血清蛋白电泳课件
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5.9*10-5
α1-球蛋白 5.06
20万
5.1*10-5
α2-球蛋白 5.06
30万
4.1*10-5
β-球蛋白 5.12
9万～15万 2.8*10-5
γ-球蛋白 6.86～7.30 15.6万～30万 1.0*10-5
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13
电泳结果示意图
γ
β α2 α1 清蛋白
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14
染色时染料与蛋白质特异结合而不与醋纤膜结 合，染色深浅与蛋白质的量成正比
血清蛋白电泳
(Serum Protein Electrophoresis)
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1
血清和血浆
• 血清:是指离体的血液经过自然凝固而析出的液体 部分. 血浆:是指离体并经过抗凝的血液经过离心沉淀后 的上清部分. 血清中无纤维蛋白原
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2
简介
人类血液中有125种以上蛋白质成分。 白蛋白、脂蛋白、抗体、补体、凝血酶原和
❖按支持介质的不同：纸电泳、醋酸纤维薄膜 电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电 泳
❖按支持介质形状不同：薄层电泳、板电泳和 柱电泳
❖按用途不同：分析电泳、制备电泳、定量免 疫电泳和连续制备电泳。
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8
影响电泳的因素
在电泳中,电场,带电粒子和促使带电粒子移 动的介质是产生电泳的三大要素.因而,影 响电泳的主要因素有：
❖缺点：有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容
易增大，当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发， 造成蛋白质分子变性破坏。
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24
临床意义
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25
蛋白质组分 白蛋白
α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白
丽春红S染色参考范围
g/L 35～52 1.0～4.0 4.0～8.0 5.0～10.0 6.0～13.0
蒸发薄膜与滤纸桥接触不良 薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行 缓冲液变质；样品不新鲜 CAM质量不高等 电渗现象
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23
评价
❖优点：CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，分
辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷； CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰， 既易比色定量，又易透明后进行光密度扫描。
染色一段时间后脱色，将各蛋白区带剪下，经 脱色、比色即可计算出各蛋白质组分的相对百 分数。
如同时测定出总蛋白浓度，还可计算出各蛋白 组分的绝对浓度
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15
正常血清电泳扫描图谱
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16
试剂
缓冲液：巴比妥缓冲液（pH8.6 ） 染色液：丽春红S染色液 漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液 洗脱液：0.1mol/LNaOH溶液
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17
操作
准备 ➢ 电泳槽准备 ➢ CAM的准备 点样 吸3-5μl血清均匀点于CAM无光泽面 电泳 无光泽面朝下，点样侧置于负极端，通电 染色 将薄膜条浸入丽春红S染色液，染5-10min 漂洗
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18
醋纤膜规格及点样示意图
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19
定量
取试管6支，在白蛋白管内加入0.1mol/L NaOH 液6ml，其余各管加入3ml，将各蛋白区带剪下 分别置于各试管中，另从空白背景剪一块平均大 小的膜条置于空白管中，37℃10-20min
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6
电泳用于分离物质的原理
COO╱ + H+ Pr ←————→ ╲ + OH-
NH2
COO-
COOH
╱ + H+ ╱
Pr ←————→ Pr
╲ + OH- ╲
NH3+
NH3+
PH>PI
PH=PI
PH<PI
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7
电泳分类
❖按分离的原理不同：区带电泳、自由界面电 泳、等速电泳、等电聚焦电泳
占总蛋白的百分数(%) 57～68 1.0～5.7 4.9～11.2 7.0～13.0 9.8～18.2
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21
注意事项
通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM，以 防触电
缓冲液液面要保证一定高度 标本：血清应新鲜，不得溶血 染料：对蛋白质的各组分亲和力相同，水
溶性好，稳定，吸光度敏感，形成的染料 蛋白质复合物稳定且易洗脱比色
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22
注意事项
电泳后区带拖尾、各区带分开不明显原因： 点样过多 点样不均匀、不整齐 样品触及薄膜边缘；薄膜过湿，样品扩散； 薄膜未完全浸透或温度过高导致干燥或水分
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11
Leabharlann Baidu理
在 pH8.6碱性环境，血清蛋白均带负电荷， 在电场中向正极移动
各种蛋白质pI不同，带电荷量有差异 蛋白质的分子大小与分子形状不相同 带电荷多、分子量小者，泳动较快；反之
则较慢
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12
蛋白质的等电点、分子量及迁移率
蛋白质名称
白蛋白
等电点
4.84
相对分子量
6.9万
电泳迁移率
凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、 α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、转铁蛋白和其 他微量蛋白等成分。
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3
历史
❖1809年，Pehce(俄国物理学家)首先发现 电泳现象
❖1937年，Tiselius(瑞典)制成界面电泳仪， 应用于蛋白质研究
❖1948年，Wieland和Fischer建立了滤纸电 泳法，奠定了区带电泳技术的基础
❖1959年，Raymond和Weintraub创建聚丙 烯酰胺凝胶电泳
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4
电泳和电泳技术
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行 分离分析的技术。
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5
应用
• 电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外,最主 要用于蛋白质,核酸等生物分子的研究.由于电泳法 设备简单,操作方便,具有高分辨率及选择性特点,已 成为医学检验中常用的技术.
向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加 0.3ml,以中和部分NaOH
用520nm比色，以空白管调零，读各管吸光度
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20
计算
设各部吸光度分别为AA、Aa1、Aa2、 Aβ、Aγ。吸光度总和（AT）为：
AT= AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ ❖ 白蛋白（%）＝（AA *2 AT）*100% ❖ a1-球蛋白（%） = （Aa1 AT）*100% ❖ ……
➢ 电场强度的影响 ➢ 溶液的pH值 ➢ 溶液的离子强度 ➢ 电渗 ➢ 温度、分子大小、吸附作用等
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9
电渗
液体对固体支持物的相对移动，由 缓冲液的水分子和支持介质的表面之间产 生的一种相关电荷所引起。如果电渗与电 泳方向相同，V变大；反之变小。
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血清蛋白醋酸 纤维素薄膜电泳
α1-球蛋白 5.06
20万
5.1*10-5
α2-球蛋白 5.06
30万
4.1*10-5
β-球蛋白 5.12
9万～15万 2.8*10-5
γ-球蛋白 6.86～7.30 15.6万～30万 1.0*10-5
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13
电泳结果示意图
γ
β α2 α1 清蛋白
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14
染色时染料与蛋白质特异结合而不与醋纤膜结 合，染色深浅与蛋白质的量成正比
血清蛋白电泳
(Serum Protein Electrophoresis)
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1
血清和血浆
• 血清:是指离体的血液经过自然凝固而析出的液体 部分. 血浆:是指离体并经过抗凝的血液经过离心沉淀后 的上清部分. 血清中无纤维蛋白原
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2
简介
人类血液中有125种以上蛋白质成分。 白蛋白、脂蛋白、抗体、补体、凝血酶原和
❖按支持介质的不同：纸电泳、醋酸纤维薄膜 电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电 泳
❖按支持介质形状不同：薄层电泳、板电泳和 柱电泳
❖按用途不同：分析电泳、制备电泳、定量免 疫电泳和连续制备电泳。
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8
影响电泳的因素
在电泳中,电场,带电粒子和促使带电粒子移 动的介质是产生电泳的三大要素.因而,影 响电泳的主要因素有：
❖缺点：有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容
易增大，当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发， 造成蛋白质分子变性破坏。
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24
临床意义
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25
蛋白质组分 白蛋白
α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白
丽春红S染色参考范围
g/L 35～52 1.0～4.0 4.0～8.0 5.0～10.0 6.0～13.0
蒸发薄膜与滤纸桥接触不良 薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行 缓冲液变质；样品不新鲜 CAM质量不高等 电渗现象
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23
评价
❖优点：CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，分
辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷； CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰， 既易比色定量，又易透明后进行光密度扫描。
染色一段时间后脱色，将各蛋白区带剪下，经 脱色、比色即可计算出各蛋白质组分的相对百 分数。
如同时测定出总蛋白浓度，还可计算出各蛋白 组分的绝对浓度
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15
正常血清电泳扫描图谱
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16
试剂
缓冲液：巴比妥缓冲液（pH8.6 ） 染色液：丽春红S染色液 漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液 洗脱液：0.1mol/LNaOH溶液
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17
操作
准备 ➢ 电泳槽准备 ➢ CAM的准备 点样 吸3-5μl血清均匀点于CAM无光泽面 电泳 无光泽面朝下，点样侧置于负极端，通电 染色 将薄膜条浸入丽春红S染色液，染5-10min 漂洗
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18
醋纤膜规格及点样示意图
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19
定量
取试管6支，在白蛋白管内加入0.1mol/L NaOH 液6ml，其余各管加入3ml，将各蛋白区带剪下 分别置于各试管中，另从空白背景剪一块平均大 小的膜条置于空白管中，37℃10-20min
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6
电泳用于分离物质的原理
COO╱ + H+ Pr ←————→ ╲ + OH-
NH2
COO-
COOH
╱ + H+ ╱
Pr ←————→ Pr
╲ + OH- ╲
NH3+
NH3+
PH>PI
PH=PI
PH<PI
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7
电泳分类
❖按分离的原理不同：区带电泳、自由界面电 泳、等速电泳、等电聚焦电泳
占总蛋白的百分数(%) 57～68 1.0～5.7 4.9～11.2 7.0～13.0 9.8～18.2
PPT学习交流
21
注意事项
通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM，以 防触电
缓冲液液面要保证一定高度 标本：血清应新鲜，不得溶血 染料：对蛋白质的各组分亲和力相同，水
溶性好，稳定，吸光度敏感，形成的染料 蛋白质复合物稳定且易洗脱比色
PPT学习交流
22
注意事项
电泳后区带拖尾、各区带分开不明显原因： 点样过多 点样不均匀、不整齐 样品触及薄膜边缘；薄膜过湿，样品扩散； 薄膜未完全浸透或温度过高导致干燥或水分
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11
Leabharlann Baidu理
在 pH8.6碱性环境，血清蛋白均带负电荷， 在电场中向正极移动
各种蛋白质pI不同，带电荷量有差异 蛋白质的分子大小与分子形状不相同 带电荷多、分子量小者，泳动较快；反之
则较慢
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12
蛋白质的等电点、分子量及迁移率
蛋白质名称
白蛋白
等电点
4.84
相对分子量
6.9万
电泳迁移率
凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、 α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、转铁蛋白和其 他微量蛋白等成分。
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3
历史
❖1809年，Pehce(俄国物理学家)首先发现 电泳现象
❖1937年，Tiselius(瑞典)制成界面电泳仪， 应用于蛋白质研究
❖1948年，Wieland和Fischer建立了滤纸电 泳法，奠定了区带电泳技术的基础
❖1959年，Raymond和Weintraub创建聚丙 烯酰胺凝胶电泳
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4
电泳和电泳技术
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行 分离分析的技术。
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5
应用
• 电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外,最主 要用于蛋白质,核酸等生物分子的研究.由于电泳法 设备简单,操作方便,具有高分辨率及选择性特点,已 成为医学检验中常用的技术.
向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加 0.3ml,以中和部分NaOH
用520nm比色，以空白管调零，读各管吸光度
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20
计算
设各部吸光度分别为AA、Aa1、Aa2、 Aβ、Aγ。吸光度总和（AT）为：
AT= AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ ❖ 白蛋白（%）＝（AA *2 AT）*100% ❖ a1-球蛋白（%） = （Aa1 AT）*100% ❖ ……
➢ 电场强度的影响 ➢ 溶液的pH值 ➢ 溶液的离子强度 ➢ 电渗 ➢ 温度、分子大小、吸附作用等
PPT学习交流
9
电渗
液体对固体支持物的相对移动，由 缓冲液的水分子和支持介质的表面之间产 生的一种相关电荷所引起。如果电渗与电 泳方向相同，V变大；反之变小。
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10
血清蛋白醋酸 纤维素薄膜电泳