显微成像技术在药物发现中的应用

国际药学研究杂志 ２ ０ ０ ８年 ８月 第 ３ ５卷 第 ４期
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筛选（ ｈ ｉ ｇ ｈｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ， Ｈ Ｃ Ｓ ） 阅读 器〕 中的例 子。 ２ ２ 活体显微术 （ ｉ ｎ ｔ ｒ ａ ｖ ｉ ｔ ａ ｌ ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｙ ， Ｉ Ｖ Ｍ） 和深 层组织成像 与超分辨显微技术形成对比， Ｉ Ｖ Ｍ 和深层组织 成像探寻提供显微分辨率水平体内外细胞行为信息 的技术方法。目标是收集保持在天然状态或者至少 是生理学相对适当状态的组织和器官系统的动力学 过程的信息。Ｉ Ｖ Ｍ 的特点就是采用非侵入性的方法 而获得典型的宏观分辨率。 Ｉ Ｖ Ｍ 和深层组织成像技术与超分辨率显微技术 关注的侧重点不同， 前者主要关注技术的物理进入 性和光散射。研究中获得感兴趣组织的体内情况往 往需要维持对动物或组织的长时间清晰成像， 这是 标准的显微光学做不到的。更为重要的是， 生物组 织以波长依赖性的方式吸收和散射光线， 这种特点 严重阻碍了光线的深层穿透性， 增加了背景模糊度， 影响图 像 的 形 成。短 波 或 者 近 紫 外 波 长 （ 约４ ０ ０ ） 通常发生散射最为严重， 会造成高度的组织自 ｎ ｍ 发荧光现象。基于上述原因， Ｉ Ｖ Ｍ 和深层组织成像 ｎ ｅ ａ ｒｉ ｎ ｆ ｒ ａ 研究之初就倾向于应用红外或近红外 （ ｒ ｅ ｄ ， Ｎ Ｉ Ｒ ） 激发波长。长波发光尽管并不是新的研究 思路， 但最近这一领域取得了显著进展， 且很有可能 近期就会对靶向生物学和疾病动物模型研究产生重 大的影响。下面对这些技术进步在靶向生物学和疾 病动物模型中的应用做简要讨论。 ２ ２ １ 自聚焦 （ ｇ ｒ ａ ｄ ｉ ｅ ｎ ｔ ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ， Ｇ Ｒ Ｉ Ｎ ） 透镜技术 与传统光学采用物镜几何学计算折光指数变化的原 理不同， Ｇ Ｒ Ｉ Ｎ透镜探索光线从折射率转化到极化 光的径向变异。 Ｇ Ｒ Ｉ Ｎ透镜直径只有亚毫米级， 特 别是其含有极化光学表面， 能够容易地组合到复合 透镜或和光纤紧密配合。 Ｇ Ｒ Ｉ Ｎ透镜有多种不同形 式， 能够作为物镜用于聚光或者作为中继镜用于图 像从物体表面的转移。所有这些性质使 Ｇ Ｒ Ｉ Ｎ透镜 成为标记深层组织和限制性区域光学工具中理想的 光学终端组件。目前， 多数应用 Ｇ Ｒ Ｉ Ｎ透镜的技术 都在 Ｇ Ｒ Ｉ Ｎ透镜下游配置有普通的物镜和辅助性的 显微系统以便于图像的捕获。然而， 需注意的是， Ｇ Ｒ Ｉ Ｎ透镜 在 纤 维 光 学 成 像 工 具 中 也 发 挥 重 要 作 用。上面讲述的方法最近已成功应用到脉管系统和 大脑表层以下的单一神经元成像中， 获得了亚细胞 水平分辨率图像。 ２ ２ ２ 结合多光子技术的 Ｉ Ｖ Ｍ 理论上讲， 通过结
Ｖ Ｍ 方法， 但是 合共聚焦探测技术能够改进现有的 Ｉ 众多的影响因素使得达到这一目的困难很大。其中 最为重要的因素是光的散射效应， 由于方法中存在 共聚焦激发， 光的散射来源于激发光的整个锥束， 锥 束和穿透的组织相互作用， 就引起了和成像深度成 比例的光的散射。在任何成像深度， 这种光散射作 用都会严重降低激发光斑的强度和清晰度， 从而使 获得图像模糊不清。简单的提高照明强度只能将问 题复杂化， 导致附加的光破坏。相反， Ｉ Ｖ Ｍ 真正的进 步开始于另一技术— — —多光子显微技术的发展。概 括起来， 结合多光子技术的 Ｉ Ｖ Ｍ 和传统的显微技术 尤其是共聚焦方法相比有五大优点： 减少了由于光 线散射造成的图像退化， 增大了深层穿透（ 大约是 共聚焦方法的 ６倍） ， 提高了光学效率， 优化了 ｚ 值 （ 利于提高信噪比和三维图像构建） ， 减少了光破坏 （ 有利于延长成像时间） 。此外， 最近在飞秒激光脉 冲成形（ 包括空间和时间两方面） 和脉冲空间的技 术革新可能将进一步促进多光子 Ｉ Ｖ Ｍ 的应用。 Ｖ Ｍ 已经广泛地应用 目前结合多光子技术的 Ｉ 于免疫学、 传染性疾病治疗和肿瘤生物学研究中。 总体来讲， 相对于其竞争性技术如正电子发射断层 摄像术（ ｐ ｏ ｓ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎｅ ｍ ｉ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎｔ ｏ ｍ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ ， Ｐ Ｅ Ｔ ） 和磁共振 ｍ ａ ｇ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｒ ｅ ｓ ｏ ｎ ａ ｎ ｃ ｅ ｉ ｍ ａ ｇ ｉ ｎ ｇ ， Ｍ Ｒ Ｉ ） ， 多光子 Ｉ Ｖ Ｍ 成像（ 的优点在于能在保证高分辨率、 高对比度和最大生 理事件相关度的前提下， 对结构、 功能和治疗效应进 行持续成像。最近发现的多光子成像和量子点之间 的协同效应更加意味着 Ｉ Ｖ Ｍ 技术的普及应用在未 来疾病模型的研究中会不断上升。 ２ ３ 纤维光学成像 Ｉ Ｖ Ｍ 纤维光学成像技术是新近发展起来的一项技 术， 它可以在传统光学显微技术不能起作用的情况 下对细胞和组织进行体内可视化成像。尤其适用在 空管道例如在血管中无破坏性的对疾病过程进行研 究调查， 还包括对器官系统的深层观察（ 例如脑部） 或者固体肿瘤内部观察。纤维光学成像在药物发现 中的应用也很有价值， 因为这种技术提供了进入组 织和器官的物理通路与临床的联系更加紧密。目 前， 这种物理通路是在以部分图像信号质量、 空间分 辨率和深层穿透率降低为代价的情况下获得， 这一 技术的改进正致力于解决这些问题， 同时能够达到 长期的实体通道对动物的纵向研究。很多例子中， 纤维光学成像是上述提到的深层组织双光子 Ｉ Ｖ Ｍ 方法的简单替代形式。
国际药学研究杂志 ２ ０ ０ ８年 ８月 第 ３ ５卷 第 ４期
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显微成像技术在药物发现中的应用
徐培培，王 林
（ 军事医学科学院放射与辐射研究所， 北京 １ ０ ０ ８ ５ ０ ）
摘要：显微成像技术通过帮助描述疾病过程及在此过程中可能进行干预的潜在治疗方法， 可进一 步加快药物发现过程。最近的一些新技术和对已有技术的改进集中解决了过去显微成像技术应用 的技术难点， 即增加了显微成像技术的空间分辨率， 提高了组织穿透率、 跨越机体组织障碍的能力， 增加了实验通量。本文集中介绍最近显微成像技术一些值得注意的发展趋势， 包括超显微技术的 发展， 多光子技术引入， 纤维光学显微技术和自动成像技术以及应用于高内涵筛选的图像分析技 术。总之， 这些技术进步不仅仅加速了早期药物发现中已有的实验测定和疾病模型， 还催生了许多 新的测定方法和疾病模型。 关键词：显微成像；超高分辨率显微技术；活体显微技术；纤维光学技术；高通量显微技术 中图分类号：Ｒ ９ ３ ９ 文献标识码：Ａ 文章编号： １ ６ ７ ４ ０ ４ ４ ０ （ ２ ０ ０ ８ ） ０ ４ ０ ２ ９ ５ ０ ５ 新的显微成像方法和工具的应用， 包括先进的 显微成像设备、 新型的方法和新的实验试剂， 极大地 丰富了早期药物发现过程中的检测方法和组织模 型， 同时也为药物发现后期提供了更加复杂的疾病 模型。总体来讲， 这些进步更方便地提供了从细胞 到机体组织的更高灵敏度、 专一性和高分辨率的检 测方法， 因此对整个药物发现活动， 从靶标生物学到 化合物筛选再到疾病的动物模型， 都产生了重要影 响。 １ 新显微技术的优点 显微成像技术的革新改善了显微光学成像中内 在的技术缺陷（ 图１ ） 。大体上讲， 目前影响光学成 像技术发展的限制因素主要有以下 ４个方面： 空间 分辨率不足， 深度或组织穿透率较小， 物理通路缺乏 和实验通量低。实验中， 其中一种或多种因素可能 成为主要限制因素。例如， 光学显微技术的空间分 辨率经常很低， 从而导致不能充分捕获或刻画所有 暗含的生物信息， 尤其是分子水平的详细信息。而 超分辨率显微技术已在此方面取得进展， 这种技术 可以在衍射极限（＜ ２ ０ ０ｎ ｍ ） 以下很好的解析结构，
图２ 新的超分辨率显微技术
Ｓ Ｔ Ｅ Ｄ ： 受激发射损耗显微术； Ｓ Ｈ Ｇ ： 二次谐波技术
有用， 因为如此低的瞬逝场只能激发表面 １ ０ ０ｎ ｍ或 更小的荧光团， 从而产生非常薄的光学切面。需要 注意的是由于几何学本身很复杂， 影响因素很多， 以 上技术只能作为生物学研究的辅助工具使用。 概括地讲， 许多超高分辨技术最近已经从实验 室进入日常生活中。为了使这项技术更好的与生物 学和高通量的方法相适应还有许多辅助工作要做。 在空间分辨率方面已报道的技术进步令人振奋， 且 已有将其 结 合 到 商 业 显 微 镜 （ 例如莱卡 ４ Ｐ Ｉ 显微 镜） 和筛选工具〔 例如将结构照明能力带入高内涵
பைடு நூலகம்
衍射限制。总体来讲， 技术进步已经使得能够产生 不再受衍射现象限制的图像。在一些情况下， 这些 革新的 结 合 效 应 已 经 将 光 显 微 的 分 辨 率 推 进 到 ３ ０ｎ ｍ 以下。 新几何学技术常利用两个目镜的不同组合来优 化光束聚集， 采用倾斜的或旋转的观察对样品进行 多种方位的照明或者从样品的不同部分增加光线捕 获、 用图像干涉的方法（ 检测器或者样品的干涉） 来 产生附加对照， 用相干光进一步扩大光对比度。在 一些情况下， 点扫描也被用来增加共聚焦度。新几 何学的方法还包括全内反射荧光 （ ｔ ｏ ｔ ａ ｌ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｌ ｒ ｅ ，Ｔ Ｉ Ｒ Ｆ ） 显微技术。Ｔ Ｉ Ｒ Ｆ照射样 ｆ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ 品时由于离轴光照和样品表面的相互作用而产生的 瞬逝场很薄， 因此这种方法尤其对于表面成像十分
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Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ２ ０ ０ ８Ａ ｕ ｇ ； ３ ５ （ ４ ）
图１ 药物发现中的显微成像技术
Ａ Ｄ Ｍ Ｅ Ｔ ： 吸收， 分布， 代谢， 排泄和毒性； Ｃ ｏ ｎ ｆ ｏ ｃ ａ ｌ Ｉ Ｖ Ｍ ： 共聚焦活体显微术； Ｃ ｏ ｎ ｆ ｏ ｃ ａ ｌ Ｍ Ｅ ： 共聚焦显微内镜术； Ｆ Ｍ Ｅ ： 荧光内镜术； ２ Ｐ Ｉ Ｖ Ｍ： 双光子 ２ Ｐ Ｍ Ｅ ： 双光子显微内镜术；Ｓ Ｐ Ｉ Ｍ： 选择性平面照明显微术； Ｓ Ｓ Ｉ Ｍ： 饱和结构化照明显微术； Ｔ Ｉ Ｒ Ｆ ：全内反射荧光显微术； Ｈ Ｔ Ｓ ： 高 活体显微术； Ｈ Ｃ Ｓ ： 高内涵筛选 通量筛选；
假定图像几何学激发光是均匀分布的， 但在荧光成 像的情况下， 这些荧光源于线性吸收和单一光子的 释放。最近， 许多研究已经证明， 通过改进物镜几何 学性质使其覆盖更多角度聚集更多光， 绕过一种或 多种这些局限， 改进这些仪器是可能的。例如通过 利用多种不均匀的激发光源， 这种光源含有高分辨 率的信息， 会产生非线性的荧光过程， 从而突破传统
因此可以收集接近于分子水平的高分辨率图像。 总之， 这些高级的和高通量的显微成像技术将 我们带离了简单的固定化点图像的体外测定时代。 取而代之的是高阶模型系统， 这一系统将强调生理 信息的相关性和输出摆在更为显著的位置。去除了 固定化点图像模型的一大优势在于它们可以进行重 复测定、 持续观察和动力学测定， 所有这些对描述系 统生物学都很重要。事实上， 这一技术的延伸应用 就是使药物在体内的治疗效应图像化， 尤其是在动 物模型中。整个机体的治疗效应的成像是非常有用 的方法， 能同时定量测定治疗效应、 时间过程和治疗 候选物的专一性。同时显微成像技术对于鉴定候选 物的脱靶效应及其可能性也具有潜在作用。 ２ 新兴的显微成像技术 ２ １ 超分辨显微技术 新的超分辨显微技术（ 图２ ） 极大地提高了光学 显微技术的空间分辨率， 被设计用来进行大分子或 者是亚显微分辨水平的操作， 经常用于检测单细胞 或者亚细胞细胞器的组织结构和生理过程。 长时间以来， 传统显微技术得到图像的质量和 分辨率被认为由物理定律限制（ 图像分辨率受衍射 限制） 而无法取得突破。传统理论认为光会聚焦到 离散斑， 每一幅图像均是由衍射限制组成的点构建 组成的， 因此只会得到有限的空间分辨率。但是， 必 须要注意 的 是， 这些传统的分辨率限制还基于几 种 内在的假设， 其中一项重要假设就是围绕单物镜
收稿日期： ２ ０ ０ ８ ０ ３ ０ ５ 作者简介： 徐培培， 女， 在读博士研究生， 研究方向： 新药设计与 Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ： ｐ ｅ ｉ ｐ ｅ ｉ ｘ ｕ ＠ｇ ｍ ａ ｉ ｌ ． ｃ ｏ ｍ 合成， 通讯作者： 王 林， 男， 研究员， 博士生导师， 研究方向： 新药设 Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ： ｗ ａ ｎ ｇ ｌ ｉ ｎ ０ ７ ＠ｓ ｉ ｎ ａ ． ｃ ｏ ｍ 计与合成，