2014-4科内讲课PPT课件

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TaqMan荧光探针
PCR扩增时在加入一对引物的同 时加入一个特异性的荧光探针， 该探针为一寡核苷酸，两端分别 标记一个报告荧光基团和一个淬 灭荧光基团。
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探针完整时，报告基团发射的荧光 信号被淬灭基团吸收。
PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶 活性将探针酶切降解，荧光基团和 淬灭荧光基团分离。
• 高特异性（ High specificity）
• 可重复性好（ Repeatability）
—（操作简单，或可自动化）
pEVR误判为cEVR可能导致所谓的“复发率”升高
误判为cEVR
由于pEVR患者被误判为cEVR，未 延长疗程，导致出现所谓的“复发”
HCV RNA下降 值>2 log10 (IU/mL)
要防止RNase降解RNA：
干烤或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理
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Mg2+浓度：
Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，其浓度高低直接 影响着酶的活性与忠实性
Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜，Mg 2+对PCR扩增的 特异性和产量有显著的影响
Mg 2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少
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琼脂糖凝胶电泳
1. 凝胶与电泳缓冲液配制 2.核酸电泳的指示剂与染色剂
溴酚兰 溴化乙锭染色法 3. 电泳： 4. 结果观察：
紫外仪上观察电泳带及其位置，并与 核酸分子量标准比较被扩增产物的大小
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琼脂糖凝胶电泳条带
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
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一、基因体外扩增
是指体外无细胞的分子克隆或酶促扩 增。 以 DNA 或RNA 分子为模板，在 引物诱导下，根据碱基配对原则， 利用反应体系中的 dNTPs 为原料，酶 促合成新的DNA序列，使基因拷贝数 得以增多的技术。
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基因体外扩增方法
聚合酶链式反应（PCR） 以PCR技术为基础的相关技术（逆转录
threshold = 10 × SDcycle 6-15
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Ct 值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重 要的概念 —— Ct值。
C代表Cycle，循环次数。t代表 threshold，阈或界限之意。
Ct值的含义是：每个反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的 循环数。
一般的循环次数选在30～40次之间。 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
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PCR产物检测
终点检测法（定性）
凝胶电泳分析法 点杂交法 微孔板夹心杂交法 PCR-ELISA
实时检测法（定量）
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PCR扩增产物的电泳分析
PCR电泳法是科研不可缺少的手段 琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳
性传播疾病
1.沙眼衣原体（CT） 2.淋球菌（NG） 3.人乳头瘤病毒（HPV） 4.解脲支原体（UU）
性病PCR检测意义：常规的检测方法特异性不强，误诊率 较高，而FQ-PCR具有快速、特异性强、敏感度高、无 交叉反应等优点 ，有效地避免了假阴性假阳性的出现， 结果真实可靠，具有指导意义。
血液标本抗凝剂的选择
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酶及其浓度：
两种Taq DNA聚合酶（Thermus Aquaticus）
从栖热水生杆菌中提纯的天然酶
大肠菌合成的基因工程酶。
浓度：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低 则合成产物量减少
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dNTPs：(A、C、G、T)
dNTPs四种脱氧核苷三磷酸是DNA合成的基本原料 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。 在PCR反应中，dNTP应为50～200 mol/L，浓度过
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PCR反应体系的组成:
• 引物 •酶 • dNTP • 模板 • Mg2+
• 探针
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引物：
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物 的特异性取决引物与模板DNA互补的程度。
PCR引物的要求： 片段特异、长度、 C＋G%、浓度等。
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低又会降低PCR产物的产量太少，出现假阴性。
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模板核酸：
模板核酸提取质量是PCR成败与否的关键 环节之一
提取效率 扩增效率
传统的DNA纯化方法：
热裂解法 蛋白酶消化法
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RBiblioteka BaiduA模板：
RNA模板提取一般采用：
异硫氰酸胍-氯仿-酚抽提法 蛋白酶K法-氯仿-酚抽提法
HBV优化抗病毒治疗路线图
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三、耐药突变检测
根据药物分子结构，目前应用的ＮＡｓ 可分为
Ｌ型核苷类（ＬＡＭ和ＬｄＴ） Ｄ型环戊烷（烯）类（ＥＴＶ） 无环磷酸盐类（ＡＤＶ和ＴＤＦ）
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HBV 耐药 突变 检测 报告
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谢谢大家！
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PCR反应条件的选择
缓冲液: pH 8.3～8.8 ，Tris-HCl缓冲液 10～50mMol/L
PCR反应温度与时间 循环次数
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温度与时间
三温度法：
90 ～ 95℃（94 ℃ 10S）变性 30s 40 ～ 60℃ （55℃ 30S）退火，30s~1min 70 ～ 75℃ （72 ℃ 40S ）延伸，1~2min
建议加用其 他有效药物
52周时,如 果 <200IU/ mL
继续单药治 疗
52周时,如 200IU/mL
建议加用其 他有效药物
建议加用其他有 效药物
丙肝病毒（HCV）荧光定量 检测
慢性丙型肝炎的RGT治疗策略
内标法在抗病毒治疗中的意义
▪ 评价疗效更准确 ▪ 决定治疗方案(药物的剂量？单药还是联合？
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乙肝病毒（HBV）荧光定量 检测
FQ - PCR 可以对乙肝病毒DNA 进 行准确定量，在乙肝的预防、诊断、 治疗上都具有显著的优越性。
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HBV DNA监测在长征之路中的作 用
慢性乙型肝炎核苷类似物应用路线图的中国临床应用
开始核苷类似物治疗
12周HBV DNA: 评估治疗应答 HBV-DNA较基线下降 24周HBV DNA: 更合理的疗效预测点
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（二）实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR技术: 在PCR反应体系中加入荧光探针
基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。
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荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号 作为荧光本底信号，荧光域值的缺 省设置是6-15个循环的荧光信号的 标准偏差的10倍，即：
乙肝病毒（HBV）荧光定量 检测 高度应答
<2.0E2 IU/mL
中度应答
2.0E+2 IU/mL –2.0E+3IU/mL
低度应答
≥ 2000IU/mL)
继续治疗 每3月监测一次
继续治疗 每3月监测一次
52周时,如果 < (200IU/m L
继续单药治 疗
52周时,如果 >103 copies/mL (200IU/mL )
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荧光定量PCR的特点
3.重复性
FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的 CT值相同，但其产物的荧光量却相 差甚大。因为域值设置在指数扩增 期，在此阶段，各反应组分浓度相 对稳定，没有副作用，CT与荧光信 号的对数呈线性关系。
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荧光定量PCR的特点
4.污染率小 全封闭的体系，有效地减小污染的 机率。
PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR、 原位PCR、单细胞PCR等……） 实时PCR PCR产物分析 ……
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（一）PCR技术
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PCR（polymerase chain reaction）
聚合酶链式反应： 指利用模板 DNA、 RNA 为指导，在引物引导下， DNA 聚 合酶促化合成、扩增 DNA 序列的技术。 又称体外分子克隆。
聚丙烯酰胺凝胶的制备 电泳：电压为1-8V/cm 观察：
浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中， 15～30min后取出水洗紫外仪下观察结 果
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PCR电泳法检测的局限性
产物非杂交检测，特异性差 开放操作，扩增产物（百万倍）气溶胶
的污染问题突出 非定量检测，无法观察疗效 肉眼判读，人为误差（扫描） 溴化乙锭的致癌作用
检测RNA病毒，由于RNA极易降解，标本 的制备和保存方式往往可以影响测定结 果，应使用EDTA抗凝，严禁使用肝素。
检测DNA病毒一般用EDTA-K2/Na2或枸 橼酸钠抗凝，不可使用肝素。标本为血 清时，应及时分离出血清，提取病毒 DNA进行检测。
应避免溶血，脂类可干扰PCR反应 。
采血管
二温度点法
94℃变性（ 94 ℃ 5S ） 60℃左右退火与延伸（60℃ 40S）
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循环次数：
循环次数决定PCR扩增量。在其他参数都优化的条 件下，最适循环次数取决于靶序列的初始浓度。初 始浓度较低时，要增加循环次数。酶的活性不好或 量不足时，也要增加循环次数，已达到有效扩增量。
实现了荧光信号的累积与PCR产物形 成完全同步。
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注：探针完整时，报告基团发射的荧光信
号被淬灭基团吸收
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PCR扩增时， Taq酶2020/的12/125’－3’外切酶活性将探针酶切降解36
荧光基团和淬灭荧光基团分离
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每扩增一条DNA链， 就有一个荧光分子形成，
终止治疗
复发
) 国内通用检测限 (<1000 cps/mL
国际标化检测限 (<50 IU/mL)
HCV RNA (IU/mL)
0周
pEVR = 部分应答
12周
24周
治疗时间（周）
cEVR = 完全应答
48周 (EOT)
72周 (SVR)
例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用
例如：HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用
疗程？）
▪ 改变策略（停药？再联合？) ▪ 治疗终点的选择 ▪ 预测复发
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国际乙肝治疗指南对HBV DNA定量PCR要 求
• 超敏感（Hypersensitivity）
—HBV最低检测限＜10-15 IU/ml
• 宽线性范围（ wider dynamic range ）
—涵盖101~109 IU/ml
5.方便、快速、准确 FQ-PCR周期短，自动化程度高，有 非常严密的数学理论支持。
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二、临 床 诊 断 应 用
治疗前 治疗中
选择治疗的人群 选择治疗的时机 选择治疗的方案
? 评价疗效、更换治疗方案、（治疗终点的确定 )
治疗后 疗效持久性评估、监测复发
临床病原体
HBV HCV HIV 结核病（TB） 巨细胞病毒（CMV） 单纯疱疹病毒（HSV）
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PCR.swf原理flash
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实时荧光定量PCR的特点
1.特异性强
FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性， 故与传统的PCR相比，特异性大为提高。
2.灵敏度高
灵敏度可达到102拷贝，线性范围可到达 102 －108拷贝。一般来讲临床标本中病 原体的数目为0-1010/拷贝。
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Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷 贝数的对数存在线性关系，起始拷 贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作 出标准曲线，其中横坐标代表起始 拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
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因此，只要获得未知样品的Ct值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。