液器将细胞溶液倒入新培养皿中，当液体分散成一液一固时，加入培养基，使细胞随培养基逐渐沉淀，这一步称为“培养”。
第五步：此时，细胞受到培养环境的刺激，开始新一轮的分裂，细胞学习到细胞性质的分化，然后细胞会沉淀在培养皿底部，细胞分裂结束后，就形成了新一代的细胞，从而完成了一次贴壁细胞传代培养实验。
以上就是贴壁细胞传代培养的具体操作步骤，要想做好这项实验，必须按照上述步骤进行操作，只有这样，才能确保实验数据的准确性。
同时，必须注意实验中的环境条件，确保培养基的新鲜，避免菌类污染，进而确保实验的准确性和稳定性。
贴壁细胞传代培养技术正逐步得到应用，目前，它已经运用于很多细胞学领域，尤其是在细胞分化和细胞系的建立中发挥了重要作用。
贴壁细胞传代培养技术更加方便、成本更低，并且能够解决传统细胞培养技术中遗传变异现象导致的假阳性，新增细胞不能够稳定传代等问题，所以受到越来越多的关注。
最后，应该提醒大家，在实验中一定要遵守实验安全规范，做好实验前预防措施，以保障实验安全、获得准确有效的实验结果。
总之，贴壁细胞传代培养技术由于其便捷性、稳定性、节约开销等优点，在细胞学领域具有重要的应用价值，未来将会发挥更大的作用。
贴壁细胞传代培养操作步骤
贴壁细胞传代培养操作步骤作文一：给初学者的贴壁细胞传代培养操作指南亲爱的小伙伴们，今天咱们来聊聊贴壁细胞传代培养那些事儿。
想象一下，细胞就像一个个小小的居民，住在培养皿这个“小区”里。
时间长了，“小区”变得拥挤，它们就需要搬家啦，这就是传代培养。
咱们得准备好工具，就像搬家要准备好箱子一样。
要有干净的培养皿、移液器、胰酶等等。
然后，把培养皿从培养箱里拿出来，在超净台里操作，可不能让细菌和灰尘这些“小捣蛋鬼”跑进去。
再加入胰酶，让细胞和培养皿分开，就像把粘在墙上的贴纸轻轻撕下来。
等细胞变圆了，赶紧加新的培养液终止胰酶的作用，不然细胞会受伤的哦。
用移液器把细胞吸出来，平均分到新的培养皿里，给它们新的“家”。
怎么样，是不是没有那么难？多练习几次，你就能熟练掌握啦！作文二：贴壁细胞传代培养，其实很简单朋友们，今天来和大家分享贴壁细胞传代培养的步骤，别害怕，一点都不难！比如说，我之前在实验室第一次做这个的时候，心里也直打鼓。
但做着做着就发现，真的没那么复杂。
咱们开始吧！先把要用的东西都准备好，像培养皿、移液器、胰酶，一个都不能少，这就好比做饭前要把食材和工具都摆好。
接着，把培养皿轻轻拿出来，动作要轻，不然细胞会被吓到的。
然后把里面的培养液吸掉，这就像给花浇水后把多余的水倒掉。
之后加入胰酶，等一会儿，你会看到细胞慢慢变圆，就好像它们在伸懒腰准备搬家。
这时，加新的培养液停止胰酶的作用，再把细胞吸出来，分到新的培养皿里，就大功告成啦！多试几次，你会发现自己越来越熟练，细胞在你的照顾下也会茁壮成长的！作文三：贴壁细胞传代培养，轻松上手小伙伴们，细胞传代培养听起来是不是很高深？其实很简单，跟我来！假设细胞是一群可爱的小朋友，在一个小小的教室里待久了，就得换个大点儿的教室，这就是传代培养。
第一步，把所有的“装备”都准备齐全，像新的培养皿、移液器，还有胰酶，这就像给小朋友们准备新的书包和文具。
第二步，把装着细胞的培养皿从“小房子”（培养箱）里拿出来，放在干净的“桌子”（超净台）上。
贴壁细胞培养完整版
贴壁细胞培养HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，，，饱和湿度条件培养箱内孵育μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO27天。
《细胞工程》实验三 贴壁细胞株的传代培养
谢 谢！
0.25g胰酶+100mlPBS+0.02gEDTA
4℃过夜溶解
超净台滤器除菌
0.25%胰酶（ 4℃保存，-20 ℃长期保存）
实验步骤：
弃去培养基，PBS洗2-3次
加胰酶（每瓶0.5ml左右，覆盖细胞即可）
消化适当时间，加完全培养基中和（与胰酶比例2:1）
吸取细胞悬液至离心管中
离心（1200转左右，3分钟）
弃去上液，加入新的培养基
成细胞悬液后，转移到培养瓶中
3. 细胞冻存与复苏
收集细胞时，除需用胰酶消化外，其它同悬浮细胞
4. 作 业
贴壁细胞培养的关键技术流程
4.常见问题
传代频率：每2-3天传代（至细胞长满至80%）
传代比率：1:6-1:8传代
消化条件：室温或者37℃
消化时间：依据不同细胞的贴壁牢固程度而不同 1.肉眼观察：细胞团的产生 2.显微镜观察：细胞变圆，部分漂浮 消化过度：传代后细胞不贴壁
贴壁细胞株的传代培养
贴壁细胞
细胞来源：人乳腺癌细胞：MCF-7
肿瘤相关成纤维细胞：CAF
1.培养条件
培养基：1640培养基（或DMEM）（含10%FBS）
PH： 7.2-7.4（可稍偏酸） 温度： 37℃
孵育箱
气体组成： 5%CO2+95%空气
2. 传 代
0.25%胰酶
配制方法：
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤一、复苏1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。
二、传代1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个，继续培养。
10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。
三、冻存1.把原有培养基吸掉。
2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。
4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。
5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
配制溶液一、培养基配制（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗二、冻存液90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇三、消毒液75%的酒精注意事项（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
细胞贴壁实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞贴壁生长的基本原理和方法。
2. 了解细胞培养过程中细胞贴壁生长的重要性。
3. 观察细胞在不同条件下的贴壁生长情况，分析影响细胞贴壁生长的因素。
二、实验原理细胞贴壁生长是细胞在体外培养过程中的一种重要生长方式。
细胞在培养皿表面贴附，通过细胞与培养皿表面的相互作用，细胞逐渐伸展、增殖。
细胞贴壁生长对于细胞培养、细胞实验和药物筛选等具有重要意义。
三、实验材料1. 细胞：小鼠心肌细胞（HL-1细胞）2. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清3. 培养工具：培养皿、移液枪、吸球、无菌操作台、显微镜、盖玻片、载玻片4. 实验试剂：0.5%多聚赖氨酸、PBS缓冲液、胰蛋白酶四、实验步骤1. 预处理：将细胞从培养瓶中取出，用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞，收集细胞悬液。
2. 细胞贴壁：将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 贴壁条件优化：1）将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟，自然晾干后，将其放置于培养皿底部。
2）将细胞悬液加入盖玻片上，使其均匀铺展。
3）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4. 观察与记录：1）每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时等），在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。
2）记录细胞贴壁生长速度、细胞形态、细胞数量等指标。
5. 数据分析：1）根据观察结果，绘制细胞贴壁生长曲线。
2）分析影响细胞贴壁生长的因素，如培养时间、细胞密度、培养条件等。
五、实验结果与分析1. 细胞贴壁生长曲线：细胞在培养皿中贴壁生长，随着时间的推移，细胞数量逐渐增加，细胞形态逐渐伸展。
2. 影响细胞贴壁生长的因素：1）培养时间：细胞贴壁生长速度随培养时间的延长而增加，但过长的培养时间会导致细胞密度过大，影响细胞生长。
2）细胞密度：细胞密度越高，细胞贴壁生长速度越快，但过高的细胞密度会导致细胞相互挤压，影响细胞生长。
3）培养条件：适当的温度、pH值、气体环境等有利于细胞贴壁生长。
细胞培养的过程及注意事项
36细胞培养旳过程及注意事项细胞旳培养过程及注意事项；根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种；1.组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪；2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞旳培养过程及注意事项根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种及培养等环节。
原代培养旳措施诸多, 基本和最常用旳是组织块培养法和分离细胞法。
1.组织块培养法(1)基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪将附在其上旳脂肪和结缔组织清除洁净。
再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利旳眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次, 直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养瓶皿中, 并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上, 量不要过多, 要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一侧旳对侧面加足培养液, 勿使组织块与培养液接触, 塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块旳一侧朝上, 静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1 h到3h后翻瓶, 使贴壁旳组织块浸没与培养液中, 静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液, 或者根据培养瓶种颜色旳变化确定换液时间。
2.注意事项1）、组织块接种后旳前3天, 从组织块向外迁徙旳细胞数很少, 组织块旳黏附不牢固, 在观测和移动旳过程中, 注意不要引起液体旳振荡。
要防止常常翻动和振动, 否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入旳培养液不适宜过多, 防止浸泡旳组织块受轻微旳波动而脱落下来。
贴壁细胞培养
北京索莱宝科技有限公司
贴壁细胞培养
细胞名称：293T，人胎肾细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H(4.5g/L Glucose）+10%FBS
传代方法：1:3～1:4传代，一周2~3次
冻存条件：细胞冻存液
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁且细胞连接松散时再吹打，将细胞分离成单个后，加培养基混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
第1页，共1页。
贴壁细胞培养步骤及注意事项
贴壁细胞培养步骤及注意事项第一步：准备工作1.1清洁实验台面和培养器具在开始培养之前，应先清洁培养器具和实验台面，以确保无菌环境。
1.2准备培养基根据不同实验的要求，准备需要的培养基，并确保其无菌。
1.3预热培养基和器械将培养基和器械置于37℃的培养箱中，使其达到需要的温度。
第二步：细胞分离2.1收集细胞使用无菌技术，收集需要培养的细胞，最好使用处于快速生长期的细胞。
2.2细胞计数使用显微镜和计数板计数细胞数目，以便确定接种的细胞数量。
2.3离心细胞将细胞离心，去除上清液。
第三步：贴壁培养3.1接种细胞将细胞重新悬浮在预热的培养基中，并根据需要的细胞浓度接种到培养器皿中（例如培养皿、培养瓶等）。
3.2倾斜培养器具倾斜培养器具，以确保细胞均匀分布并黏附于底部。
3.3培养器出现倒置的小液滴密封培养器，以防止培养基蒸发和外界污染。
第四步：培养条件4.1恒温条件将培养器放在恒温箱中，维持适当温度（通常为37℃）和湿度。
4.2CO2条件对于一些细胞，需要提供CO2环境以保持合适的pH值。
可以通过加入CO2气体或培养箱添加CO2控制器来实现。
4.3培养时间根据细胞类型和所需实验目的，确定合适的培养时间。
第五步：观察和维护细胞5.1细胞观察使用显微镜定期观察细胞的形态和增长情况。
注意检查细胞的黏附性和细胞层的均一性。
5.2细胞维护根据需要，定期更换培养基，以保持细胞的正常生长和功能。
5.3细胞传代根据细胞生长状态，当细胞层达到一定的密度时，可进行细胞的传代，以保持细胞的活性和健康。
注意事项：1.确保所有用于细胞培养的器具和培养基都是无菌的，以防止细胞受到外界污染。
2.严格遵循无菌技术，避免任何可能导致细菌和真菌污染的操作。
3.细胞培养过程中，保持实验室卫生，定期清洗工作台和设备。
4.在细胞培养中，要注意避免细胞的过度处理和操作。
5.对于一些特殊类型的细胞，如原代细胞，可能需要特殊的培养条件和技术，需要进行额外的注意和维护。
贴壁细胞培养、传代及活性测定等
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冻存细胞的复苏
细胞培养方法介绍
1.把冻存管在37°C水浴进行解冻，其 间不停地温和摇动，直到冻存管内看 不到结冰。
7.加入3毫升预热的培养基再静置5分 钟。 8.加入6毫升预热的培养基静置5分
2.冻存管在水浴中继续孵育30秒，同 时温和地摇动。
钟。 9. 200×g离心细胞悬液10分钟。
3.立即用70%的乙醇消毒。 10.弃上清，再用25毫升的培养基温和 4.在超净台内打开冻存管，把内容物转 移到无菌的15毫升离心管中。 注意 ：如果是玻璃冻存管解冻，用无 菌的纱布裹住消过毒的冻存管，然后 用力掰断已有刻痕的瓶颈。 12.在培养箱中孵育过夜后，再次观察 5.加入1.5毫升在37°C预热的含血清培 养基。 6.静置5分钟。 细胞并估计细胞存活率。如果需要更 准确的检测，则采用台盼蓝排除染色 的方法。 重悬细胞沉淀，之后转移至75cm 2 的 培养瓶中。 11.用显微镜观察细胞，估计细胞的存 活率，然后把它们放入培养箱。
加入适当体积的细胞悬液。 8.将培养瓶放入培养箱，拧松瓶盖1/4 圈，以便气体交换。
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细胞活力分析
改编自Freshney, R.I.,1994。动物细胞培养：基本技术手册，第3版，Wiley-Liss，纽约，美国。 细胞活力分析可以测定细胞悬液 中存活细胞的百分比。一般通过染料 排除的染色方法实现，即具有完整细 胞膜的细胞能够将染料排除在外从而 不被染色，而不具备完整细胞膜的细 胞则能够吸收染料而被染色。 3.将稀释液加入血球计数板的计数池中 用于排除染色法的染料通常选择 台盼蓝，但是赤藓红和萘黑也常被使 用。吸收染料的染色方法也可以用于 测定细胞活力。这种情况下，染料被 活细胞正常吸收，而死细胞则不会。 例如双乙酰荧光素就是这类染色方法 中所使用的染料。 台盼蓝染色的方法应用较为广 泛，操作方法如下所述： 5.用血球计数板计算被染色的细胞数和 总细胞数。 6.未被染色的细胞百分比则代表了活细 胞的百分比。 4.静置1-2分钟（时间不要太长，否则 活细胞也会死亡并开始吸收染料）。 （见血球计数板）。 2.制备用0.4%台盼蓝溶液(SV30084.01) 1：1稀释的细胞悬液。 1.制备用于分析的细胞悬液（大约10 6 个细胞/毫升）。
贴壁细胞传代培养
9.用倒置式显微镜观察细胞 是否完全脱落；
10.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清 的培养基终止反应（一般为5:1）
11.用吸头多次吹打，以使细胞完全散开为 止，此悬浮液作为细胞母液；
12.在显微镜下进行细胞计数
13.按5×106细胞密度接种细胞，即吸出 1ml细胞母液(5×106)加入新的培养皿中
贴壁细胞传代及待转染细胞准备1首先将超净工作台用紫外光灯照射灭菌2030分钟关闭超净工作台内的紫外光灯点燃酒精灯一切操作均需在酒精灯火焰下进行3
贴壁细胞传代及待转染细胞准备
1、首先将超净工作台用紫外 光灯照射灭菌20-30分钟
2. 关闭超净工作台内的紫外光灯， 点燃酒精灯(一切操作均需在酒精 灯火焰下进行)
3.将消毒过的所用物品放入超净工 作台中
4.将培养好的HeLa细胞培养 皿放入超净工作台中
5.用无菌吸管将细胞上原有的培养 液吸净；
6. 取1毫升0.25%胰酶 消化液放入培养皿中；
7.将加有胰酶消化液的培养皿放入 37℃温箱中消轻轻拍打培养皿的边缘；
14.再用吸管吸取9ml含有血清的培养液到 培养皿中；
15.将培养基和细胞的混合物轻轻摇匀； 16，在工作台上静止一会儿后，将培 养皿迅速置于CO2培养箱中。37℃条件 下培养12小时后用于细胞转染；
贴壁细胞MTT实验操作
贴壁细胞MTT实验操作1、接种细胞：收集对数期实验细胞，调整细胞悬液浓度（1×104~11×105个/ml），每孔接种100ul细胞悬液（每孔细胞数量103~104个/孔）。
通常只选择中间60孔用作实验，边缘孔用无菌PBS填充（当然也可以用细胞培养基，只是有点浪费）。
2、加药处理：5%CO2，37℃孵育至细胞贴壁后即可加药，通常我们选择在前一天下午种96孔板，次日上午加药处理细胞。
一般设5-7个药物梯度（用完全培养基配置2×稀释液），每孔100ul药物稀释液；每个梯度（组）设3-5个复孔，建议设5个。
3、5%CO2，37℃细胞培养箱孵育16-48小时（按实验需要选择）。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续37℃细胞培养箱孵育4h（若药物与MTT能够反应，可先弃去孔内培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液）。
5、终止培养，小心吸去孔内培养液（通常我们选择一次性甩去孔内培养液）。
6、每孔加入150ul二甲基亚砜，振荡２0min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪检测OD492nm/570nm各孔的吸光度值。
7、特别说明：实验应同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）注：1.读板仪用含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零；2. 细胞计数的取样量为20 微升左右3. 细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。
因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。
4. 加入MTT后的反应时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO，加入DMSO的体积还是一致的好。
贴壁培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞贴壁培养的基本方法。
2. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程。
3. 了解细胞培养技术的基本原理和应用。
二、实验原理动物细胞贴壁培养是一种常见的细胞培养方法，适用于大多数动物细胞。
该方法将细胞悬浮于含有营养物质的培养液中，使其附着于培养皿底部或盖玻片上，形成单层或多层细胞。
在适宜的培养条件下，细胞可进行增殖、分化等生物学活动。
三、实验材料1. 细胞：小鼠成纤维细胞2. 培养基：DMEM培养基3. 试剂：10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶4. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、培养皿、盖玻片等四、实验方法1. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞取出，用预热的DMEM培养基溶解，37℃水浴箱中复温至37℃，加入10%胎牛血清、青霉素-链霉素混合液，制成细胞悬液。
2. 细胞接种：将细胞悬液用移液器吸取，接种于培养皿中，每孔加入2ml细胞悬液，置于CO2培养箱中培养。
3. 细胞传代：待细胞生长至80%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
按照1:3的比例传代培养。
4. 观察细胞贴壁、生长、增殖过程：每隔一定时间，观察细胞在培养皿中的生长状态，包括细胞形态、数量、融合程度等。
五、实验结果1. 细胞复苏：冷冻细胞在37℃水浴箱中复温后，逐渐恢复活力，出现典型的细胞形态。
2. 细胞接种：细胞接种后，约24小时开始贴壁，约48小时形成单层细胞。
3. 细胞传代：细胞传代后，生长状态良好，形态、数量、融合程度与原代细胞相似。
4. 细胞生长曲线：观察细胞生长过程，绘制细胞生长曲线，显示细胞呈指数增长。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了动物细胞贴壁培养，观察了细胞贴壁、生长、增殖过程。
2. 细胞贴壁培养过程中，温度、CO2浓度、pH值等环境因素对细胞生长具有重要影响。
本实验中，CO2培养箱的温度设置为37℃，CO2浓度为5%，pH值稳定在7.2-7.4。
OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法
OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法贴壁细胞培养是一种常用的细胞培养方法，其中OPTIMEM是一种用于培养特定类型细胞的培养基。
下面将详细介绍使用OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法。
实验材料和仪器：1.贴壁细胞系：例如，HEK293细胞或NIH/3T3细胞等。
2. 细胞培养培养基：例如，Dulbecco修改的Eagle培养基（DMEM）或Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI 1640）。
3.OPTIMEM培养基。
4.烧杯和离心管。
5.无菌培养皿。
6.无菌培养壶。
7.显微镜。
8.离心机。
9.生物安全柜。
10.细胞移液器和离心管。
11.无菌培养室。
实验步骤：1.贴壁细胞的准备a.预先处理细胞培养器皿，将其在生物安全柜中用70％乙醇消毒，并用无菌PBS洗涤2次。
b.从细胞培养器皿中收集细胞，可以使用三文鱼糖蛋白酶或胰蛋白酶来消化细胞。
将细胞悬浮在培养基中，并利用细胞计数板在显微镜下计数细胞数。
c.获得所需数量的细胞，通常为1×106细胞/毫升。
d.用无菌PBS洗涤细胞2次并将其重悬于OPTIMEM培养基中，使细胞的最终浓度为1×105细胞/毫升。
e.获取无菌培养皿，将细胞悬浮液转移到培养皿中。
f.将培养皿放入无菌培养室，并将其放入培养箱中进行培养。
2.细胞培养和观察a.将培养皿放入培养箱中，在37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养细胞。
b.每天观察细胞的生长情况和形态学特征。
使用显微镜定期检查细胞的形态和密度。
c.检查细胞的污染和部分剥离，如果有必要，及时更换培养基。
3.细胞传代a.当细胞达到80-90％的密度时，用无菌PBS洗涤培养皿。
用胰蛋白酶消化细胞。
注意避免过度消化引起细胞死亡。
b.离心细胞悬浮液，去除上清液。
c.用新的OPTIMEM培养基将细胞悬浮，将细胞转移至新的无菌培养皿中。
d.将培养皿放入培养箱中进行培养。
羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作
羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作
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►（2）无菌操作工作区域应保持清洁与宽大, 必要物品, 如试管架、移液器或吸管头等能够 暂时放置, 其它试验用具用完后应及时移出, 以利气体流通。试验用具要用70%酒精擦拭 后才能带入无菌操作台内。试验操作应在操 作台中央无菌区域内进行, 勿在边缘非无菌区 域操作。
►为保持二倍体细胞性质, 细胞应在初代培养期 或传代后早期冻存。如不冻存, 则需重复传代 以维持细胞适宜密度, 以利于生存。
►普通情况下当传代10～50次左右, 细胞增殖 逐步迟缓, 以至完全停顿, 细胞进入第三期
羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作
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3. 衰退期
►此期细胞依然生存, 但增殖很慢或不增殖；细 胞形态轮廓增强, 最终衰退凋亡。
►克隆（clone）: 亦称无性繁殖系或简称无性 系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细 胞经过有丝分裂产生遗传性状一致细胞群。
羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作
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培养细胞生长和增殖过程
体内细胞生长在动态平衡环境中, 而组织培养细 胞生存环境是培养瓶、皿或其它容器, 生存空 间和营养是有限。当细胞增殖到达一定密度后, 则需要分离出一部分细胞和更新营养液, 不然 将影响细胞继续生存, 这一过程叫传代 （Passage或Subculture）。
MEM, 10% HI 胎牛血清 和 NEAA
McCoy'5A, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮细胞 人 绒毛膜癌
MEM, 10% 胎牛血清
KB 上皮细胞 人
口腔癌
MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
Saos-2 上皮细胞 人 骨肉瘤
McCoy'5A, 15% 胎牛血清
贴壁细胞培养流程
贴壁细胞培养流程-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII贴壁细胞培养流程1.将自己的细胞取出来，观察密度。
（细胞密度大于等于80%就可以处理了）2.准备传代需要的实验器材及试剂（5ml、1ml枪头，PBS,培养基，废液缸）3.将培养瓶中培养液倒出（培养瓶举高一点，不要太靠近废液缸，以免污染）4.每次加3ml左右PBS洗细胞，洗两次（注意不要将细胞吹打下来。
用PBS洗的目的：传代细胞所用的培养基一般含有血清，而血清能影响胰酶的活性，使其失效，因此一般在加胰酶之前会用PBS洗一下，避免胰酶活性降低）5.加入1ml胰酶，前后摇匀，在显微镜下观察其形态（为什么用胰酶消化：细胞外含有多种胞外蛋白,如胶原蛋白。
这些蛋白使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来。
用胰蛋白酶分解这些蛋白质后它们就分开了。
胰酶消化过度：消化过度，一方面会对细胞本身造成伤害，另一方面，造成细胞流失，也就是吸取消化液时，由于消化过度，其中大量溶在消化液中的细胞被吸走，导致细胞数量减少）6.等到细胞变圆，没有连成一片且开始慢慢脱落下来的时候就可以终止消化了（如果想加速消化，就把细胞放回培养箱）7.终止消化：加入5ml左右培养基，并将细胞吹打下来。
吹打完后在显微镜下观察吹打情况。
（注意四个角落的细胞是否吹打下来）8.把细胞吸到离心管中，离心5分钟1000转。
9.离心完后取出离心管，离心管底部有一团白色的细胞。
10.倒出培养液，加入2ml左右培养基并吹散细胞。
11.取出一个培养瓶，加入7ml左右培养基。
12.吸取0.4ml左右细胞加入培养瓶，混匀培养瓶中细胞并前后摇匀。
做好标记，放入培养箱。
（吸取前先混匀离心管中细胞。
）2。
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贴壁细胞培养流程
1.将自己的细胞取出来，观察密度。
（细胞密度大于等于80%就可以处理了）
2.准备传代需要的实验器材及试剂（5ml、1ml枪头，PBS,培养基，废液缸）
3.将培养瓶中培养液倒出（培养瓶举高一点，不要太靠近废液缸，以免污染）
4.每次加3ml左右PBS洗细胞，洗两次（注意不要将细胞吹打下来。
用PBS洗的目的：传代
细胞所用的培养基一般含有血清，而血清能影响胰酶的活性，使其失效，因此一般在加胰酶之前会用PBS洗一下，避免胰酶活性降低）
5.加入1ml胰酶，前后摇匀，在显微镜下观察其形态（为什么用胰酶消化：细胞外含有多种
胞外蛋白,如胶原蛋白。
这些蛋白使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来。
用胰蛋白酶分解这些蛋白质后它们就分开了。
胰酶消化过度：消化过度，一方面会对细胞本身造成伤害，另一方面，造成细胞流失，也就是吸取消化液时，由于消化过度，其中大量溶在消化液中的细胞被吸走，导致细胞数量减少）
6.等到细胞变圆，没有连成一片且开始慢慢脱落下来的时候就可以终止消化了（如果想加速
消化，就把细胞放回培养箱）
7.终止消化：加入5ml左右培养基，并将细胞吹打下来。
吹打完后在显微镜下观察吹打情况。
（注意四个角落的细胞是否吹打下来）
8.把细胞吸到离心管中，离心5分钟1000转。
9.离心完后取出离心管，离心管底部有一团白色的细胞。
10.倒出培养液，加入2ml左右培养基并吹散细胞。
11.取出一个培养瓶，加入7ml左右培养基。
12.吸取0.4ml左右细胞加入培养瓶，混匀培养瓶中细胞并前后摇匀。
做好标记，放入培养箱。
（吸取前先混匀离心管中细胞。
）。