表达载体的构建

1.2 按功能分成：
（1）克隆载体：通常都带一个松复制子、一个多克隆位 点和一个筛选标记，目的在缩主细胞内复制形成大量的基因 克隆，被克隆的基因不表达 。 （2）表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表 达元件（如启动子、 RBS 、终止子等）使目的基因能够表达 的载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克 隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的 标志。
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二 构建表达载体的基本步骤
引物设计
目的基因(CDS区）的克隆
目的基因进行酶切
质粒进行酶切线性化，电泳，胶回收纯化
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模板与线性化质粒连接
转化到大肠杆菌DH5α
鉴 定（PCR,测序,酶切）
将表达载体导入表达菌株
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三 载体构建具体范例：
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3 对照的设立
为验证双酶切是否成功，可做如下对照：
（1） 酶切反应时加各单酶分别切两管，用同一种Buffer，跑 胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双 酶切成功。 做转化时，也要进行对照： （2）即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进 一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进 行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功。
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3. 引物的设计
引物直接在GHR编码区起始和末端设计,然后在引 物5’端加上相应的酶切位点。 Forward 5’- CC GAATTC ATGCCACTAAGCACAGCTG -3’ Reverse 5-’ ACGC CCGCGG TCAGTTCACAGAGTGGCA -3’ 特别注意：1.因为需要与GFP融合表达，所以下游引物要去 掉终止密码子TGA 2.不要改变GFP表达的编码框
1. 尽可能除去无关的DNA序列 从而增加载体容量。 2. 选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方 便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合 表达，融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对 转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 3. 选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建 重组子进行酶切时会把靶基因给切开。 4. 在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否则会造成错读密 码子
（3）酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这 一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 。
中国海洋大学 科学馆319 （4）设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。
谢 谢
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4. GHR PCR 扩增，纯化，EcoRI和SacII酶切，纯化 5.质粒提取纯化, EcoRI和SACII酶切线性化，低浓度琼糖电泳， 胶回收纯化 6.模板与线性化质粒连接 7.转化感受态大肠杆菌
8.鉴定（PCR、双酶切和测序鉴定）
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四 构建表达载体注意事项
大菱鲆GHR基因构建入pEGFP载体中
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1. GHR从大菱鲆cDNA模板中扩增
5‘非翻译区
CDS区 内引物
3‘非翻译区
初次PCR引物设计（外引物）
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2. 分析酶切GHR基因酶切位点
将GHR基因mRNA序列的CDS区（蛋白编码区）导入
DNAMAN 软件中，进行酶切位点分析：
表达载体的构建
穆小生
2011.11.3
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一 表达载体介绍
二 构建表达载体的基本步骤
三 载体构建具体范例
四 构建表达载体注意事项 中国海洋大学 科学馆319
一 表达载体的介绍
1.载体的分Βιβλιοθήκη Baidu：
1.1 按进入受体细胞类型分： （1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体
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