实验八凝胶过滤分离高铁血红蛋白和高铁氰化钾
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
➢ 层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器
➢ 血红蛋白溶液 ➢ 交联葡聚糖G-25
➢ 0.4%
K➢3F氨e(基C萘N)酚6 磺酸试剂 ➢ 钼酸铵试剂 ➢ 15%三氯醋酸
➢ 0.1M磷酸缓冲液
实验步骤
凝胶的处理
G-25颗粒(5g)
蒸馏水室温溶胀
去除杂质
10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜)
装柱
层析管洗净、排出管中气泡
高铁血红蛋 白与高铁氰 化钾混合物
高铁氰化钾
➢ 透 析 法：
利用特制的半透膜把大小分子分开的 方法，截止分子量一般为一万
透析袋 浓缩的蛋白 混合样品
透析液
开始透析 处于平衡状态
临床应用： 血液透析
➢ 钼酸铵 +
氨基萘酚磺酸 +
磷酸盐
钼蓝（蓝色）
➢ 15%三氯醋酸+蛋白质
变性、沉淀
实验器材与试剂
收集红褐色的MetHb色带
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不能 进入珠内， 经珠之间缝 隙流出
凝胶过滤层析过程示意图
洗脱与收集
➢将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后， 用2~3倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶
➢ 用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中 的凝胶吹至小烧杯中回收
透析
将MetHb 洗脱液装 入透析袋
请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快 或太慢？
圆盘电泳的分子筛效应和凝胶过滤的分子筛 效应原理上有何不同？
➢ 实验项目 ➢ 实验原理 ➢ 试剂和器材 ➢ 操作方法（主要步骤） ➢ 结果分析 ➢ 思考题
预习
实验九 酶法测血清葡萄糖
实验八
凝胶过滤分离高铁血红蛋白 与高铁氰化钾
实验目的
了解凝胶层析的原理及应用
通过血红蛋白脱盐实验，初步掌 握凝胶层析技术
实验原理
➢ 凝胶过滤层析：
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作 用，根据被分离物质的分子大小不同来进 行分离，也称分子筛层析、排阻层析
单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型 凝胶的筛孔的大小不同。
透析后杯内 蒸馏水
试剂量
15滴
10滴
钼酸铵试剂
2滴
2滴
氨基萘酚磺酸试剂
3滴
3滴
反应结果
无
蓝色
➢ 蛋白质的鉴定
透析前杯内蒸馏水 透析后杯内蒸馏水
透析袋内溶液
试液量 40滴 40滴 10滴
15%三氯醋酸 20滴 20滴 5滴
反应结果
无 无
有沉淀
MetHb的相对分子量较大，直径大于 凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在 凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较 短，移动速度快，首先流出
交联葡聚糖的凝胶颗粒
分子筛效应：
大分子在前，小分子在后
Hb ﹢ K3Fe(CN)6
MetHb
高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色， Mw=64500)， 完全排阻
高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色， Mw=327.25) ，可完全进入凝胶颗粒网孔内， 从而达到分离的目的
交联葡聚糖 高铁血红蛋白
试液量 40滴
40滴
10滴
15%三氯醋酸 反应结果
20滴
？
20滴
？
5滴
？
注意事项
装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡 或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者 重新装柱，保持柱床面平整； 洗脱时流速不可太快或太慢； 透析袋中的液体不可装满，否则会将 透析袋胀破。
实验结果
➢ 磷酸盐的鉴定
透析前杯内 蒸馏水
关闭出口
固定在铁架上
加入缓冲液没过砂芯
关闭出口
将凝胶缓缓注入管内
打开出口
自然沉降至柱床高度达20cm以上 不可露出创面 盖滤纸
装柱要求: ➢ 连续
➢ 均匀 ➢ 无气泡 ➢ 无分层 ➢ 床面平整
平衡
层析柱稳定后接储液瓶，打开 出口，用两倍于床体积的缓冲液洗 脱平衡(5-10min )，不可露出床面， 关闭出口
将透析袋 口用止水 夹密封
将透析袋悬 入装有蒸馏 水的烧杯中
打开磁力搅 拌器，透析 30分钟
鉴定
➢ 磷酸盐的鉴定
试剂量 钼酸铵试 剂
透析前杯ห้องสมุดไป่ตู้15滴 2滴 内蒸馏水
透析后杯 10滴 2滴 内蒸馏水
氨基萘酚磺 酸试剂 3滴
3滴
反应结 果 ？
？
➢ 蛋白质的鉴定
透析前杯内蒸 馏水
透析后杯内蒸 馏水
透析袋内溶液
加样
放掉多余缓冲液至刚露出床面
准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6 (8滴)混合液
自距床面1mm高处靠壁缓慢、均匀加入
打开出口
至液面降至与凝胶面相平
洗脱与收集
缓慢加入样品量体积的洗脱液 （不冲破胶面）
打开出口
至洗脱液刚好流入床面
关闭出口
再加洗脱液至3-4cm高
连接储液瓶 调节活塞（1滴/5秒）进行洗脱
K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直 径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶 颗粒的网孔，在向下移动过程中流程 较长，移动速度慢，最后流出
磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径 的小，能够穿过透析袋；而蛋白质是 大分子，不能透过透析袋，只能保留 在袋中
思考题
向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶 面平整？上样体积为什么不能太大？
➢ 血红蛋白溶液 ➢ 交联葡聚糖G-25
➢ 0.4%
K➢3F氨e(基C萘N)酚6 磺酸试剂 ➢ 钼酸铵试剂 ➢ 15%三氯醋酸
➢ 0.1M磷酸缓冲液
实验步骤
凝胶的处理
G-25颗粒(5g)
蒸馏水室温溶胀
去除杂质
10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜)
装柱
层析管洗净、排出管中气泡
高铁血红蛋 白与高铁氰 化钾混合物
高铁氰化钾
➢ 透 析 法：
利用特制的半透膜把大小分子分开的 方法，截止分子量一般为一万
透析袋 浓缩的蛋白 混合样品
透析液
开始透析 处于平衡状态
临床应用： 血液透析
➢ 钼酸铵 +
氨基萘酚磺酸 +
磷酸盐
钼蓝（蓝色）
➢ 15%三氯醋酸+蛋白质
变性、沉淀
实验器材与试剂
收集红褐色的MetHb色带
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不能 进入珠内， 经珠之间缝 隙流出
凝胶过滤层析过程示意图
洗脱与收集
➢将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后， 用2~3倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶
➢ 用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中 的凝胶吹至小烧杯中回收
透析
将MetHb 洗脱液装 入透析袋
请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快 或太慢？
圆盘电泳的分子筛效应和凝胶过滤的分子筛 效应原理上有何不同？
➢ 实验项目 ➢ 实验原理 ➢ 试剂和器材 ➢ 操作方法（主要步骤） ➢ 结果分析 ➢ 思考题
预习
实验九 酶法测血清葡萄糖
实验八
凝胶过滤分离高铁血红蛋白 与高铁氰化钾
实验目的
了解凝胶层析的原理及应用
通过血红蛋白脱盐实验，初步掌 握凝胶层析技术
实验原理
➢ 凝胶过滤层析：
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作 用，根据被分离物质的分子大小不同来进 行分离，也称分子筛层析、排阻层析
单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型 凝胶的筛孔的大小不同。
透析后杯内 蒸馏水
试剂量
15滴
10滴
钼酸铵试剂
2滴
2滴
氨基萘酚磺酸试剂
3滴
3滴
反应结果
无
蓝色
➢ 蛋白质的鉴定
透析前杯内蒸馏水 透析后杯内蒸馏水
透析袋内溶液
试液量 40滴 40滴 10滴
15%三氯醋酸 20滴 20滴 5滴
反应结果
无 无
有沉淀
MetHb的相对分子量较大，直径大于 凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在 凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较 短，移动速度快，首先流出
交联葡聚糖的凝胶颗粒
分子筛效应：
大分子在前，小分子在后
Hb ﹢ K3Fe(CN)6
MetHb
高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色， Mw=64500)， 完全排阻
高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色， Mw=327.25) ，可完全进入凝胶颗粒网孔内， 从而达到分离的目的
交联葡聚糖 高铁血红蛋白
试液量 40滴
40滴
10滴
15%三氯醋酸 反应结果
20滴
？
20滴
？
5滴
？
注意事项
装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡 或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者 重新装柱，保持柱床面平整； 洗脱时流速不可太快或太慢； 透析袋中的液体不可装满，否则会将 透析袋胀破。
实验结果
➢ 磷酸盐的鉴定
透析前杯内 蒸馏水
关闭出口
固定在铁架上
加入缓冲液没过砂芯
关闭出口
将凝胶缓缓注入管内
打开出口
自然沉降至柱床高度达20cm以上 不可露出创面 盖滤纸
装柱要求: ➢ 连续
➢ 均匀 ➢ 无气泡 ➢ 无分层 ➢ 床面平整
平衡
层析柱稳定后接储液瓶，打开 出口，用两倍于床体积的缓冲液洗 脱平衡(5-10min )，不可露出床面， 关闭出口
将透析袋 口用止水 夹密封
将透析袋悬 入装有蒸馏 水的烧杯中
打开磁力搅 拌器，透析 30分钟
鉴定
➢ 磷酸盐的鉴定
试剂量 钼酸铵试 剂
透析前杯ห้องสมุดไป่ตู้15滴 2滴 内蒸馏水
透析后杯 10滴 2滴 内蒸馏水
氨基萘酚磺 酸试剂 3滴
3滴
反应结 果 ？
？
➢ 蛋白质的鉴定
透析前杯内蒸 馏水
透析后杯内蒸 馏水
透析袋内溶液
加样
放掉多余缓冲液至刚露出床面
准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6 (8滴)混合液
自距床面1mm高处靠壁缓慢、均匀加入
打开出口
至液面降至与凝胶面相平
洗脱与收集
缓慢加入样品量体积的洗脱液 （不冲破胶面）
打开出口
至洗脱液刚好流入床面
关闭出口
再加洗脱液至3-4cm高
连接储液瓶 调节活塞（1滴/5秒）进行洗脱
K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直 径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶 颗粒的网孔，在向下移动过程中流程 较长，移动速度慢，最后流出
磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径 的小，能够穿过透析袋；而蛋白质是 大分子，不能透过透析袋，只能保留 在袋中
思考题
向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶 面平整？上样体积为什么不能太大？