GPC凝胶色谱实验步骤

形）的多孔载体，让其尽可能紧密装填以提高分离能力。柱效的高低，常采用理 论塔板数 N 和分离度 R 来作定性的描述。测定 N 的方法可以用小分子物质作出 色谱图，从图上求得流出体积 Ve 和峰宽 W，以下式计算 N 值：N＝（4Ve／W）
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，N 值越大，意味着柱子的效率越高。 “ l” 、 “2”代表分子量不同的两种标准样
一、实验目的： 1. 掌握 PL—120 型号凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC） 的工作原理。 2. 掌握凝胶渗透色谱仪的基本操作及数据处理方法。 3. 利用凝胶渗透色谱仪测定聚合物的分子量及其分布。 二、基本原理： 分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。 聚合物的性能与其分子量和分 子量分布密切相关。凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）是液 相色谱的一个分支， 已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。其还可 测定聚合物的支化度，共聚物及共混物的组成。采用制备型的色谱仪，可将聚合 物按分子量的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。该方法 的优点是：快捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。 凝胶色谱的分离机理众说不一，有体积排除、限制扩散、与流动分离等各种 解释。实验证明，体积排除的分离机理起主要作用。因此，这一技术又被赋予另 一个名称：体积排除色谱（size exclusion chromatography，SEC）
点击“确定” 。 （6）将进样器把手扳到“LOAD”位（动作要迅速） ，用进样注射器吸取样品 100 μ l，注意排除气泡，并匀速注入进样器。 （7）观察工作站提示“等待进样” ，这时将进样器把手扳到“INJECT”位（动 作要迅速） ，即进样完成。 （8）等待完成采集。 4．试验结束 （1）应清洗进样器。 （2）检测器温度设为 OFF。待温度下降后关机。 （3）柱温设为 OFF,保持流速不低于 0.2ml/min,直到温度在室温附近，方可以停 流速，关柱温箱。 （4）关泵。 5.数据备份。 将所使用的项目备份到指定的计算机路径。 五、 记录及数据处理 1．GPC 谱图的归一化处理 如果仪器和测试条件不变， 那么实验得到的谱图可作为试样之间分子量分布 的一种直观比较。一般地，应将原始谱图进行“归一化”后再比较。所谓“归一 化” ，就是把原始谱图的纵坐标转换为重量分数，以便于比较不同的实验结果和 简化计算。具体作法：确定色谱图的基线后，把色谱峰下的淋出体积等分为 20 个计算点。 记下这些计算点处的总坐标高度 H（它正比于被测试样的重量浓度） 。 i 把所有的 Hi 加和后得到Σ Hi（它正比于被测试样的总浓度） 。那么，Hi/Σ Hi 就等 于各计算点处的组分点总试样的重量分数，以 Hi/Σ H 对 Ve（或 logM）作图就得 归一化的 GPC 图。
四氢呋喃 THF （流动相） 聚合物样品 （如 PS） 样品瓶 注射器（100μ l） 样品过滤头 注射器（5ml） PL—120 型 GPC 色谱仪 四、实验步骤 1 用超声波在减压的条件下Байду номын сангаас流动相（THF）经行减压退气。 2 1．溶液配制：分别配制 5ml 的聚苯乙烯标样及待测样品的溶液。 2．PL—120 型液相色谱仪的启动： （1）色谱级四氢呋喃注入泵的溶剂瓶，检测器废液出口接废液回收瓶。 （2） 打开计算机，联机记录。 （3）依次打开泵（Waters-1515） ，打开示差折光检测器（2414） ，柱温箱。 （4）打开 Breeze2 工作站。 （5）启动泵： 从抽液阀排管路气泡； 向右打开参比阀，在工作站上设定 4ml/min 流速，排赶泵内气泡。大约 3 分种后在工作站上停止流速。将参比阀向左关闭； 在工作站上设定在 5 分钟内升至 0.8ml/min 流速； （6）启动示差折光检测器（Waters-2414） 在检测器面板上设定温度.Dec = 40℃，Col = 45℃.按 shift purge 使 LCD 屏幕 上出现“ ”符号。
、 图 1. GPC 分离过程示意图 圆球表示颗粒；黑点表示溶质分子 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙； 二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝 胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每 种凝胶分离范围之外的分子， 在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分 子大小不同， 但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同 的： 分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入
图 2.GPC 仪工作流程图 色谱柱总体积为 Vt，载体骨架体积为 Vg，载体中孔洞总体积为 Vi，载体粒 间体积为 V0，则 Vt＝Vg＋V0＋Vi V0 和 Vi 之和构成柱内的空间。溶剂分子体积远小于孔的尺寸，在柱内的整 个空间（V0＋Vi）活动；高分子的体积若比孔的尺寸大，载体中任何孔均不能进 入，只能在载体粒间流过，其淋出体积是 V0；高分子的体积若足够小，如同溶 剂分子尺寸，所有的载体孔均可以进出，其淋出体积为（V0＋Vi） ；高分子的体 积是中等大小的尺寸，它只能在载体孔 Vi 的一部分孔中进出，其淋出体积 Ve 为 Ve＝V0＋KVi
较多的凝胶颗粒内， 这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动 距离较长。 于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利 用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的 分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量 大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小排队，凝胶表现分子筛效 应。 GPC 色谱柱装填的是多孔性凝胶（如最常用的高度交联聚苯乙烯凝胶）或 多孔微球（如多孔硅胶和多孔玻璃球） ，它们的孔径大小有一定的分布，并与待 分离的聚合物分子尺寸可相比拟。GPC 仪工作流程图如 2 图所示。
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计算所需的 Mi 值可由校正曲线上查得。 六、 注意事项： 1、样品应尽量采用四氢呋喃溶剂配制。 2、开机后一定要基线稳定后才可测量，否则样品测试误差加大。 3、未经允许不可接触任何设备，包括软管。 七、 思考题：
1．色谱柱是如何将高聚物分级的？影响柱效的因素有哪些？ 2． 本实验中校准曲线的线性关系， 在色谱柱重装或更换色谱柱后， 能否再使用？ 3．GPC 法的溶剂选择有什么要求？ 4．同样分子量样品支化的和线性的分子那个先流出色谱柱？
平衡系统，直到 LCD 显示稳定。 按 shift purge 键，使“ 3. 运行样品。 （1）在 Breeze2 工作站中调用已经编辑好的仪器方法。 （2）点击平衡系统，观察基线至平衡。 （3）停止观察基线。 （4）在样品表中编辑待测样品的信息。 （5） 点击运行样品表图标。 按照对话框提示输入样品组名称， 点击 “等待用户” 。 ”负号消失。
2．计算 M w 、 M n 、 M 及分散度 d 1）平均分子量 定义法 将谱峰下的 Ve 分成若干等分， 则各点的重量分数 Wi=Hi/∑Hi。
1 W M 按定义有： M w M iWi ； M n i ； M Wi M i 2 ； d w Mn Mi
2 Ve , 2 Ve W1 W2
品 ， Ve,1 、 Ve,2 、 W1 ， W2 为 其 淋 出 体 积 和 峰 宽 ， 分 离 度 R 的 计 算 为
R
,1
，若 R≥1，则完全分离。
上面阐述的 GPC 分离机理只有在流速很低，溶剂粘度很小，没有吸附，扩 散处于平衡的特殊条件下成立，否则会得出不合理的结果。 实验测定聚合物 GPC 谱图，所得各个级份的分子量测定，有直接法和间接 法。直接法是指 GPC 仪和粘度计或光散射仪联用；而最常用的间接法则用一系 列分子量已知的单分散的（分子量比较均一）标准样品，求得其各自的淋出体积 Ve，作出 logM 对 Ve 校正曲线（图 4-3） 。 logM＝A－BVe -----------------------------------------（1） 当 logM＞logMa 时，曲线与纵轴平行，表明此时的流出体积（V0）和样品的 分子量是无关，V0 即为柱中填料的粒间体积，Ma 就是这种填料的渗透极限。当 logM＜logMa 时， Ve 对 M 的依赖变得非常迟钝， 没有实用价值。 在 logMa 和 logMd 点之间为一直线，即式（1）表达的校正曲线。式中 A、B 为常数，与仪器参数、 填料和实验温度、流速、溶剂等操作条件有关，B 是曲线斜率，是柱子性能的重 要参数，B 数值越小，柱子的分辨率越高。 上述订定的校准曲线只能用于与标准物质化学结构相同的高聚物，若待分析 样品的结构不同于标准物质，需用普适校准线。GPC 法是按分子尺寸大小分离 的，即淋出体积与分子线团体积有关，利用 Flory 的粘度公式：
因为在相同的淋洗体积时，有 [η]1M1＝[η]2M2 ------------------------------------- （3） 式中下标 1 和 2 分别代表标样和试样。它们的 Mark－Houwink 方程分别为
[ ]1 K1M11 []2 K2 M 22
因此可得
1 K 2 1 M2 1 M 12 1 ----------------------------- K2
'
R3 M
M ' R3
R 为分子线团等效球体半径。[η]M 是体积量纲，称为流体力学体积。众多 的实验中得出[η]M 的对数与 Ve 有线性关系。这种关系对绝大多数的高聚物具有 普适性。普适校准曲线为
' log[]M A' BV e --------------------------------- （2）
K 为分配系数，其数值 0≤K≤l，与聚合物分子尺寸大小和在填料孔内、外 的浓度比有关。当聚合物分子完全排除时，K＝0；在完全渗透时，K＝1（见图 4-3） 。当 K＝0 时，Ve＝V0；此处所对应的聚合物分子量是该色谱柱的渗透极限 （PL） ， 商品 GPC 仪器的 PL 常用聚苯乙烯的分子量表示。 聚合物分子量超过 PL 值时，只能在 V0 以前被淋洗出来，没有分离效果。 V0 和 Vg 对分离作用没有贡献，应设法减小；Vi 是分离的基础，其值越大柱 子分离效果越好。 制备孔容大， 能承受压力， 粒度小， 又分布均匀， 外形规则 （球
K1、K2、α 1、α 2 可以从手册查到，从而由第一种聚合物的 M-Ve 校正曲线，换 算成第二种聚合物的 M-Ve 曲线，即从聚丙稀标样作出的 M-Ve 校正曲线，可以 换算成各种聚合物的校正曲线。 有了校正曲线， 即可根据 Ve 读得相应的分子量。一种聚合物的 GPC 校正曲 线不能用于另一种聚合物， 因而用 GPC 测定某种聚合物的分子量时，需先用该种 聚合物的标样测定校正曲线。 但是除了聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等少数聚合 物的标样以外， 大多数的聚合物的标样不易获得，多数时候只能借用聚苯乙烯的 校正曲线，因此测得的分子量 M 值有误差，只具有相对意义。 用 GPC 方法不但可以得到分子量分布，还可以根据 GPC 谱图求算平均分子 量和多分散系数， 特别是当今的 GPC 仪都配有数据处理系统，可与 GPC 谱图同时 给出各种平均分子量和多分散系数，无需人工处理。 三、仪器与样品
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（4） （5）
或
log M 2
K 1 1 log 1 1 log M1 ------------------2 1 K2 2 1
将（1）式代入（5） ，即得待测试样的标准曲线方程
log M 2 K 1 1 1 log 1 1 A 1 BV A BVe 1 1 K2 2 1 2 1 e