2020年病毒接种、收获尿囊液操作步骤
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
作者:非成败
作品编号:92032155GZ5702241547853215475102
时间:2020.12.13
病毒接种
1.选胚:首先,在照蛋间挑选出血管模糊,没有生命迹象的鸡胚。
2.标记注射点:接着用记号笔在气室上方约1mm处画线,在线的下方挑选
注射点,在挑选注射点时应注意避开主血管,避开鸡头。
3.打孔:打孔前先用碘酊在气室部位消毒,用打孔器在气室线上方打孔。注意:
孔不宜过大,否则会导致封蜡不完全,甚至将蜡油流进鸡胚内部。
4.注射病毒:用注射枪向每个鸡蛋孔内注射0.2ml病毒稀释液,注射时针头朝
向注射点方向,每次注射停留4~6s。
5.封蜡:注射完毕,用镊子夹取酒精棉沾上蜡油,进行鸡胚封蜡。
6.培养:将封蜡完成的鸡胚放入孵化箱中培养。孵化箱温度设置33~35℃,湿
度50%~70%,甲型流感病毒培养48~52小时,乙型流感病毒培养66~72
小时。
需准备的仪器试剂:
手电筒,记号笔,碘酊,棉签,量筒(稀释),酒精灯,废液瓶,打孔器,三脚架,
蜡块,连续注射器,一次性注射器,移液枪,移液枪枪头,镊子,纱布,打火机,
蓝盖瓶。
注意事项:
(1)、前一天将病毒原液拿至4℃冷库;
(2)、前一天准备好需要灭菌消毒的物品,高温高压灭菌,烘干;确定好参加实验人数,
准备好无菌服;
(3)、接种当天早上将接种所需生物安全柜开紫外杀菌;
收获尿囊液
1.鸡胚消毒:将培养好的鸡胚放入4℃冷库进行冷胚6h以上;首先,用0.1%
的新洁而灭溶液将鸡胚进行消毒,每次消毒1~2分钟。接着,在鸡胚的气室用碘酊消毒。
2.烙蛋:将经过消毒处理的鸡胚在烙蛋器上进行烙蛋。
3.收获:先用小镊子将壳膜撕破扒出气室,再用大镊子压住鸡头,同时用5ml
移液枪吸取尿囊液。收获的尿囊液应是澄清、微黄状。
4.保存:将收获的尿囊液放至6℃冷库保存。
需准备的仪器试剂:
新洁而灭溶液,碘酊,棉签,烙蛋器,废液瓶,镊子,5ml移液枪,5ml移液枪枪头,蓝盖瓶(数量由病毒原液体积决定)。
注意事项:
(1)、前一天准备好需要灭菌消毒的物品,高温高压灭菌,烘干;确定好参加实验人数,准备好无菌服;
(2)、收获当天早上将收获所需生物安全柜开紫外杀菌;
血凝滴度试验
1.稀释病毒液:取一块洁净的“96”孔血凝板,横向摆放。用微量移液器
(20—200ul)加入磷酸盐缓冲液100ul至第一孔,横向从第二孔开始,每孔均用微量移液器(5—50ul)加入磷酸盐缓冲液25ul直至第十二孔。
2.倍比稀释:在“U”型96孔血凝板的左侧标记样品名称,用微量移液器
(5—50ul)从第一孔内加入25ul病毒悬浮液吹打混匀,将病毒液稀释五倍。
取出25ul放到第二孔中,从第二孔开始倍比稀释,每孔吹打混匀,稀释到最后一孔弃掉25ul,此时的稀释倍数为1:10240。
3.阴性对照:在同一块“U”型96孔血凝板的最后一排,后三孔用25ul的磷
酸盐缓冲液替代供试品,作为阴性对照。
4.加鸡血:将1%鸡红细胞悬液倒入加样槽吹打混匀,开始从第十二列至第一
列每孔均用微量移液器(5-50μl)加入25μl的 1%鸡红细胞悬液,振荡均匀后置室温40分钟后观察结果。
5.结果计算:观察阴性对照,若红细胞于孔底形成一个小团,边缘光滑并有立体感,将板倾斜片刻,可见红细胞滑动呈泪滴状为“-”,则阴性对照成立。按照《流感病毒血凝滴度检测标准操作规程》观察每孔凝集状态,结果以“++”(++以数字2代之)为终点,以红细胞形成一个环状,四周有小凝集块者为“++”
亦即一个凝集单位,也就是说最高稀释度病毒能引起“++”号的红细胞凝集为终点,此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度简称血凝滴度。
影响血凝抑制实验的因素
1.红细胞悬液浓度:来源于不同个体鸡的红细胞,对抗原的敏感性不尽相同。因此实验时最好用3-4只未免疫鸡。配制红细胞时,红细胞浓度低,HI滴度就会下降;红细胞浓度高,HI滴度就会上升。有实验表明,红细胞浓度增加一倍,HI滴度就会上升20.7-0.9,因此,红细胞浓度以1%为宜。
2.抗原的稀释倍数:配制抗原时,浓度必须准确。当抗原浓度高时,(HI)抗体效价就下降;当抗原浓度抵时,(HI)抗体效价就上升。
3.实验用的稀释液(P BS):稀释液的pH值对实验有影响。稀释液的pH值5.8以下,红细胞容易产生自凝现象;pH值在7.8以上凝集图形易消失,也会造成实验误差。而pH值为7.0时,红细胞沉降最充分,图形最清晰,HI效价也最高,因此实验时用ph7.0-7.2的稀释液。
4.实验时的温度:实验时的温度,从4-37℃,随着温度上升,HA与HI滴度提高,但在37℃时,凝集的红细胞易洗脱;4℃以下红细胞易产生自凝,故操作常用18-22℃。
(以上所阐述的是实验室操作过程中存在的几点因素,在实际工作中,也存在着其他诸多原因,如采样的时间、采样的数量、以及由疫苗产生的影响等。)
流感病毒裂解疫苗生产工艺流程相关参数
作者:非成败
作品编号:92032155GZ5702241547853215475102 时间:2020.12.13