线粒体制备及线粒体通透性转换孔检测
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
心肌线粒体的制备
采用差速分级离心法分离线粒体。取上述处理后的心脏置于预冷的匀浆介质(16ommol/LKCI，10mmol/LEDTA，0.5%牛血清白蛋白，pH7.4)中尽快剪碎，用组织匀浆机制成10%匀浆，在4℃下，以1000*g离心10min，弃沉淀，上清液于4℃，8000*g离心10min;弃上清液，沉淀用重悬液(320mmol/L蔗糖，l0mmol/LTris一HCI，pH7.4)重悬后再次于4℃，8000*g离心10min。所得沉淀即为线粒体。线粒体置于重悬液中用考马斯亮兰蛋白测定法测定蛋白含量。
线粒体渗透性转换的检侧
取线粒体用肿胀液t(120mmol/LKCI，20mmol/LM0pS，10mmol/L Tris一Hcl，5mmol/LKH2PO4，pH7.4)稀释至0.25g/L蛋白质，于25℃，200μmol/L的CaC12作用于线粒体，连续观察520nm处线粒体吸光度(A520)的变化15min，30个循环。该变化反映线粒体肿胀程度，提示MPTP的开放情况。