Y染色体微缺失检测指导

Y染色体微缺失是严重少精子或无精子症的重要原因，是导致男性不育的第二大遗传因素，其发生率仅次于Klinefelter综合征(克氏综合征)。从1999年开始，欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控网(EAA/EMQN)为提高诊断质量，出版了Y染色体微缺失分子诊断指南，并提供了客观的实验质量评价方法。最新版的实验室指南是2013年9月EAA/EMQN根据12年的临床积累和专家共识，在1999版和2004版的基础上修订而成。新指南重点阐明：在少精子症或无精子症男性中发现的Y染色体微缺失区域，主要是无精子因子(azoospermia factor，AZF)区域仅包含AZFa、AZFb、AZFbc、AZFc和AZFabc区，独立的AZFd区并不存在；AZFc区中gr/gr缺失是影响精子生成的一个危险因素，但临床意义尚存争议，不作为常规检查指标；检测位点增加并不能提高检测灵敏度，反而可能使结果复杂化；基于两管多重PCR 的检测方法仍适用于整个AZF缺失检测。EAA/EMQN 12年国际质量评估计划(EQA计划)的实施表明，参与实验室通过规范实验操作，改善报告质量，可有效降低诊断错误率。Y染色体微缺失在中国不育男性中的发生频率为11.5%，处于较高水平，我们建议将AZF检测作为男性严重少精子或无精子症的常规检测项目，呼吁国内AZF检测实验室加入EQA计划，完善中国Y染色体微缺失检测实验操作规范。

Y染色体微缺失分子检测在中国已开展多年，国内专家对AZF缺失模式、检测序列标签位点(sequence–tagged site, STS)的数量、检测方法和内部质量控制等临床问题未达成共识。各实验室的诊断操作方法有很大不同，导致不准确或错误诊断时有发生，迫切需要建立Y染色体微缺失诊断标准和质量控制标准。EAA/EMQN更新的2013版指南对以上问题都给出了明确的专家共识，对我国建立自己的检测指南有重要的指导意义。

一、Y染色体微缺失发生频率

Y染色体微缺失在健康人群中发生率约为1/4 000，但在不育男性中显著升高，微缺失发生频率为2%～10%(甚至更高)。2013版指南指出Y染色体微缺失在中国不育男性中发生频率为11.5%，处于较高水平。2006年朱晓斌等[1]针对中国不育男性染色体的研究表明AZF微缺失在非梗阻性无精子症患者中的发生率为9.94%，严重少精子症患者中发生率为5.82%，与国内外其他学者的研究基本一致。

随着微缺失分子机制的阐明和Y染色体男性特异区域的结构(MSY)测序完成，结合十多年临床数据分析，EAA专家总结沿用Repping等[2]对Y染色体微缺失区域的定义模式，分为：AZFa 区缺失、AZFb区缺失、AZFbc区缺失和AZFc区缺失，认为只有该微缺失模式有明确的临床表现。国内外学者对AZFd区缺失是否存在一直存有争议。尽管发现在AZFb与AZFc两区域之间存在新的缺失位点(一些学者认为的AZFd区缺失)，但是该区域缺失没有明确的临床意义，也并非独立存在的缺失模式。所以第四区域AZFd区缺失仍存在较多争议。Müslümanolu 等[3]在2005年的一项研究中指出AZFd缺失可能与精子形成有关，但仍缺乏有力的临床证据。2013年，陈科等[4]在精子正常和轻度少精子症患者中都发现了假定的AZFd区缺失。然而，至今为止AZFd区域尚未发现与精子生成相关的候选基因，其缺失所对应的临床表型还需进一步确认。

二、gr/gr缺失不纳入常规检查项目

研究证实gr/gr缺失属于AZFc部分缺失，是影响精子生成的一个重要因素，但是否需要将其作为常规检查指标尚存争议。尽管gr/gr缺失可导致AZFc区一半以上基因丢失，但其临床意义仍不明确，因为该缺失患者精子生成表型变化多样，从少精到精子数目正常都存在。gr/gr 缺失表型在不同人种和地域间存在差异，已有研究证实在欧洲白种人(除了法国人[5]和德国人[6])和西太平洋居民中，gr/gr缺失是男性生精障碍的高危因素[7]。但在部分亚洲国家如日本和中国[8,9]，gr/gr缺失在健康人群中的概率和在不育患者的概率无显著差别。李铮等[10]

研究发现Y染色体gr/gr缺失既存在于严重不育男性，也存在于生精功能正常的捐精者中，缺失可能遗传自父亲，并未影响精子的发生，不能认为是精子发生的遗传风险因子。因此在中国gr/gr缺失不建议作为Y染色体微缺失常规检测的缺失模式。

三、AZF缺失基因型/表型相关性

Y染色体微缺失主要是AZF的缺失，该区域包含精子生成的相关基因家族，不同程度的缺失可导致少精子或无精子症。AZF区进一步可分为AZFa、AZFb、AZFc区域。AZFa区域缺失通常导致唯支持细胞综合征(SCO综合征)和无精子症。如果诊断为整个AZFa区域缺失，从睾丸中获得精子的概率为0。AZFb和AZFbc(P5/P1近端；P5/P1远端，P4/P1远端)缺失的典型睾丸组织学特征是SCO综合征或精子发生阻滞导致的无精子症。研究表明这些缺失与整个AZFa 区域缺失情况一样，患者也不能通过睾丸穿刺(TESE)获得精子。严重少精子或无精子症患者中AZFc缺失发生频率最高，AZFc缺失的临床表型和睾丸组织学类型多种多样。一般说来，AZFc缺失患者尚残存精子生成能力。罕见情况下，其缺失在自然状态下可遗传给其男性后代[11]。近50%AZFc缺失的无精子症患者可通过TESE获得精子，进行单精子卵胞浆内注射(ICSI)受孕，但这些患者的男性后代都将是AZFc缺失的携带者。

四、Y染色体微缺失检测人群

Y染色体微缺失检测不仅可以明确严重少精子或无精子症的病因，而且可以对预后做出一定的评估。Y染色体微缺失通常见于无精子症或精子浓度少于2×106/ml的患者。一般的临床参数，如激素水平、睾丸大小、精索静脉曲张、睾丸畸形、感染等对是否存在Y染色体微缺失没有任何预测价值，Y染色体微缺失必须通过分子检测来确定。拟行ICSI的严重少精子症应该做Y染色体微缺失检测，而对非梗阻性无精子症患者在行TESE或者睾丸显微切开取精术前也应该进行常规检测，因为当整个AZFa、整个AZFb、AZFbc或者AZFabc缺失时都不建议给患者做手术。需要特别提醒的是，如果采用辅助生育技术，AZFc缺失可以垂直遗传给男性后代。

如果患者通过AZF检测发现部分AZFa、AZFb或AZFc缺失，建议家族中其他男性也进行AZF 检测，因为这种缺失是可以遗传的。但整个AZFa、AZFb、AZFbc或者AZFabc缺失时不建议家族其他男性成员做AZF检测，因为这些缺失通常没有精子生成。

对丈夫携带AZFc区缺失类型的夫妻，研究其ICSI受孕情况[12]，大部分研究表明Y染色体微缺失存在与否不影响受精率和受孕率，但也有个别报道指出微缺失会导致受精率下降，影响胚胎质量，降低囊胚率和ICSI成功率[13]。

五、STS

Y染色体微缺失上的STS位点高达131个，如果用于Y染色体微缺失检测的STS过少，将有可能漏检某些区域的缺失，但若采用的STS过多，则可能包含一些多态性序列，而这些位点在正常可育男性中也可出现缺失。

指南指出，原则上只要对每个AZF区域一个非多态性的STS位点进行分析就足以判断AZFa、AZFb、AZFc是否存在缺失。任何一个已知缺失区域都包括多个STS位点，每个区域设置2个STS位点有助于增加检测的准确性。鉴于众多实验室经验总结和外部质量控制，并考虑到多重PCR扩增的形式，在1999和2004版指南中推荐的经典STS引物仍然有效，这些引物包括：AZFa: sY84、sY86；AZFb：sY127、sY134；AZFc: sY254、sY255 (都在DAZ基因上)。这些STS位点引物由多个实验室和外部质量控制实验证明：结果可信重复性好。采用这些引物几乎能够检测到所有临床上的相关缺失和文献报道的3个AZF区域95%以上的缺失，设计的这套引物能完全满足常规检测。它是一个简单的标准，便于实验室质量控制和缩小实验室之间