微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)

标题微生物限度检查操作规程

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起草部门质量管理部颁发部门办公室生效日期

一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。

二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)

三、目录1．微生物限度标准

2．设备、仪器及用具

3．消毒液、稀释剂、试液及培养基

4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）

5．微生物计数法检查

6．控制菌检查法

7．实验技术

8.附件

1．微生物限度标准

非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准

需氧菌总数(cfu/g 或cfu/ml)霉菌和酵母菌总数

(cfu/g或cfu/ml)

控制菌

药用原料及辅料103102* *未做统一规定。

1.1成品微生物限度标准

品名

法定标准内控标准

需氧菌

总数

(cfu/g或

cfu/ml)

霉菌和酵

母菌总数

(cfu/g或

cfu/ml)

控制菌需氧菌

总数

(cfu/g或

cfu/ml)

霉菌和酵母

菌总数(cfu/g

或cfu/ml)

控制菌

大肠埃

希菌

沙门

菌

大肠埃

希菌

沙门

菌

乳糖≤1000≤100—无≤100≤50——

无水乳糖≤100≤10—/10g

—

/100g

≤100≤10—/10g

—

/100g

蔗糖无无无无≤100≤50——

(1)．“—”为不得检出。

(2)．目测霉变者以不合格论。

(3)．“无”为标准依据或无相应规定。

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共19页第2页1.2工艺用水微生物限度标准

品名

法定标准内控标准

需氧菌总数

(cfu/ml)

控制菌（MPN/100mL

或CFU/100mL）

需氧菌总数

(cfu/ml)

控制菌（MPN/100mL

或CFU/100mL）

生活饮用水≤100不得检出≤100不得检出纯化水≤lOO不得检出≤80不得检出

1.3内包装材料微生物限度标准

品名

(单位)需氧菌总

数霉菌和酵

母菌总数

控制菌需氧菌

总数

霉菌和酵

母菌总数

控制菌

药用聚乙烯烃

塑料袋

(100cm2)

≤1000cfu≤100cfu—≤100cfu≤10cfu—

说明：1．“—”为每100cm2中不得检出。2．目测霉变者以不合格论。3．“无”为标准依据或无相应规定。

2．设施、仪器及用具

2.1、设施：

2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。生化试剂储存箱。

2.2仪器及器皿

2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。

2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9cm）、量筒（100ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml 分度0.01，10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。

2.3用过的玻璃器皿：

2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次。

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共19页第3页2.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。

试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30分钟。趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。

吸管：全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。

载、盖玻片：应分别浸泡于清洁液12~24小时后，取出用流水冲洗，再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10~15分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。

2，3，3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm 的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干备用。

2.4用具

2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。

2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。

2.4.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4~5mm、长度6~10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。

3消毒液、稀释剂、试液及培养基

3.1消毒液、稀释剂及试液。

3.1.10.1%苯扎溴铵溶液：供洗手、擦拭操作台面用。

3.1.25%石碳酸溶液：配制后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用，抑或选用其他适宜消毒液。

3.1.3．75%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。

3.1.4．0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。

3.1.5．司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-80：供非水溶性供试品供试液制备用。

3.1.6．无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10ml。

3.1.7．甲基红指示液：取甲基红0.1g，加入95%乙醇300ml，水适量，使溶解，再加水至500ml。

3.1.8．V-P试液：①氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml；②α-萘酚乙醇试液：取α-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100ml。

3.1.9．革兰染色液：①沙黄染液：取沙黄0.25g，加95%的乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml；②结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加95%的乙醇20ml，使溶解，加1%的草酸铵溶液80ml，混匀。静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存；③碘试液：取碘化钾2.0g，加水3~5ml使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后，加水稀释至300ml，置密