实验八凝胶过滤分离高铁血红蛋白和高铁氰化钾
凝胶过滤色谱实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography，GFC）的基本原理和操作方法。
2. 掌握凝胶过滤色谱在分离、纯化蛋白质等生物大分子中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤色谱的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤色谱是一种根据分子大小进行分离的技术，其基本原理是利用凝胶的分子筛特性。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶时，分子大小不同的物质会被不同程度地阻滞在凝胶孔隙中，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品：牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）、酵母提取物（Yeast Extract）- 凝胶色谱柱：Sephadex G-75- 缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.4）- 标准分子量蛋白质：分子量分别为6.5×10^4、1.4×10^5、2.0×10^5、4.0×10^5、6.0×10^5的蛋白质混合物2. 实验仪器：- 凝胶色谱仪- 超速离心机- 荧光检测器- 移液器- 离心管- 吸管四、实验步骤1. 准备凝胶色谱柱：将Sephadex G-75凝胶柱安装在凝胶色谱仪上，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）平衡凝胶色谱柱，使其达到稳定状态。
2. 准备样品：将标准分子量蛋白质混合物、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白和酵母提取物分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制成蛋白质溶液。
3. 上样：将蛋白质溶液加入凝胶色谱柱，使样品在凝胶色谱柱中均匀分布。
4. 流动：打开凝胶色谱仪，以一定流速（如1 mL/min）进行洗脱，收集洗脱液。
5. 分析：将收集到的洗脱液进行检测，记录蛋白质的洗脱峰，并分析其分子量分布。
6. 离心：将洗脱液中的蛋白质进行离心，分离出蛋白质沉淀。
7. 质量分析：将蛋白质沉淀进行电泳、质谱等分析，验证其纯度和分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤色谱洗脱曲线：通过凝胶色谱仪收集洗脱液，绘制洗脱曲线。
血红蛋白凝胶过滤
Fe3+
Fe2+
Fe2+
O2
O2
实验过程模式图
实验仪器设备的介绍与使用
1、层析柱 2、恒流蠕动泵
层析柱：Ø10×150mm
层析柱分解图
层析柱的安装要 垂直稳定，上下 不能倒置。
止水螺丝
恒流蠕动泵
调速旋钮
顺逆按钮
检查恒流泵止水螺旋是否旋紧
旋下层析柱两端螺旋，检查柱子是否装反
实验材料与试剂介绍
三、实验原理
特性 电性:
方法 离子交换层析 电泳 等电聚焦 吸附层析 纸层析 反相层析 疏水反应层析 超滤 凝胶电泳 凝胶层析 超速离心 亲和层析
极性:
大小:
生 物 大 分 子 分 离 的 策 略
特异性:
+ + + + + +
-
电泳
凝胶过滤
SDS-PAGE
双向薄层层析
离子交换层析
抗原抗体特异亲和层析分离
Na2H2EDTA还原铁溶液 (黄色Eppendorf管 中, 0.4ml ) （4）上柱血样（抗凝血+10倍磷酸缓冲液+固体铁 氰化钾5mg/ml ，红色Eppendorf管中, 0.5ml )
黄色：还原铁样品 白色：缓冲液
红色：血样
四、实验步骤
1. 取血：制备抗凝血和上柱血样 。 2. 调速：在柱中注入1cm磷酸缓冲液，调节流速1滴/2秒。 3. 装柱：待柱中磷酸缓冲液流尽时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊状凝胶 一次性倒入柱中，自然沉降20min后，用镊子小心在 胶面上放置圆片 滤纸。 4. 平衡：打开恒流泵，平衡10min，注意随时添 加缓冲液，防止柱床干 裂。 5. 待缓冲液将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小心加入0.4ml还原铁 (黄)，打开恒流泵，待还原铁将进入柱床时关掉恒流泵，用滴管小心 加入0.7ml磷酸缓冲液（白），打开恒流泵。 6. 上样：待磷酸缓冲液将进入柱床时，关掉恒流泵用滴管小心加入 0.5ml血样（红），打开恒流泵，待血样将进入柱床时，用滴管小心 加入磷酸缓冲液至柱顶。 7. 旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，观察并记录现象。 8. 待所有有色带完全流出柱子后，加快流速，继续清洗凝胶柱2min。 9. 停止蠕动泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出 滤纸片，物归原位待老师检查后离开。
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验是生物化学实验中常见的一种实验项目，它常用于分离和检测血红蛋白，对于学习生物化学的学生来说是一个非常重要的实验。
在实际操作中，也存在一些不足之处，因此我们有必要对这个实验进行改进，以提高实验的准确性和可靠性。
我们来简单介绍一下凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的基本原理。
这个实验是通过利用凝胶过滤的原理将混合物中的不同成分分离开来的。
在这个实验中，我们会将血红蛋白和硫酸铜混合在一起，然后将混合物加入到预先制备好的凝胶柱中进行分离。
在分离过程中，血红蛋白会通过凝胶柱逐渐移动，而硫酸铜则会停留在初始位置。
最终，我们可以通过观察凝胶柱上的颜色变化来确定血红蛋白的存在和浓度。
虽然这个实验原理相对简单，但在实际操作中仍然存在一些问题。
其中最主要的问题之一是凝胶柱的制备过程。
传统的凝胶柱制备方法需要经过多道工序，包括凝胶的配制、填充到柱中、等渗和氧化等多道复杂工序，而且需要较长时间的等待。
这样一来，就大大增加了实验的复杂度和操作难度。
由于制备过程中的不确定因素，也容易导致凝胶柱的品质不稳定，从而影响实验结果的准确性。
鉴于以上问题，我们提出了一种改进凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的方法。
这种改进方法主要是利用新型凝胶材料来取代传统的制备方法。
新型凝胶材料具有制备简单、操作方便、稳定性高等特点，可以大大提高实验的可靠性和准确性。
在实验过程中，我们发现使用新型凝胶材料制备的凝胶柱可以更加均匀地分离血红蛋白和硫酸铜。
这要归功于新型凝胶材料的孔隙结构更加规则和稳定，使得血红蛋白和硫酸铜可以更加均匀地在凝胶柱中进行分离。
这也意味着我们可以更加准确地观察到实验结果，从而得到更加可靠的数据。
我们还发现使用新型凝胶材料制备的凝胶柱可以较低的成本进行批量制备，可以一定程度上降低实验的成本。
这对于教学实验室等资源匮乏的地方来说，将是一个不小的优势。
生化实验血红蛋白的凝胶过滤
血红蛋白的凝胶过滤植物098 原硕0901080808摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。
关键字：血红蛋白，凝胶过滤一、研究背景及目的：凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果等优点。
在很多方面都有所应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。
血红蛋白的凝胶过滤
凝胶层析的应用
▪ ⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等） 溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法 除去，这一操作称为脱盐。
▪ ⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、 蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物 质的分离提纯。
▪ ⑶测定高分子物质的分子量 ▪ ⑷高分子溶液的浓缩
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凝胶层析应用
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影响分离效果的因素
1.基质的颗粒大小、均匀度 2.筛孔直径和床体积的大小 3.洗脱液的流速 4.样品的种类等， 5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值
差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小， 则分离效果很差，或根本不能分开。
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影响凝胶过滤的因素
2.分子量测定
在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve 与其分子量的对数成线性关系。
▪ Kav＝－b lg MW＋c ▪ Ve＝－b’ lg MW＋c’ ▪ 由此通过对已知分子量的标准物质进行
洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标 准曲线，然后在相同的条件下测定未知 物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出 其分子量。
▪ 3.进行实验时，注意与目标物分子量相似的 尽量少。
▪ 4.凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、 无气泡。
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操作步骤1
▪ 1.装柱:
▪ 检查上下柱帽是否通畅,将接线短的柱帽 接在层析柱的下端.
▪ 加入1/8柱体积的去离子水或磷酸盐缓冲 液,搅拌小烧杯里的凝胶,并连续的装入层 析柱中,使沉积后的凝胶高度不低于 12cm,接上上端的柱帽,将其连线插入三 角瓶里磷酸盐缓冲液中,平衡20分钟.
凝胶过滤法分离蛋白质
• 3．样品处理
¾ 血红蛋白溶液的制备 取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上 层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min 离心5min，弃去上清液，重复3次。最后一次吸去上清液 后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体 积CCl4，用力振摇3min，3 000r/min离心5min。吸取上层 澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4℃ 暂存，一周用完)。
¾ 样品 血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)6 8滴和蒸馏水2滴混合， 制成MetHb混合样品。
• 4．上样、洗脱
¾ 打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至 刚露出柱床面时即关闭出口。
¾ 吸混合物样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿 管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然 后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新 露出。
¾ 加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样 品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少 量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液， 但注意切勿搅动床面凝胶，连接蠕动泵进行洗 脱。
• 5．分部收集 用自动部分收集器，以5滴/min， 5min/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待 黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱下来后，再继续收 集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。
• 6．测定: 两种方法
– 接紫外检测仪及记录仪，绘制280nm洗脱图谱。 – 将每管收集液加入缓冲液至4ml，混匀，在425nm处测其
吸光度，以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图 谱。
实 验 装 置 连接示意图
【注意事项】
1．装柱后要检查柱床是否均匀，若有气 泡或分层的界面时，需要重新装柱。 2．流速不可太快，否则分子小的物质来 不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下 来，达不到分离目的。
凝胶过滤析法分离血红蛋白
化学生物学实验
药学院 化学生物学教研室
1.实验目的
1
初步了解凝胶过滤层析 法的简单原理及应用
2
初步掌握应用凝胶过滤 法分离蛋白质
2.实验原理
层析法是利用混合物中各组分物理经学性质的差别（如吸 附力、溶解度、分子形状、大小和极性等），使各组分以 不同的程度分布在两相中，从而使各组分以不同的速度随 流动相向前流动而达到分离的目的。层析法可分为多种类 型，包括分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和 层析等。 凝胶过滤层析 分配层析
试剂
（1）交联葡聚糖G-50 （2）二硝基氟苯 （3）鱼精蛋白 （4）0.9%NaCl （5）10%碳酸氢钠 （6）95%乙醇
4.操作步骤
1、凝胶准备：取sephadex G-50 3g置于锥形瓶中，加蒸馏水 90ml，于沸水浴中煮沸2小时(或放于水中浸泡6小时)，充分 膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。 2、装柱：关闭下口，向玻璃柱内加入蒸馏水达柱总长度约1/3 处，把膨胀好的糊状凝胶边搅拌、边自柱的顶端沿管内壁缓 缓加入柱中至柱顶部，待柱底部凝胶沉积至1-2cm时，开启 柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在 溶液中。再慢慢地继续加入凝胶，直至凝胶体积至柱顶 2.5cm左右，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒 轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm。 最后放入略小于层析柱内径的圆形小滤纸片，以防将来加样 时凝胶被冲起。
4.操作步骤
3、平衡：用10ml左右的蒸馏水流洗整个柱床。操作过程中严 防出现气泡和分层，如床面不平，可用玻璃棒轻轻搅动表面， 是凝胶重新自然沉降。整个过程中勿使液面低于床面，以免 气体进入，使柱床干裂。 4、加样：待柱床面以下的蒸馏水流出，且刚好与床面相切时 (切不可使床面完全暴露于空气中)，关闭下口。用滴管取血 红蛋白及鱼精蛋白混合液（血红蛋白稀释液3滴加DNP-鱼精 蛋白溶液3滴），十分小心地并缓缓沿内壁加入(注意切勿破 坏柱床面)，打开柱底部出口，使样品进入床内，至床面重 新露出时，先加入少量的蒸馏水，冲洗床面1-2次，然后再 加入足量蒸馏水。
实验八凝胶过滤法分离蛋白质ppt课件
用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水
面 )。
装柱时，凝胶柱内若有气泡或分离断层，可用玻棒搅动消除
或重新装柱，装柱结束后凝胶表面应平整。
实验操作
3、加样：
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、 2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混合--------上柱样品。
当分子量未知时，选择Sephadex
G-25
洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大 而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡 萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的 时间就比较短。
用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品， logMW对洗脱体积作图
三、器材与试剂
1×20cm层析柱、自动部分收集器，蠕动泵 葡聚糖凝胶Sephadex-50 蒸馏水 三角铁架 4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液(200万） 6mg/ml细胞色素C溶液 （几万） 样品混合液 2mg/ml重铬酸钾溶液（几百）
四、实验操作
1、凝胶溶胀
取Sephadex G-50 15g，加500ml蒸馏水室温溶胀 一天（或沸水浴中溶胀1h）。 待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再 放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液， 至无细颗粒为止。 不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌器，否则易破碎，使 流速下降和分离效果降低。
根据实验中遇到的各种问题，总结做好本实验的经验 与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点。
实验八__凝胶 过滤法分离蛋 白质
二．原理
分子筛层析molecular-sieve chromatography
凝胶过滤层析gel-filtration chromatography 分子排阻层析molecular exclusion chromatography
血红蛋白的凝胶过滤
步骤3
A.上样FeSO4 0.5ml于滤纸面上。开启 恒流泵至液面与胶面相齐。关泵。 B.上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶 面相齐。关泵。 C.上0.5ml血红蛋白样，开泵，至液面与 胶面相齐，关泵。 D.同B操作。 E.上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与 磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并 用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化 钾。
凝胶层析的应用
⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等） 溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法 除去，这一操作称为脱盐。 ⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、 蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物 质的分离提纯。 ⑶测定高分子物质的分子量 ⑷高分子溶液的浓缩
凝胶层析应用
1.生物大分子的纯化
血红蛋白的凝胶过滤
凝胶排阻层析 (gel exclusion chromatography) 分子筛层析 ( molecular sieve chromatography) 凝胶过滤 (gel filtration)
凝胶层析技术及原理
凝胶:是胶体溶液凝固而成的固体物质，其内部是立体 的网状结构.
交联葡聚糖(sephadex) 琼脂糖凝胶(sepharose)
本实验的原理
本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入 FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋 白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由 于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其 流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原 为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下 移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧 合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄 色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地 观察到凝胶过滤的分离效果。
[新版]血红蛋白凝胶过滤层析
![[新版]血红蛋白凝胶过滤层析](https://img.taocdn.com/s3/m/b00656b50129bd64783e0912a216147917117eba.png)
血红蛋白凝胶过滤层析摘要：本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。
由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。
亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2 结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。
铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。
这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
关键词:凝胶柱，抗凝血，磷酸缓冲溶液凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析或排阻层析。
目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。
它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状结构。
以Sephadex为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。
葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。
Sephadex有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。
交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。
本实验利用Sephadex将血红蛋白从鸡血中进行分离，通过层析柱可以形象的看见分离的过程。
1、实验材料及试验方法1.1实验仪器：烧杯、移液管、胶头滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、PH试纸、电子天平、层析柱、洗耳球、铁架台、钥匙、称量纸1.2实验试剂（1）磷酸缓冲液（PH 7.0）：称取Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。
（2）Na2HPO4－EDTA－Na2 溶液：称取 2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。
（3）40m mol/L FeSO4溶液:称取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL水中（用时现配）。
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验是一种常用的科研实验方法，它通常被用于分离和纯化蛋白质，特别是血红蛋白。
然而，这种实验方法在实际操作中存在一些缺陷，例如基质结合不稳定，产生较大的样品丢失率和浪费等问题。
因此，在这篇文章中，我将介绍对凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进，并提出一种新的方法。
实验方法：准备100mL 10mM缓冲液（pH=7.4）作为样品基质，并在样品基质中加入100mg血红蛋白溶液。
然后，将10mL凝胶填充在一个过滤器内，过滤器通常为15mL管式过滤器或50mL 管式过滤器。
将过滤器缓慢地加入样品基质中，并将样品基质与凝胶过滤器混合均匀。
将样品基质放置在4℃，允许其在缓慢冷却中析出。
将样品基质离心并将其过滤。
然后，使用一定量的硫酸铜溶液和洗涤液对样品进行洗涤并收集所得样品。
最终，使用紫外/VIS光谱法或其它方法进行分析和纯化。
改进方法：上述实验方法中，凝胶过滤器与样品基质的结合不够稳定，使得部分样品会丢失。
为了解决这个问题，我们可以对凝胶过滤器进行改良，使其更加稳定。
具体操作方法如下：将10mL凝胶填充在一个过滤器中，并将其放置在样品基质中10-20min。
然后，将过滤器取出，并将其用稀钠盐溶液或其它溶液清洗。
这样可以使凝胶过滤器表面的基质有更好的附着力，并减少样品丢失率以及浪费。
另外，在上述实验中，使用大量的洗涤液和硫酸铜溶液，既浪费了试剂又增加了实验成本。
因此，我们提出一种新方法，即在样品基质中加入少量硫酸铜，这样可以减少样品中劣质杂质，使样品更纯，更易于分析和纯化。
同时，减少洗涤液的使用可以减少实验成本，使实验更具优化性和经济性。
结论：。
生化实验报告 实验5 血红蛋白凝胶过滤
生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤生化实验报告实验5血红蛋白凝胶过滤实验报告课程名称：生化实验b实验日期：班级：姓名学号：血红蛋白凝胶过滤一、背景及目的血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。
人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。
每个亚基均成球状，内部有一个血红素。
血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。
当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要就是根据蛋白质的大小和形状，即为蛋白质的质量展开拆分和提纯。
层析柱中的填料就是某些惰性的多孔网状结构物质，多就是交联的聚糖(例如葡聚糖或琼脂糖)类物质，并使蛋白质混合物中的物质按分子大小的相同展开拆分。
通常就是大分子先流出，小分子后流出。
凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
影响拆分效果的因素主要存有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的ph6.而最轻易的影响就是kav值的差异性，kav值差异性小，拆分效果不好；kav值差异性大，则拆分效果很差，或显然无法分离。
影响凝胶过滤的因素主要有：1、层析柱的挑选：短的层析柱分辨率必须比长的高，但层析柱长度无法过长。
2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。
3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。
目前凝胶过滤器技术的应用领域主要就是以下几点：1、脱盐2、用于分离提纯3、测定高分子物质的分子量4、高分子溶液的浓缩5、蛋白质的复性二、实验原理层析法就是基于相同物质在流动阴之木紧固二者之间的分配系数相同而将混合组分拆分的技术。
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进凝胶过滤是一种常用的实验方法，用于分离和纯化生物大分子，如蛋白质、核酸等。
在分离血红蛋白与硫酸铜的实验中，凝胶过滤可以用来分离血红蛋白和其他小分子组分，并且可以探究血红蛋白与硫酸铜之间的相互作用。
本文将针对凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验进行改进，以提高实验的准确性和可靠性，同时简化实验步骤，提高操作效率。
1. 实验材料：- 硫酸铜溶液- 血红蛋白溶液- 分离胶：选择适当的分离胶，如聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。
凝胶的选择应根据需求和实验目的来确定。
- Tris缓冲液：用于制备凝胶和洗涤凝胶的缓冲液。
- SDS-PAGE样品缓冲液：用于裂解和溶解样品中的蛋白质，以及给予样品适当的缓冲pH值。
- Coomassie亮蓝染色液：用于染色凝胶中的蛋白质。
2. 实验步骤：a. 准备凝胶：- 根据生产商的指南制备适当浓度的聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。
- 向凝胶中加入合适浓度的硫酸铜溶液，以便与血红蛋白发生反应。
b. 样品制备：- 将血红蛋白样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合，使样品蛋白质裂解并达到适当的缓冲pH值。
c. 足量加载：- 将足够量的样品加载到凝胶上，确保样品浓度足够高以便于检测。
- 加载时要避免产生气泡，以免影响分离效果。
d. 电泳分离：- 将凝胶放入电泳仪中，按照生产商的指南设置电泳条件。
- 在电泳过程中确保恒温，避免温度影响分离结果。
e. 染色：- 用Coomassie亮蓝染色液处理凝胶，染色时间与生产商的建议时间一致。
- 在染色完成后，使用脱色液洗脱凝胶中固定在凝胶中的染色剂。
- 用脱色液反复洗脱，直到凝胶背景变得透明。
f. 凝胶观察：- 使用适当的成像设备（如分子成像仪）观察和记录凝胶图像。
- 分析凝胶图像，并比较不同样品之间的差异。
3. 改进和注意事项：a. 实验条件优化：- 针对不同样品和目的进行实验条件的优化，包括电泳时间、温度、电流等。
- 可进行不同浓度的硫酸铜处理试验，以确定最佳浓度。
血红蛋白的凝胶过滤
成品出售，使用方便，但价格较贵 。
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4.溶液的浓缩
▪ 利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品 溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（ 粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收 大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透 进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排 阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒， 即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法 基本不改变溶液的离子强度和pH值。
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凝胶过滤技术特点
▪ 凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于 惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件 比较温和，可在相当广的温度范围下进行， 不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质 的保持有独到之处。对于高分子物质有很好 的分离效果。
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凝胶层析的应用
▪ ⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等） 溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法 除去，这一操作称为脱盐。
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操作步骤2
▪ 2.上样前的准备
▪ 调节恒流泵的流速为6—10滴/分钟,并将 其进水口与层析柱的下端接线相接.
▪ 撤去柱上端的柱帽,放入与柱内径大小一 致的滤纸片一块,检查胶面是否平整,层析 柱是否均匀.然后将胶面上的缓冲液用排
气键放至与胶面相齐,关上恒流泵.切忌干 胶!
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步骤3
▪ A.上样FeSO4 0.5ml于滤纸面上。开启 恒流泵至液面与胶面相齐。关泵。
▪ Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
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▪ 在限定的层析条件下， Vt 和 Vo 都是恒定
值，而 Ve 值却是随着分离物分子量的变化
而变化的。分离物分子量大， Kav 值小；
反之，则 Kav 值增大。因此，在同一凝胶
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进摘要：凝胶过滤是一种常用的蛋白质分离技术，可以根据蛋白质的大小和形状在凝胶矩阵中进行分离。
本实验旨在改进凝胶过滤技术，以提高血红蛋白的分离效果，并研究硫酸铜对血红蛋白的影响。
关键词：凝胶过滤、血红蛋白、硫酸铜、分离效果、影响因素材料与方法：1. 实验材料：血红蛋白溶液、硫酸铜溶液、凝胶过滤装置、滤纸、显微镜等。
2. 实验步骤：(1) 准备凝胶过滤装置并进行预处理，确保装置无杂质。
(2) 将血红蛋白溶液和硫酸铜溶液分别注入两个不同的腔室。
(3) 打开凝胶过滤装置的阀门，使溶液缓慢通过滤纸流出。
(4) 收集通过滤纸的溶液，使用显微镜观察分离效果。
(5) 打开凝胶过滤装置的另一个阀门，排出残余的溶液。
(6) 反复实验，改变硫酸铜的浓度和反应时间等因素，研究其对血红蛋白分离的影响。
(7) 记录实验结果并进行数据分析。
结果与讨论：通过改进实验步骤和条件，我们观察到了更好的分离效果。
在改变硫酸铜的浓度和反应时间的实验中，发现硫酸铜浓度越高，分离效果越明显。
浓度过高会导致溶液的PH值下降，可能会对蛋白质结构产生影响，因此需要在一定范围内选择合适的浓度。
反应时间的延长也有助于分离效果的提高，但反应时间过长可能会引起其他化学反应的发生，因此需要进行适当的控制。
结论：通过实验改进，我们成功地提高了凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜的效果，并研究了硫酸铜浓度和反应时间对分离效果的影响。
这对于深入理解凝胶过滤技术的原理和应用具有重要意义，也为进一步开展相关研究提供了基础。
致谢：感谢实验室的支持和指导，使实验顺利进行。
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试剂量
15滴
10滴
钼酸铵试剂
2滴
2滴
氨基萘酚磺酸试剂
3滴
3滴
反应结果
无
蓝色
➢ 蛋白质的鉴定
透析前杯内蒸馏水 透析后杯内蒸馏水
透析袋内溶液
试液量 40滴 40滴 10滴
15%三氯醋酸 20滴 20滴 5滴
反应结果
无 无
有沉淀
MetHb的相对分子量较大，直径大于 凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在 凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较 短，移动速度快，首先流出
加样
放掉多余缓冲液至刚露出床面
准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6 (8滴)混合液
自距床面1mm高处靠壁缓慢、均匀加入
打开出口
至液面降至与凝胶面相平
洗脱与收集
缓慢加入样品量体积的洗脱液 （不冲破胶面）
打开出口
至洗脱液刚好流入床面
关闭出口
再加洗脱液至3-4cm高
连接储液瓶 调节活塞（1滴/5秒）进行洗脱
关闭出口
固定在铁架上
加入缓冲液没过砂芯
关闭出口
将凝胶缓缓注入管内
打开出口
自然沉降至柱床高度达20cm以上 不可露出创面 盖滤纸
装柱要求: ➢ 连续
➢ 均匀 ➢ 无气泡 ➢ 无分层 ➢ 床面平整
平衡
层析柱稳定后接储液瓶，打开 出口，用两倍于床体积的缓冲液洗 脱平衡(5-10min )，不可露出床面， 关闭出口
实验八
凝胶过滤分离高铁血红蛋白 与高铁氰化钾
实验目的
了解凝胶层析的原理及应用
通过血红蛋白脱盐实验，初步掌 握凝胶层析技术
实验原理
➢ 凝胶过滤层析：
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作 用，根据被分离物质的分子大小不同来进 行分离，也称分子筛层析、排阻层析
单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型 凝胶的筛孔的大小不同。
将透析袋 口用止水 夹密封
将透析袋悬 入装有蒸馏 水的烧杯中
打开磁力搅 拌器，透析 30分钟
鉴定
➢ 磷酸盐的鉴定
试剂量 钼酸铵试 剂
透析前杯 15滴 2滴 内蒸馏水
透析后杯 10滴 2滴 内蒸馏水
氨基萘酚磺 酸试剂 3滴
3滴
反应结 果 ？
？
➢ 蛋白质的鉴定
透析前杯内蒸 馏水
透析后杯内蒸 馏水
透析袋内溶液
试液量 40滴
40滴
10滴
15%三氯醋酸 反应结果
20滴
？
20滴
？
5滴
？
注意事项
装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡 或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者 重新装柱，保持柱床面平整； 洗脱时流速不可太快或太慢； 透析袋中的液体不可装满，否则会将 透析袋胀破。
实验结果
➢ 磷酸盐的鉴定
透析前杯内 蒸馏水
K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直 径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶 颗粒的网孔，在向下移动过程中流程 较长，移动速度慢，最后流出
磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径 的小，能够穿过透析袋；而蛋白质是 大分子，不能透过透析袋，只能保留 在袋中
思考题
向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶 面平整？上样体积为什么不能太大？
收集红褐色的MetHb色带
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不能 进入珠内， 经珠之间缝 隙流出
凝胶过滤层析过程示意图
洗脱与收集
➢将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后， 用2~3倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶
➢ 用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中 的凝胶吹至小烧杯中回收
透析
将MetHb 洗脱液装 入透析袋
➢ 层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器
➢ 血红蛋白溶液 ➢ 交联葡聚糖G-25
➢ 0.4%
K➢3F氨e(基C萘N)酚6 磺酸试剂 ➢ 钼酸铵试剂 ➢ 15%三氯醋酸
➢ 0.1M磷酸缓冲液
实验步骤
凝胶的处理
G-25颗粒(5g)
蒸馏水室温溶胀
去除杂质
10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜)
装柱
层析管洗净、排出管中气泡
交联葡聚糖的凝胶颗粒
分子筛效应：
大分子在前，小分子在后
Hb ﹢ K3Fe(CN)6
MetHb
高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色， Mw=64500)， 完全排阻
高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色， Mw=327.25) ，可完全进入凝胶颗粒网孔内， 从而达到分离的目的
交联葡聚糖 高铁血红蛋白
请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快 或太慢？
圆盘电泳的分子筛效应和凝胶过滤的分子筛 效应原理上有何不同？
➢ 实验项目 ➢ 实验原理 ➢ 试剂和器材 ➢ 操作方法（主要步骤） ➢ 结果分析 ➢ 思考题
预习
实验九 酶法测血清葡萄糖
高铁血红蛋 白与高铁氰 化钾混合物
高铁氰化钾
➢ 透 析 法：
利用特制的半透膜把大小分子分开的 方法，截止分子量一般为一万
透析袋 浓缩的蛋白 混合样品
透析液
开始透析 处于平衡状态
临床应用： 血液透析
➢ 钼酸铵 +
氨基萘酚磺酸 +
磷酸盐
钼蓝（蓝色）
➢ 15%三氯醋酸+蛋白质
变性、沉淀
实验器材与试剂