2015年药典 通则1106 非无菌产品微生物限度检查
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通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时。
(2015年版药典)非无菌药品微生物限度检查操作规程
1. 目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，标准检验操作，确保检验结果准确。
2. 适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。
3. 责任者：QC检验员、QC经理。
4. 正文：4.1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 假设使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了外表活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法〔Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法〕。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。
供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
假设检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
(整理)年药典通则1106非无菌产品微生物限度检查.
通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时。
2015年药典通则1106非无菌产品微生物限度检查
通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonellaparatyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时。
非无菌制剂微生物限度检查操作标准程序
非无菌制剂微生物限度检查操作标准程序起草人日期年月日执行日期2015年12月01日审核人日期年月日颁发部门质保部批准人日期年月日分发部门质保部（）生产部（）采供部（）销售部（）设备部（）物资部（）销售部（）行政部（）财务部（）变更记载：修订号执行日期00 2012年06月01日01 2014年05月01日02 2015年12月01日1. 目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。
2. 适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。
3. 责任者：QC检验员、QC经理。
4. 正文：4.1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法4.1.1 简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
4.1.2 计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。
供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(15版中国药典公示稿)
胰酪大豆胨 琼脂培养基 和胰酪大豆 胨液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时间不超过 3 天，接种 量不大于 100cfu
胰酪大豆胨 琼脂培养基 / 胰酪大豆 胨液体培养 基 （ MPN 法），培养 温 度 30 ～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 3 天，接种量 不大于 100cfu
计数培养基适用性检查 计数方法适用性试验
试验菌株
试验菌液 的制备
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus) 〔CMCC(B)26 003)〕
胰酪大豆 胨琼脂培 养基或胰 酪大豆胨 液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时 间 18 ～ 24 小时
获得丰富
的孢子
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，
检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学
特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表 1。
胰酪大豆胨 琼脂培养基 （ MPN 法 不 适用），培 养温度 30～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 5 天，接种量 不大于 100cfu
沙氏葡萄 糖琼脂培 养基，培养 温度 20～ 25℃，培养 时间不超 过 5 天，接 种量不大 于 100cfu
沙氏葡萄 胰酪大豆胨 沙 氏 葡 萄 胰酪大豆胨 沙氏葡萄
糖琼脂培 琼 脂 培 养 糖 琼 脂 培 琼脂培养基 糖琼脂培
黑曲霉
养基或马 基，培养温 养基，培养 （ MPN 法 不 养基，培养
非无菌产品微生物限度检査指导原则
中国药典2015年版性项下的有关内容对准确度进行评价。
2.精密度微生物定量检验的精密度是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度，通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，也可以采用其他适宜的方式。
精密度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，齒悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于l O cfu/m l)。
每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。
每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。
一般情况下，可以接受的相对标准偏差(R S D)应不大于35%。
不考虑特殊的检验结果，替代方法的相对标准偏差（R S D)应不大于药典方法。
例如，药典菌落计数平皿法其可接受的相对标准偏差（R S D)与含菌浓度的关系见表2。
表2不同含蔺浓度下预期的相对标准偏差cfu/皿预期RSD<10<35%10 〜30<25%30 〜300<15%3.专属性微生物定量检验的专属性是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。
例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。
专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法，从而确认替代方法的适用性。
当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时(如不需要增菌或在1〜50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。
4.定量限微生物定量检验的定量限是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量。
由于无法得到含有已知微生物数量的实验样品，因此，在定量限验证时，应选择在检验范围内至少5个菌浓度，每个浓度重复取样测定不少于5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。
2015版微生物限度检查方法验证方案
验证文件扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司目录一、验证概述 (2)1.验证对象 (2)2.验证原因 (2)3.验证目的 (2)4.验证要求 (2)二、验证组织机构和职责 (3)1.职责 (3)2.组织机构 (4)三、验证风险评估及范围 (6)1.严重性（S） (6)2.可能性（O） (7)3.可检测性（D） (8)4.风险优先数量等级判定（RPN） (9)四、验证实施计划 (35)五、验证准备 (36)1.验证依据 (36)2.验证条件 (36)六、验证内容 ......................................... 错误!未定义书签。
七、验证异常情况处理 (54)八、验证结论 (55)九、再验证周期 (56)十、附件 (56)一、验证概述1.验证对象本次验证的对象为阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查法。
2.验证原因对阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查法进行适用性验证。
3.验证目的确认阿戈美拉汀片（25mg)微生物限度检查法的可靠性。
4.验证要求验证过程需严格按方案中规定的步骤进行。
对于验证过程中出现的所有偏差，应查明原因并得到有效处理后，验证方可进入下一步骤。
二、验证组织机构和职责1.职责1.1.质量受权人—验证文件的批准。
—组织验证工作的实施及各部门的协调，保证验证工作有序的进行。
1.2.质量管理部—现场监督保证整个操作过程按照验证计划进行。
—负责验证方案的审核，及操作过程中对验证文件修订的审核工作。
—验证文件的归档工作。
—按照验证方案要求对操作过程中的样品抽样检测。
—涉及到的仪器仪表的校验，以及一些相关的化验工作。
1.3.质量控制实验室—负责验证文件的起草工作。
—负责验证文件的审核工作。
—验证方案起草人员现场对操作过程进行指导。
—对验证实施过程中资料和数据进行汇总并完成验证报告。
—需要时与相关部门的协调工作。
1.4.供应部按照验证物资采购计划进行物资采购。
2.组织机构2.1验证领导小组2.2.验证实施小组三、验证风险评估及范围根据SOP6-00001《验证管理规程》对验证的相关要求，对检测过程中可能影响检测结果的因素进行风险分析。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。
(3)．“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml 分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
2.3用过的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。
微生物限度检查操作规程中国药典15版四部通则
霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8.附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。
(3)．“无”为标准依据或无相应规定。
据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12）、培养皿（∮9 ）、量筒（100 ）、试管（18×180）及塞、吸管（1分度0.01，10 分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于12%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
2.3用过的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。
用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。
2015年药典通则1105非无菌产品微生物限度检查
通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法）。
MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。
供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
表1试验菌液的制备和使用试验菌株试验菌液的制备黑曲霉养基或马铃薯葡萄脂培养基，培养脂培养基，培养培养基，培养温度养基（MPN法不适（Aspergillus 糖琼脂培养基，培温度20〜温度20〜30〜35℃,培养用），培养温度30〜niger）养温度20〜25℃,25℃,培养时间25℃,培养时间时间不超过5天，35℃,培养时间不超（CMCC（F）98 培养时间5〜7天，不超过5天，接不超过5天，接接种量不大于过5天，接种量不大003〕或直到获得丰富的种量不大于种量不大于100cfu 于 100cfu抱子100cfu 100cfu 检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
2015年药典通则1105非无菌产品微生物限度检查
通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法）。
MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。
供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
表1试验菌液的制备和使用注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
2015年版微生物限度检验操作规程资料
青岛**有限公司文件目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。
范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
责任品管部微生物限度检验人员内容概述：本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表1。
4.2菌液制备按表1规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
4.4培养基适用性检查按照表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
1106控制菌检查
胰酪大豆胨液体培养基（大肠） 30~35℃培养18小时 1ml 麦康凯肉汤 42~44℃培养24小时 麦康凯琼脂培养基 30~35℃培养18小时 与阳性对照相比，菌落形态一 致 ，阳性对照计数不大于100cfu。
方法适用性和供试品检查—大肠埃希菌
讨论： （1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方
肠道菌增菌液体培养基 30~35℃培养24~48小时 紫红胆盐葡萄糖琼脂 30~35℃培养18~24小时
注：（1）+代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生 长； -代表紫红单眼葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。 VRBA：有菌落生长，检出耐胆盐革兰阴性菌 ，根 （2）若量减少10倍（如0.01g或0.01ml，0.001g或 2 据各培养管检查结果，查表得耐胆盐革兰阴性 0.00供试品1ml，0.0001g或0.0001ml， 10cm 样品）， 则每1g（1ml）供试品中可能的菌数（N）应相应增加10 菌的可能菌数。 倍。
方法适用性和供试品检查—沙门菌
检查方法 10g、10ml、 10cm2样品 方法适用性 10g、10ml、 10cm2样品
胰酪大豆胨液体培养基 30~35℃培养18~24小时 0.1ml RV沙门菌增菌液体培养 30~35℃培养18~24小时 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板 30~35℃培养18~48小时
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假设
方法适用性和供试品检查-耐胆盐革兰阴性菌
讨论：
（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活 性。 （2）试验过程中第一步供试品加入胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂预培养 是使待检菌“充分恢复”，但不增殖才能保证定量结果的准确；实际操作过程 中如何保证“供试品中的细菌充分恢复但不增殖” 还有待进一步实践摸索。 （3）肠道菌增菌液体培养基（牛胆盐） （4）肠道菌增菌液体培养基在培养耐胆盐革兰阴性菌时，会出现变色和不变 色两种情况。变色可能是由菌体大量增殖或其产生的初级和次级代谢产物影响 到该培养基的pH值进而引起亮绿发生变色反应。耐胆盐革兰阴性菌中大部分是 产酸的，会引起培养基颜色变化，（加入大肠试验是否变色）但也有不产酸或 少产酸的（如铜绿假单胞菌）不会引起培养基变色。虽然该培养基会时而发生 指示特性，但考虑到①ICH中对颜色指示功能未作要求；②耐胆盐革兰阴性菌 包含细菌种类繁多，产酸能力差异大，颜色的改变也不统一，不宜统一要求； ③中成药本身颜色较深，可能会掩盖培养基颜色，影响颜色观察；等因素在修 订时未加入该培养基的指示功能。试验中无论培养基浑浊与澄清，均应做分离 培养、染色、镜检。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。
(1)．“—”为不得检出。
(2)．目测霉变者以不合格论。
说明：1．“—”为每100 cm中不得检出。
2．目测霉变者以不合格论。
3．“无”为标准依据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
《中国药典》2015年版控制菌检查法实例
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数 不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检 出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌 应小于102cfu/g。
《中国药典》2015年版----控制菌检查法实例
中国药典2015年版
1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
• 计数培养基适用性检查 • 供试品计数方法适用性试验
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
• 培养基适用性检查 • 控制菌检查方法适用性试验
1107 非无菌药品微生物限度标准
• 沙，取10g或10mL供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法适用性试验确认）的TSB中
试验菌
• 按微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株 • 耐胆盐革兰阴性菌的试验菌两种：铜绿假单胞菌、大肠埃希菌。
适用性 试验
• 试验组（样+菌），阳性组（菌），阴性
• 取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；
与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
培养基抑制能 力检查
• 分别接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基 中，在规定的温度和培养时间下，试验菌应不得生长。
培养基指示特 性检查
• 用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对 照培养基平板上，在规定的温度和培养时间下，被检培养基
特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 指示能力
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通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时。
上述培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24 小时内使用。
生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
培养基适用性检查控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。
控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。
各培养基的检查项目及所用的菌株见表1。
表1 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu 的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
固体培养基促生长能力检查用涂布法分别接种不大于100cfu 的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
培养基抑制能力检查接种不少于100cfu 的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。
培养基指示特性检查用涂布法分别接种不大于100cfu 的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
控制菌检查方法适用性试验供试液制备按下列“供试品检查”中的规定制备供试液。
试验菌根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时,采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。
适用性试验按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu 的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,在最后一次冲洗液中加入试验菌,过滤后,注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。
依相应的控制菌检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。
结果判断上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性[见非无菌产品微生物检查：微生物计数法中的“抗菌活性的去除或灭活”]，并重新进行方法适用性试验。
如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。
供试品检查供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。
阳性对照试验阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加量应不大于100cfu。
阳性对照试验应检出相应的控制菌。
阴性对照试验以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。
如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
耐胆盐革兰阴性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)供试液制备和预培养取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”制成1：10 供试液，混匀，在20～25℃培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时）。
定性试验除另有规定外，取相当于1g 或1mL 供试品的上述预培养物接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30～35℃培养24～48 小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～24 小时。
如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。
定量试验选择和分离培养取相当于0.1g、0.01g 和0.001g（或0.1mL、0.01mL 和0.001mL）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30～35℃培养24～48 小时。
上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～24 小时。
结果判断若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。
根据各培养管检查结果，从表2 查1g 或1ml 供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。
表2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N）注：⑴＋代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；－代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。
⑵若供试品量减少10 倍（如0.01g 或0.01ml，0.001g 或0.001ml，0.0001g 或0.0001ml），则每1g(或1mL)供试品中可能的菌数（N）应相应增加10 倍。
大肠埃希菌(Escherichia coli)供试液制备和增菌培养取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”制成1：10 供试液。
取相当于1g 或1mL 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24 小时。
选择和分离培养取上述培养物1mL 接种至100mL 麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48 小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72 小时。
结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
沙门菌（Salmonella）供试液制备和增菌培养取10g 或10mL 供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24 小时。
选择和分离培养取上述培养物0.1mL 接种至10mL RV 沙门增菌液体培养基中，30～35℃培养18～24 小时。
取少量RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48 小时。
沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。
用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24 小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。
结果判断若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验, 确证是否为沙门菌。
如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）供试液制备和增菌培养取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”制成1：10 供试液。
取相当于1g 或1mL 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定的）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。
30～35℃培养18～24 小时。
选择和分离培养取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72 小时。
取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其它适宜方法进一步鉴定。
氧化酶试验将洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1％二盐酸N, N -二甲基对苯二胺试液，在30 秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。
结果判断若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验, 确证是否为铜绿假单胞菌。
如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）供试液制备和增菌培养取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”制成1：10 供试液。
取相当于1g 或1mL 供试品的供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。