血清蛋白电泳课件
合集下载
血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳ppt课件
6
五、实验操作
浸泡：将2×8 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光 泽面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液 的平皿中，浸泡30 min方可用于点样
点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液， 然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一 载玻片上滴一滴血清， 点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点 样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线
点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响 电泳区带分离效果
电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4～0.6mA/cm膜宽度。 电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散
操作过程为防止指纹污染，应戴手套
2019/9/4
9
七、实验思考
用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？ 电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？
血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
2019/9/4
1
一、实验目的
了解电泳技术的一般原理 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作
2019/9/4
2
二、实验原理
电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在 一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电 荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的 电泳迁移率不同，因此可使它们分离
影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强 度和电渗现象
影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状
按支持介质不同可将电泳分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶 电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳精品PPT课件
电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。
X越大，u越快。 支持物越短， X越大， u越快。
电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增 加，影响分离效果。
在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋 白质等样品发生热变性而无法分离
2021/1/1
8
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
实验四 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
cellulose acetate membrane electrophoresis
2021/1/1
1
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
【实验目的】
掌握电泳法分离血清蛋白质的原理 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义
γ
β α2 α1
清蛋白
2021/1/1
15
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
2.定性,定量
• 膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。 • 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。 • 可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。 • 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。
2021/1/1
16
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
2021/1/1
11
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
（二）支持物装置形式：
1．平板式电泳：支持物水平放置； 2．垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳； 3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳
2021/1/1
12
实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
(三)pH连续性： 1．连续pH 电泳：即整个电泳过程pH 保持不变，如常用的纸 电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。 2．非连续pH 电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电 泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等
血清蛋白电泳
蒸发薄膜与滤纸桥接触不良 薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行 缓冲液变质；样品不新鲜 CAM质量不高等 电渗现象
D
评价
❖ 优点：CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，
分辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便 快捷；CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背 景清晰，既易比色定量，又易透明后进行光密 度扫描。
D
先天性白蛋白缺陷型
主要特征：由于血清白蛋白 的显著降低，血清总蛋白也 随之降低，α1、α2球蛋白 明显增高，γ球蛋白也增高。 严重无白蛋白血症时，白蛋 白有时可降为零。 产生原因：本病是极少见的 先天性疾病，可能由于肝细 胞内白蛋白合成功能遗传性 缺陷或明显低下所致。
D
MM的电泳图谱
D
思考题
❖ 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳后为 何会有区带拖尾及分开不明显的情 况？如何避免？
D
57～68 1.0～5.7 4.9～11.2 7.0～13.0 9.8～18.2
D
各组分构成
Alb：白蛋白 α1：α1酸性糖蛋白；α1抗胰蛋白
酶；甲胎蛋白；高密度脂蛋白 α2：触珠蛋白；铜兰蛋白；α2巨球蛋白；
α脂蛋白 β：转铁蛋白；补体系统；β脂蛋白 γ：IgG；IgM；IgA；IgD；IgE； CRP
❖ 1959年，Raymond和Weintraub创建聚 丙烯酰胺凝胶电泳
D
电泳和电泳技术
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行 分离分析的技术。
D
应用
• 电泳技术除了用于小分子物质的分离分析 外,最主要用于蛋白质,核酸等生物分子的研 究.由于电泳法设备简单,操作方便,具有高分 辨率及选择性特点,已成为医学检验中常用 的技术.
D
评价
❖ 优点：CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，
分辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便 快捷；CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背 景清晰，既易比色定量，又易透明后进行光密 度扫描。
D
先天性白蛋白缺陷型
主要特征：由于血清白蛋白 的显著降低，血清总蛋白也 随之降低，α1、α2球蛋白 明显增高，γ球蛋白也增高。 严重无白蛋白血症时，白蛋 白有时可降为零。 产生原因：本病是极少见的 先天性疾病，可能由于肝细 胞内白蛋白合成功能遗传性 缺陷或明显低下所致。
D
MM的电泳图谱
D
思考题
❖ 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳后为 何会有区带拖尾及分开不明显的情 况？如何避免？
D
57～68 1.0～5.7 4.9～11.2 7.0～13.0 9.8～18.2
D
各组分构成
Alb：白蛋白 α1：α1酸性糖蛋白；α1抗胰蛋白
酶；甲胎蛋白；高密度脂蛋白 α2：触珠蛋白；铜兰蛋白；α2巨球蛋白；
α脂蛋白 β：转铁蛋白；补体系统；β脂蛋白 γ：IgG；IgM；IgA；IgD；IgE； CRP
❖ 1959年，Raymond和Weintraub创建聚 丙烯酰胺凝胶电泳
D
电泳和电泳技术
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行 分离分析的技术。
D
应用
• 电泳技术除了用于小分子物质的分离分析 外,最主要用于蛋白质,核酸等生物分子的研 究.由于电泳法设备简单,操作方便,具有高分 辨率及选择性特点,已成为医学检验中常用 的技术.
血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳课件
血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
5
五、实验操作
➢浸泡：将2×8 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光 泽面距短边一端1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液 的平皿中，浸泡30 min方可用于点样
➢点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液， 然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一 载玻片上滴一滴血清， 点样器（用盖玻片的一边）在血清上蘸一下（可来回移动一次），再将点 样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线
一、实验目的
✓了解电泳技术的一般原理 ✓学习醋酸纤维薄膜电泳的操作
血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
1
二、实验原理
➢ 电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在 一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电 荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的 电泳迁移率不同，因此可使它们分离
则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为 120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小
醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术，它具有微量、快速、 简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点
本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清 蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于 氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。 以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染 色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、 β-及γ-球蛋白
➢电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝 下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。 通电，调节电压至160 V，电流强度为0.4～0.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约 25 min
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白课件
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及 γ-球蛋白，6为点样原点
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。 此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
⑹透明及保存 透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发而影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。 透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液体石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易展平。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
② 电泳槽的准备 根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。 在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。 滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。 ③ 电极槽的平衡 用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15-20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
③透明液：临用前配制。 甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 ④保存液：液体石蜡。 ⑤定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）： 称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。
*
图3-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及 γ-球蛋白，6为点样原点
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。 此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
⑹透明及保存 透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发而影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。 透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液体石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易展平。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
② 电泳槽的准备 根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。 在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。 滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。 ③ 电极槽的平衡 用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15-20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
*
③透明液：临用前配制。 甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 ④保存液：液体石蜡。 ⑤定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）： 称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchangppt课件
3. 将梳子轻轻取出，让F液进入梳子形成的加样槽中， 准备加样品。
加样
加样:加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽 中间位置加样，针尖不要扎破下面的胶面。 加样量:10 ul -50 ul
电泳
1)加样完毕后，将电泳槽盖好盖，与电泳仪相连 接。 2)电泳仪电压调至最大，电流调到最小，打开电 泳仪开关进行恒流电泳。 3)浓缩胶:30mA(150V)
蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。
带电粒子的运动速度---
即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
μ = Q X /6πrη
Q 粒子所带电荷量 X 电场强度 r 粒子半径 η 介质的粘度
影响电泳速度的因素
1、内在因素: 样品自身性质
2、外在因素: 电场 缓冲液 支持介质
缓冲液 pH： 解离性质
进入pH8.9的分离胶中,各种蛋白质所带净电荷量 不同而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快;反 之,则慢.
实验操作
一、制胶(本实验的关键步骤)
1、安装玻板： 将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将
U型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的 短玻板盖在U型硅胶密封条上。
2、安装铁夹：用4只铁夹将安装好的玻板夹 好。
分离胶:40mA(200V) 加样后马上将微量加样器仔细冲洗多遍，以免血清 堵塞针尖。
观察并记录电泳现象
八、剥胶、染色、脱色
• 剥胶：拆开电泳槽装置，用竹镊子轻轻撬开两层 玻璃板，戴上一次性手套，用手和镊子将分离胶 剥离到染色液盘内，染色15分钟。
• 脱色： 将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色 液内，脱色三次，每次10分钟（每次更换新鲜脱 色液80-100ml），脱色时在摇床上摇。
当电者方向相反时，会减慢颗粒泳 动速度。 • 分子筛：是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小，则颗粒在
加样
加样:加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽 中间位置加样，针尖不要扎破下面的胶面。 加样量:10 ul -50 ul
电泳
1)加样完毕后，将电泳槽盖好盖，与电泳仪相连 接。 2)电泳仪电压调至最大，电流调到最小，打开电 泳仪开关进行恒流电泳。 3)浓缩胶:30mA(150V)
蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。
带电粒子的运动速度---
即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
μ = Q X /6πrη
Q 粒子所带电荷量 X 电场强度 r 粒子半径 η 介质的粘度
影响电泳速度的因素
1、内在因素: 样品自身性质
2、外在因素: 电场 缓冲液 支持介质
缓冲液 pH： 解离性质
进入pH8.9的分离胶中,各种蛋白质所带净电荷量 不同而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快;反 之,则慢.
实验操作
一、制胶(本实验的关键步骤)
1、安装玻板： 将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将
U型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的 短玻板盖在U型硅胶密封条上。
2、安装铁夹：用4只铁夹将安装好的玻板夹 好。
分离胶:40mA(200V) 加样后马上将微量加样器仔细冲洗多遍，以免血清 堵塞针尖。
观察并记录电泳现象
八、剥胶、染色、脱色
• 剥胶：拆开电泳槽装置，用竹镊子轻轻撬开两层 玻璃板，戴上一次性手套，用手和镊子将分离胶 剥离到染色液盘内，染色15分钟。
• 脱色： 将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色 液内，脱色三次，每次10分钟（每次更换新鲜脱 色液80-100ml），脱色时在摇床上摇。
当电者方向相反时，会减慢颗粒泳 动速度。 • 分子筛：是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小，则颗粒在
蛋白质电泳分析PPT课件
蛋白质组学研究
蛋白质电泳分析在蛋白质组学研 究中具有重要作用，可用于分离 和鉴定蛋白质，揭示蛋白质的表
达模式和功能。
生物标志物发现
通过蛋白质电泳分析，可以发现 与疾病相关的生物标志物，有助
于疾病的早期诊用于药物靶点 的筛选和验证，以及药物作用机
制的研究，有助于新药研发。
绝对定量
通过灰度扫描电泳图谱中蛋白质条带， 可以计算出各蛋白质条带的相对含量。
通过标准品或已知浓度的蛋白质样品， 可以建立标准曲线，从而对未知浓度 的蛋白质样品进行绝对定量分析。
相对定量
通过比较不同样品中蛋白质条带的灰 度值或亮度，可以计算出各蛋白质的 相对表达量。
04
蛋白质电泳分析的优缺点
优点
03
蛋白质电泳分析结果解读
电泳图谱的解读
01
02
03
蛋白质分子量标准
电泳图谱中通常会有一条 蛋白质分子量标准，用于 参考和标定蛋白质的分子 量。
蛋白质条带位置
通过观察电泳图谱中蛋白 质条带的位置，可以判断 蛋白质的迁移率和分子量 大小。
蛋白质表达量
通过比较不同样品中蛋白 质条带的亮度或密度，可 以判断蛋白质的表达量。
在食品安全和检测领域的应用前景
食品成分分析
蛋白质电泳分析可用于食品中蛋白质的鉴定和含 量测定，确保食品质量和安全。
污染物检测
蛋白质电泳分析可以检测食品中的有害物质和污 染物，如农药残留、重金属等。
转基因食品检测
通过蛋白质电泳分析，可以检测转基因食品中的 外源蛋白质，保障消费者权益。
THANKS
感谢观看
蛋白质电泳分析PPT 课件
目录
• 蛋白质电泳分析概述 • 蛋白质电泳分析实验操作 • 蛋白质电泳分析结果解读 • 蛋白质电泳分析的优缺点 • 蛋白质电泳分析展望
血清蛋白电泳-醋纤电泳、圆盘电泳实用全套PPT
操作(cāozuò)中，注意控制染色和漂洗的时间 ，防止背景过深或某些区带太浅。
第十四页，共29页。
6.记录和分析实验结果(jiē guǒ) 漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上
的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置 进行描述、记录在实验本上，并判断分析其结果(jiē guǒ)。
第十五页，共29页。
聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
第二十页，共29页。
第二十一页，共29页。
三、实验(shíyàn)器材 与试剂
1.实验材料(cáiliào)：正常人血清
2.实验器材：圆盘电泳槽、电泳仪、玻璃管（ 10cm×0.6cm）、洗耳球、培养皿、微量加样器、注 射器、小烧杯
第二十二页，共29页。
调节血浆pH值,维持酸碱平衡 运输营养物质,代谢物,
第十六页，共29页。
注意事项
1、醋酸纤维素薄膜一定要充分(chōngfèn)浸透后才能点样。点样后电泳 槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。 2、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影 响电泳区带分离效果。 3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 4、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 5、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再 取薄膜，以免触电。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易 区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。
第二十六页，29页。
4.电泳 接通(jiē tōnɡ)电源，上负下正，调节电流3mA/管，电压260V-280V，待示踪 染料离管下口0.5cm时切断电源。
第二十七页，共29页。
第十四页，共29页。
6.记录和分析实验结果(jiē guǒ) 漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上
的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置 进行描述、记录在实验本上，并判断分析其结果(jiē guǒ)。
第十五页，共29页。
聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
第二十页，共29页。
第二十一页，共29页。
三、实验(shíyàn)器材 与试剂
1.实验材料(cáiliào)：正常人血清
2.实验器材：圆盘电泳槽、电泳仪、玻璃管（ 10cm×0.6cm）、洗耳球、培养皿、微量加样器、注 射器、小烧杯
第二十二页，共29页。
调节血浆pH值,维持酸碱平衡 运输营养物质,代谢物,
第十六页，共29页。
注意事项
1、醋酸纤维素薄膜一定要充分(chōngfèn)浸透后才能点样。点样后电泳 槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。 2、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影 响电泳区带分离效果。 3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。 4、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。 5、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再 取薄膜，以免触电。 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易 区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。
第二十六页，29页。
4.电泳 接通(jiē tōnɡ)电源，上负下正，调节电流3mA/管，电压260V-280V，待示踪 染料离管下口0.5cm时切断电源。
第二十七页，共29页。
血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳ppt课件
醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图
11
4.电泳：红正黑负。 电压120 V。 电泳时间约40 ~ 50 min。
5.染色：氨基黑10B, 染色1-2 min. 6.脱色：2个表面皿，装入漂洗液，依次漂去多余染
料，直到背景漂白为止。
12
五、结果与分析
1.定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。
2.定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法
2. 点样：毛面向上，用点样器，在距膜一端约1.5 cm 处，点加3-5 μL待分离血清。注意取样适量、均匀； 血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。
1.5cm
10
3. 搭桥：首先将双层纱布铺好，分别放置于电泳槽两 端，其下端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄膜 光面向上平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的方向， 点样的一端位于负极，点样线不能搭在滤纸上。
1
实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
2
一、实验目的
1.了解电泳的基本原理； 2.掌握电泳分离蛋白质的原理； 3.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法。
3
二、实验原理
1.电泳的基本原理 电泳——是带电粒子在电场中向其电性相反的电极 发生移动的现象。 利用电泳技术可进行物质分离、纯化及鉴定。
4
影响带电粒子电泳速率的因素： 1. 带电量 F=qE 2. 分子量 3. 形状
13
六、临床意义
血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分 析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾 病参考。
1．肝硬化时清蛋白明显降底，α2和β-球蛋白无显 著变化，而γ球蛋白可显著增加。正常生理情况，清蛋 白与球蛋白之比约为1.5~2.5∶1，而肝硬化时有可能出 现清∶球＜1的情况，常称为清、球比例倒置，说明肝 功能严重受损。
11
4.电泳：红正黑负。 电压120 V。 电泳时间约40 ~ 50 min。
5.染色：氨基黑10B, 染色1-2 min. 6.脱色：2个表面皿，装入漂洗液，依次漂去多余染
料，直到背景漂白为止。
12
五、结果与分析
1.定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。
2.定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法
2. 点样：毛面向上，用点样器，在距膜一端约1.5 cm 处，点加3-5 μL待分离血清。注意取样适量、均匀； 血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。
1.5cm
10
3. 搭桥：首先将双层纱布铺好，分别放置于电泳槽两 端，其下端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄膜 光面向上平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的方向， 点样的一端位于负极，点样线不能搭在滤纸上。
1
实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
2
一、实验目的
1.了解电泳的基本原理； 2.掌握电泳分离蛋白质的原理； 3.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法。
3
二、实验原理
1.电泳的基本原理 电泳——是带电粒子在电场中向其电性相反的电极 发生移动的现象。 利用电泳技术可进行物质分离、纯化及鉴定。
4
影响带电粒子电泳速率的因素： 1. 带电量 F=qE 2. 分子量 3. 形状
13
六、临床意义
血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分 析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾 病参考。
1．肝硬化时清蛋白明显降底，α2和β-球蛋白无显 著变化，而γ球蛋白可显著增加。正常生理情况，清蛋 白与球蛋白之比约为1.5~2.5∶1，而肝硬化时有可能出 现清∶球＜1的情况，常称为清、球比例倒置，说明肝 功能严重受损。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
➢ 电场强度的影响 ➢ 溶液的pH值 ➢ 溶液的离子强度 ➢ 电渗 ➢ 温度、分子大小、吸附作用等
PPT学习交流
9
电渗
液体对固体支持物的相对移动，由 缓冲液的水分子和支持介质的表面之间产 生的一种相关电荷所引起。如果电渗与电 泳方向相同，V变大；反之变小。
PPT学习交流
10
血清蛋白醋酸 纤维素薄膜电泳
❖按支持介质的不同：纸电泳、醋酸纤维薄膜 电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电 泳
❖按支持介质形状不同：薄层电泳、板电泳和 柱电泳
❖按用途不同：分析电泳、制备电泳、定量免 疫电泳和连续制备电泳。
PPT学习交流
8
影响电泳的因素
在电泳中,电场,带电粒子和促使带电粒子移 动的介质是产生电泳的三大要素.因而,影 响电泳的主要因素有：
5.9*10-5
α1-球蛋白 5.06
20万
5.1*10-5
α2-球蛋白 5.06
30万
4.1*10-5
β-球蛋白 5.12
9万～15万 2.8*10-5
γ-球蛋白 6.86～7.30 15.6万～30万 1.0*10-5
PPT学习交流
13
电泳结果示意图
γ
β α2 α1 清蛋白
PPT学习交流
14
染色时染料与蛋白质特异结合而不与醋纤膜结 合，染色深浅与蛋白质的量成正比
❖1959年，Raymond和Weintraub创建聚丙 烯酰胺凝胶电泳
PPT学习交流
4
电泳和电泳技术
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行 分离分析的技术。
PPT学习交流
5
应用
• 电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外,最主 要用于蛋白质,核酸等生物分子的研究.由于电泳法 设备简单,操作方便,具有高分辨率及选择性特点,已 成为医学检验中常用的技术.
PPT学习交流
21
注意事项
通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM，以 防触电
缓冲液液面要保证一定高度 标本：血清应新鲜，不得溶血 染料：对蛋白质的各组分亲和力相同，水
溶性好，稳定，吸光度敏感，形成的染料 蛋白质复合物稳定且易洗脱比色
PPT学习交流
22
注意事项
电泳后区带拖尾、各区带分开不明显原因： 点样过多 点样不均匀、不整齐 样品触及薄膜边缘；薄膜过湿，样品扩散； 薄膜未完全浸透或温度过高导致干燥或水分
PPT学习交流
11
原理
在 pH8.6碱性环境，血清蛋白均带负电荷， 在电场中向正极移动
各种蛋白质pI不同，带电荷量有差异 蛋白质的分子大小与分子形状不相同 带电荷多、分子量小者，泳动较快；反之
则较慢
PPT学习交流
12
蛋白质的等电点、分子量及迁移率
蛋白质名称
白蛋白
等电点
4.84
相对分子量
6.9万
电泳迁移率
染色一段时间后脱色，将各蛋白区带剪下，经 脱色、比色即可计算出各蛋白质组分的相对百 分数。
如同时测定出总蛋白浓度，还可计算出各蛋白 组分的绝对浓度
PPT学习交流
15
正常血清电泳扫描图谱
PPT学习交流
16
试剂
缓冲液：巴比妥缓冲液（pH8.6 ） 染色液：丽春红S染色液 漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液 洗脱液：0.1mol/LNaOH溶液
❖缺点：有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容
易增大，当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发， 造成蛋白质分子变性破坏。
PPT学习交流
24
临床意义
PPT学习交流
25
蛋白质组分 白蛋白
α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白
丽春红S染色参考范围
g/L 35～52 1.0～4.0 4.0～8.0 5.0～10.0 6.0～13.0
凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、 α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、转铁蛋白和其 他微量蛋白等成分。
PPT学习交流
3
历史
❖1809年，Pehce(俄国物理学家)首先发现 电泳现象
❖1937年，Tiselius(瑞典)制成界面电泳仪， 应用于蛋白质研究
❖1948年，Wieland和Fischer建立了滤纸电 泳法，奠定了区带电泳技术的基础
蒸发薄膜与滤纸桥接触不良 薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行 缓冲液变质；样品不新鲜 CAM质量不高等 电渗现象
PPT学习交流
23
评价
❖优点：CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，分
辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷； CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰， 既易比色定量，又易透明后进行光密度扫描。
血清蛋白电泳
(Serum Protein Electrophoresis)
PPT学习交流ห้องสมุดไป่ตู้
1
血清和血浆
• 血清:是指离体的血液经过自然凝固而析出的液体 部分. 血浆:是指离体并经过抗凝的血液经过离心沉淀后 的上清部分. 血清中无纤维蛋白原
PPT学习交流
2
简介
人类血液中有125种以上蛋白质成分。 白蛋白、脂蛋白、抗体、补体、凝血酶原和
PPT学习交流
17
操作
准备 ➢ 电泳槽准备 ➢ CAM的准备 点样 吸3-5μl血清均匀点于CAM无光泽面 电泳 无光泽面朝下，点样侧置于负极端，通电 染色 将薄膜条浸入丽春红S染色液，染5-10min 漂洗
PPT学习交流
18
醋纤膜规格及点样示意图
PPT学习交流
19
定量
取试管6支，在白蛋白管内加入0.1mol/L NaOH 液6ml，其余各管加入3ml，将各蛋白区带剪下 分别置于各试管中，另从空白背景剪一块平均大 小的膜条置于空白管中，37℃10-20min
PPT学习交流
6
电泳用于分离物质的原理
COO╱ + H+ Pr ←————→ ╲ + OH-
NH2
COO-
COOH
╱ + H+ ╱
Pr ←————→ Pr
╲ + OH- ╲
NH3+
NH3+
PH>PI
PH=PI
PH<PI
PPT学习交流
7
电泳分类
❖按分离的原理不同：区带电泳、自由界面电 泳、等速电泳、等电聚焦电泳
向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加 0.3ml,以中和部分NaOH
用520nm比色，以空白管调零，读各管吸光度
PPT学习交流
20
计算
设各部吸光度分别为AA、Aa1、Aa2、 Aβ、Aγ。吸光度总和（AT）为：
AT= AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ ❖ 白蛋白（%）＝（AA *2 AT）*100% ❖ a1-球蛋白（%） = （Aa1 AT）*100% ❖ ……
占总蛋白的百分数(%) 57～68 1.0～5.7 4.9～11.2 7.0～13.0 9.8～18.2
PPT学习交流
9
电渗
液体对固体支持物的相对移动，由 缓冲液的水分子和支持介质的表面之间产 生的一种相关电荷所引起。如果电渗与电 泳方向相同，V变大；反之变小。
PPT学习交流
10
血清蛋白醋酸 纤维素薄膜电泳
❖按支持介质的不同：纸电泳、醋酸纤维薄膜 电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电 泳
❖按支持介质形状不同：薄层电泳、板电泳和 柱电泳
❖按用途不同：分析电泳、制备电泳、定量免 疫电泳和连续制备电泳。
PPT学习交流
8
影响电泳的因素
在电泳中,电场,带电粒子和促使带电粒子移 动的介质是产生电泳的三大要素.因而,影 响电泳的主要因素有：
5.9*10-5
α1-球蛋白 5.06
20万
5.1*10-5
α2-球蛋白 5.06
30万
4.1*10-5
β-球蛋白 5.12
9万～15万 2.8*10-5
γ-球蛋白 6.86～7.30 15.6万～30万 1.0*10-5
PPT学习交流
13
电泳结果示意图
γ
β α2 α1 清蛋白
PPT学习交流
14
染色时染料与蛋白质特异结合而不与醋纤膜结 合，染色深浅与蛋白质的量成正比
❖1959年，Raymond和Weintraub创建聚丙 烯酰胺凝胶电泳
PPT学习交流
4
电泳和电泳技术
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行 分离分析的技术。
PPT学习交流
5
应用
• 电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外,最主 要用于蛋白质,核酸等生物分子的研究.由于电泳法 设备简单,操作方便,具有高分辨率及选择性特点,已 成为医学检验中常用的技术.
PPT学习交流
21
注意事项
通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM，以 防触电
缓冲液液面要保证一定高度 标本：血清应新鲜，不得溶血 染料：对蛋白质的各组分亲和力相同，水
溶性好，稳定，吸光度敏感，形成的染料 蛋白质复合物稳定且易洗脱比色
PPT学习交流
22
注意事项
电泳后区带拖尾、各区带分开不明显原因： 点样过多 点样不均匀、不整齐 样品触及薄膜边缘；薄膜过湿，样品扩散； 薄膜未完全浸透或温度过高导致干燥或水分
PPT学习交流
11
原理
在 pH8.6碱性环境，血清蛋白均带负电荷， 在电场中向正极移动
各种蛋白质pI不同，带电荷量有差异 蛋白质的分子大小与分子形状不相同 带电荷多、分子量小者，泳动较快；反之
则较慢
PPT学习交流
12
蛋白质的等电点、分子量及迁移率
蛋白质名称
白蛋白
等电点
4.84
相对分子量
6.9万
电泳迁移率
染色一段时间后脱色，将各蛋白区带剪下，经 脱色、比色即可计算出各蛋白质组分的相对百 分数。
如同时测定出总蛋白浓度，还可计算出各蛋白 组分的绝对浓度
PPT学习交流
15
正常血清电泳扫描图谱
PPT学习交流
16
试剂
缓冲液：巴比妥缓冲液（pH8.6 ） 染色液：丽春红S染色液 漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液 洗脱液：0.1mol/LNaOH溶液
❖缺点：有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容
易增大，当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发， 造成蛋白质分子变性破坏。
PPT学习交流
24
临床意义
PPT学习交流
25
蛋白质组分 白蛋白
α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白
丽春红S染色参考范围
g/L 35～52 1.0～4.0 4.0～8.0 5.0～10.0 6.0～13.0
凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、 α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、转铁蛋白和其 他微量蛋白等成分。
PPT学习交流
3
历史
❖1809年，Pehce(俄国物理学家)首先发现 电泳现象
❖1937年，Tiselius(瑞典)制成界面电泳仪， 应用于蛋白质研究
❖1948年，Wieland和Fischer建立了滤纸电 泳法，奠定了区带电泳技术的基础
蒸发薄膜与滤纸桥接触不良 薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行 缓冲液变质；样品不新鲜 CAM质量不高等 电渗现象
PPT学习交流
23
评价
❖优点：CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，分
辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷； CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰， 既易比色定量，又易透明后进行光密度扫描。
血清蛋白电泳
(Serum Protein Electrophoresis)
PPT学习交流ห้องสมุดไป่ตู้
1
血清和血浆
• 血清:是指离体的血液经过自然凝固而析出的液体 部分. 血浆:是指离体并经过抗凝的血液经过离心沉淀后 的上清部分. 血清中无纤维蛋白原
PPT学习交流
2
简介
人类血液中有125种以上蛋白质成分。 白蛋白、脂蛋白、抗体、补体、凝血酶原和
PPT学习交流
17
操作
准备 ➢ 电泳槽准备 ➢ CAM的准备 点样 吸3-5μl血清均匀点于CAM无光泽面 电泳 无光泽面朝下，点样侧置于负极端，通电 染色 将薄膜条浸入丽春红S染色液，染5-10min 漂洗
PPT学习交流
18
醋纤膜规格及点样示意图
PPT学习交流
19
定量
取试管6支，在白蛋白管内加入0.1mol/L NaOH 液6ml，其余各管加入3ml，将各蛋白区带剪下 分别置于各试管中，另从空白背景剪一块平均大 小的膜条置于空白管中，37℃10-20min
PPT学习交流
6
电泳用于分离物质的原理
COO╱ + H+ Pr ←————→ ╲ + OH-
NH2
COO-
COOH
╱ + H+ ╱
Pr ←————→ Pr
╲ + OH- ╲
NH3+
NH3+
PH>PI
PH=PI
PH<PI
PPT学习交流
7
电泳分类
❖按分离的原理不同：区带电泳、自由界面电 泳、等速电泳、等电聚焦电泳
向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加 0.3ml,以中和部分NaOH
用520nm比色，以空白管调零，读各管吸光度
PPT学习交流
20
计算
设各部吸光度分别为AA、Aa1、Aa2、 Aβ、Aγ。吸光度总和（AT）为：
AT= AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ ❖ 白蛋白（%）＝（AA *2 AT）*100% ❖ a1-球蛋白（%） = （Aa1 AT）*100% ❖ ……
占总蛋白的百分数(%) 57～68 1.0～5.7 4.9～11.2 7.0～13.0 9.8～18.2