实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定

实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定

茚三酮显色法氨基酸是组成蛋白质的基本单位也是蛋白质的分解产物。植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。所以测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。一、原理氨基酸与茚三酮共热时能定量地生成二酮茚胺。该产物显示蓝紫色称为Ruhemans 紫。其吸收峰在570 nm 而且在一定范围内吸光度与氨基酸浓度成正比。氨基酸与茚三酮的反应分两步进行第一步氨基酸被氧化形成CO 2 、NH 3 和醛茚三酮被还原成还原型茚三酮第二步所形成的还原型茚

三酮与另一个茚三酮分子和一分子氨脱水缩合生成二酮茚–二酮茚胺Ruhemans 紫反应式如下在一定范围内反应体系颜色的深浅与游离氨基的含量成正比因此可用分光光度法测定其含量。二、实验材料、试剂与仪器设备一实验材料各种植物组织。二试剂1. 水合茚三酮试剂称取0.6 g 再结晶的茚三酮置烧杯中加入15 mL 正丙醇搅拌使其溶解。再加入30 mL 正丁醇及60 mL 乙二醇最后加入9 mL pH5.4 的乙酸–乙酸钠缓冲液混匀贮于棕色瓶置4 ℃下保存备用10 d 内有效。2. 乙酸–乙酸钠缓冲液pH 5.4 称取乙酸钠54.4 g 加入100 mL 无氨蒸馏水在电炉上加热至沸使体积蒸发至60 mL 左右。冷却后转入100 mL 容量瓶中加30 mL 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀

释至100 mL 。3. 标准氨基酸称取80 ℃下烘干的亮氨酸46.8 mg 溶于少量10 异丙醇中用10 异丙醇定容至100 mL 。取该溶液5 mL 用蒸馏水稀释至50 mL 即为含氨基氮5 μ g/mL 的标准氨基酸

溶液。4. 0.1 抗坏血酸称取50 mg 抗坏血酸溶于50 mL 无氨蒸馏水中随配随用。5. 10 乙酸。三仪器设备分光光度计分析天平研钵容量瓶试管移液管水浴锅三角瓶漏斗。三、实验步骤1. 样品制备取新鲜植物样品洗净、擦干并剪碎、混匀后迅速称取0.5 1.0 g 于研钵中加入5 mL 10 乙酸研磨匀浆后用蒸馏水稀释至100 mL 。混匀并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。2. 制作标准曲线取6 支20 mL 刻度试管按表27 – 1 操作。表27-1 制作游离氨基酸标准曲线各试剂量及操作程序试剂管号1 2 3 4 5 6 标准氨基酸mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮mL 3.0

3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸mL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 每管含氮量μ

g 0 1 2 3 4 5 加完试剂后混匀盖上大小合适的玻璃球置沸水中加热

15 min 取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去当呈现蓝紫色时用60 乙醇定容至20 mL 。混匀后用1 cm 光径比色皿在570 nm 波长下测定吸光度以吸光度为纵

坐标以含氮量为横坐标绘制标准曲线。 3. 样品测定吸取样品滤液1.0 mL 放入20 mL 干燥试管中加无氨蒸馏水1.0 mL 其他步骤与

制作标准曲线相同。根据样品吸光度在标准曲线上查得含氮量。四、结果计算按下式计算样品中氨基态氮的含量。式中C ——从标准曲线上查得的氨基态氮含量μg 。V T ——样品稀释总体积mL 。V S ——测定时样品体积mL 。W ——样品鲜重g 。思考题1. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物颜色都相同吗为什么2. 抗坏血酸在测定中的作用是什么【附注】1. 茚三酮重结晶的方法合格的茚

三酮应该是微黄色结晶若保管不当颜色加深或变成微红色必须重结晶后方可使用。其方法如下5 g 茚三酮溶于15 mL 热蒸馏水中加入0.25 g 活性炭轻轻摇动溶液太稠时可适量加水30 min 后用滤纸过滤滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出用干滤纸过滤再用1 mL 蒸馏水洗结晶一次置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。2. 茚三酮与氨基酸反应所生成的Ruhemans 紫在1 h 内保持稳定故稀释后尽快比色。3. 空气中的氧干扰显色反应的第一步。以抗坏血酸为还原剂可提高反应的灵敏度并使颜色稳定。但由于抗坏血酸也可与茚三酮反应使溶液颜色过深故应严格掌握加入抗坏血酸的量。4. 反应温度影响显色稳定性超过80 ℃溶液易褪色可在80 ℃水浴中加热并适当延长反应时间效果良好。5. 谷物籽粒等含蛋白质的样品可用酸水解法将蛋白质水解后用本法测定水解液中的氨基酸含量可计算出样品蛋白质含量。