深部真菌感染血清真菌成分检测方法研究进展
院内深部真菌感染的调查
体外角质形成细胞 的培养 基是 Ｋ—Ｓ Ｍ， Ｆ 而成 纤维 细胞 的培 养液是 Ｄ Ｍ（ １％ Ｆ Ｓ 。有研究表 明 ： ＭＥ 含 ０ Ｂ ） 血清 可 以促进成 纤维细胞生长 ， 同时抑制 表皮角质 细胞生长 【 。在构建人 工 ３ １ 皮肤模型时需要将两种细胞所建立 的真表皮建立在一共同的
因此 ， 在本 实验 中充 分考虑成纤 维细胞 的生存 条件 相对 较低 ， 有血清即可 ； 而角质形 成细胞则必 须要特定 的培养基 ， 如 Ｋ—Ｓ Ｍ＿ 。同时， Ｆ ４ Ｊ 成纤维 细胞 的倍增时间较短 ， 一般 （ ３～ ４ ｄ可传一代 ； ） 而角质形成 细胞增长较慢 ， 所需倍 增时间较 长， 一般 （ ７ ｄ天传 一代 Ｊ ５～ ） 。根 据两者所需 的不 同生 长环 境 和倍增 时间分别来选择不同的培养基和检测时 间。结果可 见， 使用含 Ｋ—Ｓ Ｍ＋１ ％Ｆ Ｓ和 Ｄ Ｍ＋１％Ｆ Ｓ培养基培 Ｆ ０ Ｂ ＭＥ ０ Ｂ 养成纤 维细胞 的生长增殖情况是相 同的 ； 同时 ， 加入 Ｋ—Ｓ Ｍ Ｆ
５ ｇ ｍ Ｔ＂ 剂 ２ ， 人 ３ ％ ，％ Ｃ 和 １０ ｍ／ ｌ Ｉ Ｍ 试 Ｏ 放 ７ ５ Ｏ ０ ％湿 度下 培
养４ ， ｈ 用移液器小心吸除上清液 ， 每孔加 入二 甲基 亚砜 （ Ｍ— Ｄ
ｓ １０ 放 于 震 荡 器 上 震荡 １ｍｉ ， 于 ３ ｏ １０ 空 气 ｏ）５ ５ ｎ后 再 ７Ｃ，０ ％
湿度下放置 １ｈ充分溶解细胞 内的 甲瓒结 晶 ； ２ 振荡 １ ｍｎ 用 ０ ｉ，
酶标仪器（ ７ ｎ ５ ０ ｍ波长 ） 测每孔的 Ｏ Ｄ值 。
相同步骤重复 ３次 。 １３ 统计学处理 ．
深部真菌病的实验诊断进展
深部真菌病的实验诊断进展深部真菌病指除表皮、毛发、甲床以外，真菌侵犯内脏、皮下组织和黏膜所致的感染，其发生取决于外界致病因素和人体免疫力的相互作用。
常见的病原真菌有念珠菌、曲霉、隐球菌等。
近年来，随着广谱抗生素等药物的广泛应用及免疫抑制剂人群的增多，真菌感染不断增多，已成为应用免疫抑制患者及其他危重病患者的主要死亡原因之一。
据最新统计，每年全球有100万艾滋病患者罹患隐球菌脑膜炎，其中70%在3个月内死亡。
真菌感染的预后有赖于早期治疗，研究显示早期治疗可以提高生存率。
日本一所教学医院收集77例怀疑为深部真菌病的病例，62%早期治疗患者的临床症状和血清学检查提示疾病有好转，而非早期治疗的患者相关改善率仅为21%。
遗憾的是，深部真菌病早期诊断困难，在缺乏依据的情况下，加用抗真菌药物不仅增加治疗成本和患者负担，也增加了发生不良反应的风险。
因此，深部真菌病的早期检测与鉴定受到临床的重视。
现就目前深部真菌病诊断方法作一综述。
一、直接镜检、培养和组织病理学检查一般取痰液、尿液、胸腹腔积液、脑脊液、活检组织等作标本，直接涂片是真菌学检查最经典的方法，具有快速、简便的特点，且可以根据特征性形态区分念珠菌、隐球菌、结合菌等。
无菌体液、皮下组织和各类活检组织标本中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断，如脑脊液墨汁涂片中发现带有荚膜的隐球菌孢子、组织标本中发现真菌菌丝及孢子等。
但直接镜检的检出率很低，从而导致漏诊。
正常人痰液内可有真菌定植，故痰液涂片只有找到致病性真菌才可以确定诊断，找到条件致病性真菌不应轻易诊断为真菌感染，还应结合临床其他方面综合考虑，因此直接镜检法对深部真菌病诊断作用有限[?。
培养法灵敏度低，且周期长，不能为临床提供早期诊断的依据。
组织病理学检查因危重患者很难承受侵袭性的取材方法(如肺组织活检)，也给临床应用带来一定困难。
二、血清学诊断(一)真菌特异性抗原检测1．(1,3)-b-D葡聚糖测定(G试验)：(1,3)-b-D葡聚糖(BG)广泛存在于真菌细胞壁，细菌、病毒、人体细胞及其他病原菌无此成分，故作为真菌抗原有较高的特异性。
常见深部真菌感染性疾病的研究进展
。 成 Βιβλιοθήκη 培养法 １ ］ 次取材直接涂片漏诊率高达 ４ ％， ３次取材 ５ 而
直接镜检 的累积阳性 率可达 ９ ％ｌ 。应用显色培 养法经 ３ ９ ７ ｊ ７ ４ 观察菌落色泽和形态即可做 出鉴定 ， ８ｈ 阳性率 ８ ．％ 。 ８６
３２ Ｇ试 验 ． － 几 乎 各 种 致 病 性 真 菌 细胞 壁 上 均 有 Ｂ１ 一 一— Ｄ葡 ３ 聚糖 。在 真 菌入 血 后 ， 用 ＭＢ８ 生 物 快 速 动 态 检 测 系 统 ， 应 ．Ｏ微
感染 最 易 累 及 肺 部 ， 要 致 病 菌 有 曲霉 菌 、 曲 霉 菌 、 曲 霉 主 土 烟 菌 、 曲霉 菌 ， 中 以烟 曲 霉 菌最 常 见 。 黑 其
３ ３ 血清学检测 常用抗原检测方法有新生 隐球 菌荚膜抗 原 ．
乳胶凝集试验 ， 检测 念珠菌和曲霉菌抗原 的酶联 免疫吸附实验 （ ＨＳ ） ； Ｅ Ａ 等 抗体检测方面有检测 念珠 菌 、 曲霉菌和隐球菌 的单
取 尿 液 或 脑 脊 液等 离 心 去 上 清 ， 检 ， 般 ２ 镜 一 ０—３ ｉ 可 完 ０ｍ ｎ即
条件致病性 真菌主要有念 珠菌 、 隐球菌 、 曲霉菌 、 毛霉 菌 、
放 线 菌 和奴 卡 菌 等 。念 珠 菌 属 在 以 往 的 院 内 感 染 中 占 主 导 地 位 ， 年来 ， 家 的 ９ 个 研 究 室 组 的 全 球 监 测 中心 也 证 明 这 一 近 国 ９
１１ 念珠菌属 ．
念珠 菌属又称假丝酵母 菌， 广泛存 在于 自然
界 中 ， 生 于人 类 的 皮肤 和黏 膜 ， 条 件 致 病 菌 ， 染 易 发 生 于 寄 属 感 严 重免 疫 缺 陷 患 者或 接 受 肠 道外 营养 患 者 的各 个 部 位 ， 白色 以 念珠 菌 致 病 力最 强 。 其 次 是 热 带 念 珠 菌 、 滑 念 珠 菌 、 柔 念 光 克 珠 菌 、 也蒙 念 珠 菌 。但 随 着 预 防 性 药 物 的 应 用 增 多 ， 白色 季 非
深部真菌感染的通用实验诊断技术进展
深部真菌感染的通用实验诊断技术进展
张宏
【期刊名称】《国际医药卫生导报》
【年(卷),期】1999(000)005
【摘要】一、增光剂用于深部真菌病的诊断可作为检查真菌感染时增光剂的物质有Cellufluor、Uvitex和Blankophor,已成功地从皮屑、甲屑、组织、细胞涂片和体液中检出真菌细胞。
1.原理:增光剂Cellufluor、Uvitex和Blankophor均为二苯乙烯类化合物,其化学成分是:Cellufluor为4,4’-bis[Z-di(2-hydroxyethyl)amino-4-phenylamino-1,3,5-triazine-6-ylamino]-stilbene-2,2’-disulphonic acid,sodium salt, Uvitex为4,4’-bis-[z-di(2-hydroxyethyl)amino -4-(3-sulphophenylamino)-1,3,5-triazine-6-ylamino]【总页数】2页(P40-41)
【作者】张宏
【作者单位】暨南大学医学院第一附属医院皮肤科
【正文语种】中文
【中图分类】R756.04
【相关文献】
1.真菌感染实验室诊断技术进展 [J], 李皇;卢平宣;
2.G实验和真菌培养在艾滋病人深部真菌感染中的联合诊断 [J], 张汇征;付晓;万东勇
3.真菌感染实验室诊断技术进展 [J], 李皇;卢平宣
4.真菌感染实验室诊断技术进展 [J], 李皇;卢平宣
5.G实验在早期诊断深部真菌感染中的价值分析 [J], 陈赢
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117血清降钙素原检测对院内深部真菌感染诊断价值的探讨
血清降钙素原检测对院内深部真菌感染诊断价值的探讨南京医科大学附属无锡市第一人民医院 时兢 缪昨方 荣菊芬 沈波 穆会君,无锡 214002 摘要 目的:探讨血清降钙素原(PCT)检测诊断危重病患者院内深部真菌感染(IMI)的价值。
方法:回顾性分析重症监护病房内56例临床资料,并与健康组15例对照。
结果:IMI组较健康对照组血清PCT水平明显升高(P<0.01)。
不同感染部位,以血液真菌感染者PCT水平最高(P<0.01)。
但PCT不能鉴别不同真菌菌株。
结论:PCT可作为危重病患者院内IMI有价值的诊断指标。
关键词 降钙素原 深部真菌感染 院内感染 危重病中图分类号 R519 文献标识码 ADiagnostic V alue of Serum Procalcitonin for N osocomial Deep Mycotic Infection in C ritically ill P a2tients S HI Jing,M IA O Fang,RON G J uf en,et al.W uxi First People’s Hospital A f f iliated toN anjing Medical U niversity,W uxi214002,ChinaAbstract Objective:To evaluate the diagnostic value of procalcitonin(PCT)in critically ill patients with nosocomial invasive mycotic infection(IMI).Methods:56critically ill patients with IMI in inten2sive care unit were retros pectively analyzed.Results:The PCT levels of patients with IMI were signifi2cantly higher than those of control group(P<0.01).The PCT levels of patients with fungemia was thehighest among the different locations of mycotic infection(P<0.01).PCT was unable to differentiatedifferent fungal strains.Conclusion:The measurement of PCT might be used as a valuable index in diag2nosis of nosocomial deep mycotic infection in critically ill patients.K ey w ords Procalcitonin Invasive mycotic infection Nosocomial infection Critical illness 近年来危重病医学进展迅速,重症监护病房(ICU)危重病患者院内感染的发生率明显升高,除常见的细菌感染外,深部真菌感染(invasive mycotic infection,本文简称IM I,下同)亦呈上升趋势。
真菌感染检测方法的研究进展
ｑｑ． ｔｏｍ
乳酸 酚棉 蓝染 色是 比较常用 的一种 染 色方 法 ，
染 色后菌 丝和 孢 子 呈深 蓝 色 。 形态结构清晰， 背 景 干净 ， 反差 大 。乳酸 可杀 灭真 菌 ， 棉 蓝可 使其 着 色 ，
【 摘 要】 近 年 来 ， 随 着抗 生 素 、 免疫抑制剂和激素等的广泛应用 ， 真菌感染有不 断上升的趋势 ， 真 菌 已成 为 医 院感 染 的 常 见 病 原 菌 之 一 。 由于 不 同病 原 菌 对 抗 真 菌 药 物 的敏 感 性 不 同 ， 能 否 准 确 诊 断 病 原 菌 直 接 影 响 药 物 的选 择 。及 时 准确 地 检 测 真 菌 感 染 以及 确 定 菌 种 ， 在 临 床 治 疗 中 尤 为 重 要 。该 文 对 真 菌 感 染 检 测 方 法 的 研 究 进 展 作 一 综 述 。 【 关键词】 真菌感染 ； 病原菌 ； 检 测 方 法
技术 的发 展 ， 有 越来 越多 的方法 可 以应用 于真 菌 的
检测 和鉴 定 。 １ 真 菌 镜 检
菌孢 子与脂 肪滴 有时很 难鉴 别 ， 而荧光 染 色法 对脂 肪滴 不产 生标 记 ， 使 得特 异 性 大 大 提 高 ， 弥 补 了 传
统 的 ＫＯＨ 涂 片 法 在真 菌 数 量 少 时检 出率 不 高 的 不足 。已有许 多文 献 证 实 荧 光染 色 法 在 真 菌 检 测 中较 传统 的 ＫＯＨ 湿 片法 具有 敏感 性 强 、 阳性 率 高
胞、 脂滴 、 气泡 均不 着 色 ， 对 比鲜 明 ， 尤 其 利 于 马 拉
深部真菌病的研究进展1
（二）三种重要的条件致病性 深部真菌感染
念珠菌病
曲霉菌病
马尔菲青霉病
（二）三种重要的条件致病性深部真菌感染
1.念珠菌病
A、致病菌谱变迁 念珠菌是人类最重要的条件致病性
深部真菌。已知可以致病的有：白念珠菌、热带念珠菌、
近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、星状念珠菌、季也蒙念珠
菌、光滑念珠菌、克柔氏念珠菌八种。近年来又发现都柏
三、抗深部真菌药应用进展
深部真菌感染的患者，大多患有严重的基础病，预后严 重，病死率高。但目前治疗深部真菌感染的药物很少，且 大多数仅具抑菌作用，疗程较长，不良反应多。近年来， 研制开发的几种抗深部真菌新药，简介如下：
1.两性霉素B的脂类制剂： a.两性霉素B含脂复合体 b.两性霉素B硫酸胆甾醇脂 c.两性霉素B脂质体 三种两性霉素B 的脂类制剂抗真菌作用与两性霉素B常
还有一些机会性真菌对特殊的高危人群造成威胁，如马拉色菌、毛孢子 菌是新近出现的担子酵母，与白念珠菌一样作为机会性病原被频繁报道，一 些丝状菌如镰 菌、尖端塞多孢菌、毛霉菌也变的日益重要。总之，应记住真 菌是免疫缺陷病人死亡的越来越重要的原因，机会性真菌感染异常严重且可 以致命，快速的早期诊断和有效的治疗非常重要。
主要致病曲霉为：烟曲霉、黄曲霉以及黑曲霉土曲霉、构巢曲 霉等，除了引起肺、脑的深部真菌病外，还可引起耳、鼻、眼皮下 组织坏死的曲霉病，甚至引起血液系统及全身播散性曲霉病。
（二）三种重要的条件致病性深部真菌感染
3.马尔菲青霉病
由于马尔菲青霉主要累及单核巨噬细胞系统，常引起全身广泛播散，病 死率高，是一种重要的深部真菌病。
（三）深部真菌感染的诊断
目前真菌学检查的手段包括：
1.直接显微镜检 2.真菌培养（药敏） 3.组织病理学检查 4.血清学检查：主要应用于系统性曲菌病。常用方法：半乳
深部真菌感染早期诊断的现况与策略
深部真菌感染早期诊断的现况与策略桑军军;潘炜华;廖万清【摘要】The incidence of invasive fungal disease has signiifcantly increased over the past two decades in China. Laboratory test is an important basis for the diagnosis of fungal disease, but the current level of the laboratory diagnosis can not meet the demand for clinical practice. This article reviews the currently available laboratory diagnostic techniques, and points out the dififculties and the development trend of the laboratory test. At the same time, we propose some strategies for early diagnosis of invasive fungal infections based on existing technologies and clinical examination methods.%我国深部真菌感染的发病率明显上升，实验室检查是诊断真菌感染的重要依据，而目前实验室诊断水平远不能满足临床实际需求。
本文对目前现有的实验室诊断技术进行了回顾，指出了目前我国深部真菌感染的早期诊断的难点及发展趋势，并立足现有实验室检查技术及临床检查手段提出了深部真菌感染的早期诊断策略。
【期刊名称】《上海医药》【年(卷),期】2014(000)009【总页数】4页(P4-7)【关键词】深部真菌感染;早期诊断;血清学诊断;分子生物学诊断【作者】桑军军;潘炜华;廖万清【作者单位】第二军医大学附属长征医院上海市医学真菌分子生物学实验室上海200003;第二军医大学附属长征医院上海市医学真菌分子生物学实验室上海200003;第二军医大学附属长征医院上海市医学真菌分子生物学实验室上海200003【正文语种】中文【中图分类】R519;R4461 深部真菌感染现状深部真菌感染指真菌侵入内脏、血液、黏膜或表皮角质层以下深部皮肤结构引起的感染，包括局限性的单一器官感染(如肺念珠菌病)和2个及以上器官或组织受侵犯的系统性真菌感染（如播散性念珠菌病)。
深部真菌感染诊断与治疗现状及进展
医学ppt
6
真菌感染现状
发病率高（占院感5-10%） 死亡率高（IC50% ；IA70～90%） 病情恶化快：
念珠菌血症 诊断后亡率40%
临床、实验室诊断率低
85%的IC无法获得及时诊断及治疗。 50%的IC血培养呈阴性，尸检诊断。
“两高、两低、一快”
医学ppt
7
Can we do better?
CCI≥ 0.5
口咽/直肠拭子≥102；胃液/尿/痰≥105
Pittet D， er al. Ann Surg. 1994 220: 751-758 Piarroux R, et al. CCM. 2004; 32: 2443-2449
真菌评分（Candida Score ）
TPN、手术 、 多部位定植各1分；严重感染2分
用于疾病动态监测, 但不能用于早期诊断
中华内科杂志 2006,45(8)∶ 697
医学ppt
22
Time Axis of Methods for Detection of PA
CT positive
PCR
GM
chest X-ray
ß-glucan
culture histology
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
药物：特治星、安灭菌、氨苄西林、青霉素 真菌：青霉菌、交链包属、拟青霉菌交叉反应 宿主：新生儿肠道内的菌群（双岐杆菌属） 分子表面基团：双歧杆菌脂多糖、隐球菌
医学ppt
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建议： 阴性不能排除IA；阳性应再次测定； 高危者1周监测2次
临床应用：Sandwich ELISA (Platelia) 2002年EORTC/MSG推荐作为IA诊断标准之一 2003年5月FDA批准用于癌症患者IA的临床诊断
国内真菌临床检验技术的研究进展
国内真菌临床检验技术的研究进展真菌感染是近年来新出现的一种新型的临床常见疾病。
由于近几年来医学方面的研究力度逐渐增大，同时研制出很多的新型的治疗方法，其中真菌治疗便是具有代表性的一种。
然而，随着真菌治疗使用的广泛普及，真菌引起的感染疾病也越来越多，这一现象引起了很多人的极度关注。
标签：真菌感染；临床检验；生化检验前言：真菌感染疾病的临床治疗手段比较单一、缺乏有效药物，因此早期诊断、及时检出对提高治愈率、降低死亡率至关重要。
而最重要的是，真菌感染的临床治疗是医院临床检验中最薄弱的一个环节，并且它得到的重视程度远远不够，专业从事这个行业的专业人员又少，所以导致现如今真菌感染疾病临床治疗手段不够完善的局面，因此，我们应当更加重视真菌感染疾病的临床治疗。
1临床致病真菌的分类临床致病真菌按形态学主要分为3大类群：酵母菌、霉菌以及双相型真菌。
这些真菌按致病部位可以分为浅部真菌和深部真菌。
引起浅部感染的多为霉菌，引起深部感染的多为酵母菌和双相型真菌，也有少数霉菌（如曲霉菌、毛霉菌、青霉菌等）。
2我国真菌感染疾病的临床治疗技术的现状目前临床常用的真菌检验方法习惯上分为培养法和非培养法两种，主要包括形态学观查、生化指标检测以及分子生物学测试等。
有关真菌临床检验的一般方法以及国外在相关生化、分子生物学检验方面的研究进展，已有数篇简短的综述。
由于受到工作条件、研究条件和人员素质等多方面的限制，国内对于临床真菌检验方法学的研究相对薄弱，但国内同仁从来没有停止对相关领域的探索。
尤其值得指出的是，由于国内研究完全基于我国现有的临床检验条件，因而工作的开展更有针对性，结果也更有借鉴意义。
3近几年专家研究出的临床治疗手段3.1临床治疗技术之一——形态学观察形态学观察法主要包括直接镜检法和培养法两种最经典的检验方法。
直接镜检法包括湿片镜检和干片镜检两种方法，是一项简易快速有效的方法。
在皮肤科检查、妇科检查、排泄物检查及胸腹水、脑脊液等危重病患者医院内感染的深部真菌病的监测中是快速作出初步诊断的重要手段，但常规检查法检出率甚低，造成诊断上的困难。
深部真菌感染患者血清1-3-β-D葡聚糖检测的临床意义
深部真菌感染患者血清1-3-β-D葡聚糖检测的临床意义发表时间：2016-06-17T10:27:23.853Z 来源：《医师在线》2016年3月第5期作者：姜莉[导读] 深部真菌感染是指致病真菌侵犯皮下组织和内脏等器官，导致器官发生真菌性感染。
姜莉（贵阳市第二人民医院；贵州贵阳550000）【摘要】：目的：讨论血清1-3-β-D葡聚糖检测深部真菌感染的临床意义。
方法：选取我院2015年1月—10月，深部真菌感染患者31例为研究对象，另外在选取20例健康人为对照。
采用MB-80微生物快速动态检测系统测定所有研究对象的血清1-3-β-D葡聚糖的含量。
结果：观察组的患者血清1-3-β-D葡聚糖含量平均值为（5.74±1.35）pg/ml；而观察组的平均值为（268.28±101.07）pg/ml。
观察组的数据明显高于对照组，其差异具有统计学意义（p<0.05）.结论：血清1-3-β-D葡聚糖检测可以在早期为临床提供可靠的感染消息，是一种实用的早期诊断方式。
【关键词】1-3-β-D葡聚糖；深部真菌感染；临床检测深部真菌感染是指致病真菌侵犯皮下组织和内脏等器官，导致器官发生真菌性感染。
具有发病率高、病情快、死亡率高等特点，严重的危害患者的生命安全[1]。
临床中，由于免疫抑制剂、皮质类固醇激素、广谱抗生素和肿瘤化疗药物的大量使用，导致深部真菌感染的发病率不断上升，并且该疾病在发病初期并没有出现什么异常反应，病情容易被隐藏，往往发现时病情已经达到十分严重的地步，因此该疾病在初期时容易出现漏诊或误诊的现象，给患者带来极大的影响[2]。
所以如何在早期快速诊断和治疗深部真菌感染是至关重要的，为了研究检测血清1-3-β-D葡聚糖的临床效果，特选取2015年1月—10月，深部真菌感染患者31例进行研究，现报道如下。
1资料与方法1.1一般资料，选取我院2015年1月—10月，深部真菌感染患者31例为研究对象，男性患者20例，女性患者11例，年龄17至91岁，平均年龄（35.4±5.5）岁，其中泌尿道感染的患者为15例，呼吸道感染的为10例，血液感染的为4例，静脉插管引起感染的为2例。
一种深部真菌早期诊断的方法——测定真菌细胞壁成分(1→3)—β—D—葡聚糖
一种深部真菌早期诊断的方法——测定真菌细胞壁成分（1→3）—β—D—葡聚糖中国医学科学院李岷综述皮肤病研究所中国协和医科大学吴绍熙审校摘要介绍了测定葡聚糖含量的方法及基本原理；讨论（1→3）—β—D—葡聚糖的一些理化性质对测定的影响及它的某些生物活性。
此外，评价了此方法在深部真菌感染模型和临床患者中的实际应用，就其灵敏度和特异度与其他诊断方法进行了比较。
关键词深部真菌病真菌细胞壁（1→3）—β—D—葡聚糖近年来，免疫缺陷患者数量不断增多，使得深部真菌感染率大大升高。
对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。
传统真菌鉴定方法都因周期长、血培养率低而难于快速诊断。
研究者也逐渐将早期诊断的注意力转向建立血清学方法来检测真菌菌体成分或代谢产物，如测定白念珠菌的甘露聚糖、烯醇化酶、D-阿拉伯糖醇等。
鉴于深部真菌感染时，经吞噬细胞处理，菌胞壁降解成分大量入血，90年代初，有学者建立了以检测血浆或血清中真菌胞壁成分（1→3）—β—D—葡聚糖的含量，来早期诊断深部真菌感染，这一方法也已初步应用于动物模型和临床标本上[1-5]。
现对此方法简要综述如下：一．测定（1→3）—β—D—葡聚糖含量的方法及原理真菌胞壁主要成分为多糖，存在方式有两种，一为构成胞壁骨架的微细纤维，二为组成基质的高分子复合物。
前者主要由几丁质和β-葡聚糖组成。
β-葡聚糖在酵母样真菌中含量最高，其形式以β-（1→3）糖苷键连接的葡萄糖残基为骨架作为主链，分枝状β（1→6）葡萄糖残基作为侧链。
有学者偶然发现[1,6] ，真菌胞壁成分（1→3）—β—D—葡聚糖能激活鲎变形细胞溶解物中的G因子，从而旁路活化检测革兰阴性菌内毒素的产色底物法鲎溶解物试验，因激活G因子，故称为G试验。
基本原理如下，鲎变形细胞溶解物中含有B因子、C因子、凝固酶原、G因子等成分。
内毒素能依次激活C因子、B因子，而葡聚糖只活化G因子。
激活的B因子和G因子活化凝固酶原转化为凝固酶。
深部真菌感染检验技术的研究进展
主要适用于：曲霉、镰刀菌、米根霉、波氏假
阿利什霉、申克氏孢子丝菌（菌丝相）等。
2004年检验年会大会发言
2004年6月8-11日
江苏省连云港市
M38-A 方案－菌悬液制备
PDA ， 35℃ 纯化并活化：
--曲霉、波氏霉、米根霉和申克孢子丝菌：7 天
--镰刀菌： 35℃ 48-72h后转至 25-28 ℃至 7天
2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市
M-38-A质控株、参考株及其MIC值范围
菌株 目的 抗真菌药物 MIC范围（µg/ml） MIC 在此范围内的几率 ％ 99.1 99.1 99.0 99.0 近平滑念珠 菌 ATCC22019 质控菌株 二性霉素B 氟康唑 伊曲康唑 酮康唑 Posaconazole Ravuconazole Voriconazole 5 －FC 二性霉素 B 氟康唑 伊曲康唑 酮康唑 Posaconazole Ravuconazole Voriconazole 5 －FC B 二性霉素 伊曲康唑 Posaconazole Ravuconazole Voriconazole 参考菌株 二性霉素B 伊曲康唑 0.5－4.0 1.0－4.0 0.12－0.5 0.06－0.5 0.06－0.25 0.03－0.25 0.03－0.25 0.12 － 0.5 1.0－ 4.0 16－128 0.25－1.0 0.25－1.0 0.12－1.0 0.25－1.0 0.12－1.0 8.0 0.5－ －32 4 0.2－0.5 0.06－0.5 0.5－4 0.5－4 0.5－2 0.12－1.0
2004年6月8-11日
江苏省连云港市
抗真菌药物体外药敏试验
抗真菌药物的体外药敏试验
临床常见深部真菌的实验室检测进展
临床常见深部真菌的实验室检测进展发表时间：2013-11-01T09:33:47.980Z 来源：《医学与法学》2013年第2期供稿作者：王国荣[导读] 深部真菌的血清免疫学鉴定方法尽管有了很大发展,但仍存在耗时长、敏感性低的问题。
近年来,研究者了大量工作,试图应用分子生物学方法鉴定医学重要真菌弥补传统方法的不足。
王国荣（山东省沂南县人民医院检验科山东省沂南县 276300）【摘要】本文以临床常见深部真菌念珠菌、侵袭性曲霉菌、隐球菌和组织胞浆菌为对象，就近年来非培养检测方法的研究进展作一综述。
阐述了真菌胞壁或胞内成分烯醇化酶、beta—葡聚糖、甘露聚糖和Cand—Tec抗原等抗原检测的方法和方法学评价；阐述了PCR、分子杂交等分子生物学方法对这些真菌的各种特异性靶基因的检测，比较各种方法的特异性和敏感性；简述了真菌代谢产物的研究现状。
【关键词】医学检验真菌检测近年来，随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用，器官移植、导管插管等普遍开展，深部真菌感染率越来越高。
引起深部真菌感染的病原菌主要有白色念珠苗、曲菌和隐球菌等。
传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培养耗时长，阳性率较低，组织活检缺乏典型改变，影响早期及正确诊断。
近年来，用于检测真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和特异性基因片段的分子生物学检测已成为这一领域研究的热点。
1真菌胞壁或胞内成分的检测 1.1烯醇化酶（Enolase）烯醇化酶又称2—磷酸—I>甘油盐水解酶或弹力酶，是糖酵解所必需的胞内酶。
烯醇化酶广泛存在于真菌细胞中，含量丰富且高度保守。
它也是白色念珠菌中含量最为丰富的蛋白质之一，研究显示只有在深部白色念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄生在浅表部位的白色念殊菌一般不会释放该酶。
Walsh等采用白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体检测血标本中的白色念珠菌烯醇化酶以确定是否有深部真菌感染，并以组织活检和血培养加以对照。
联合检测法对早期深部侵袭性真菌感染的临床应用研究
紧密结合 ， 同时配合 临床 的症 状 ， 患 者情 况进 行 最 对
终 的确诊 。
３ ３ ＧＭ－ Ｉ 试 验 ． ＥＡ
菌， 已经成 为临床 工作 中 的重 要任 务 。
３ １ 检测侵 袭 性真菌 感染 的方法 ． 目前检测 侵 袭 性 真 菌感 染 的途 径 主 要 有 两 种 ，
性。
研究 报 道指 出 ， 乳 甘 露 聚糖 一 半 酶联 免 疫 分 析 （ ＧＭ—
Ｅ Ａ） Ｉ 可用 于检测 侵袭 性 曲霉病 ， 其 是对 于患有 恶 尤
性 血液病 的 患 者 ， 是 ， 于 进 行 器 官 移 植 的接 受 但 对
者， 这种 检测作 用并 不 明显 ； 若患 者 的侵 袭性 曲霉病
疑似 性较 高 ， ＧＭ— Ｉ 则会 显 示 出 良好 的敏感 性 则 ＥＡ 以及 特 异性 ， 至有 很 高 的 阳性 预 测 值 以 及 阴性 预 甚 测值 ； 被 诊 断 为 高 疑 侵 袭 性 曲 霉 病 患 者 在 ， 其 若 则
文 章 编 号 ： ０ ７ ２ ７ ２ １ ） ６ １ ２ —０ １ ０ —４ ８ （ ０ ２ ０ — １ ２ ３
联 合 检测 法 对 早期 深部 侵 袭 性 真 菌感 染 的临床 应 用研 究
易震 南 ， 东明 黎
（ 东 医学 院 附属 医院 呼 吸 内科 ， 东 湛 江 ５４ ０ ） 广 广 ２０ １
选取 我 院呼 吸科 自 ２ ０ ０ ９年 １月 至 ２ １ ０ ０年 １ ２ 月 收 治 的 疑 为 侵 袭 性 肺 部 真 菌 感 染 的患 者 ， ９ 共 ６ 例 ， 性 患者 ５ 男 ２例 ， 女性 患者 ４ ４例 ， 年龄 皆在 ６ ０岁
血清1,3—β—D—葡聚糖检测对深部真菌病诊断的研究
血清1，3—β—D—葡聚糖检测对深部真菌病诊断的研究目的探讨血清（1，3）-β-D-葡聚糖对深部真菌病的诊断价值。
方法将2014年2～6月天津市武警后勤学院附属医院110份数据（标本140份）分为侵袭性真菌病患者组33例和无侵袭性真菌病组77例，分析比较葡聚糖水平，并使用ROC曲线确定最佳临界值。
结果侵袭性真菌病患者组的葡聚糖水平（279.78±83.26）pg/mL，明显高于对照组（34.05±9.35）pg/mL（P＜0.001）；ROC 曲线下面积为0.946（95%的置信区间为0.904～0.988），当以95.20 pg/mL为临界值时，实验的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为84.8%、93.5%、80.0%和93.3%；临床符合率达到89.1%。
Kappa值0.784（P＜0.05）。
结论血清葡聚糖水平可以用于深部真菌感染的诊断，本研究中用北京金山川公司的GKT-1M Set动态真菌检测试剂盒检测血清葡聚糖水平，进行深部真菌感染诊断时的最佳临界值为95.20 pg/mL，当以此临界值对深部真菌感染进行诊断时，临床一致性较好。
[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value of serum（1，3）-β-D-glucan for deep fungal disease. Methods 110 copies of data（140 specimens）of affiliated hospital of tianjin Armed Police logistics academy from February to June 2014 were divided into the invasive fungal disease group with 33 copies and the non-invasive fungal disease group with 77 copies. The glucan levels were analyzed and compared. The ROC curve was used to determine the optimal critical value. Results The glucan level of the invasive fungal disease group was （279.78±83.26）pg/mL，which was significantly higher than the（34.05±9.35）pg/mL of the control group（P＜0.001）. The ROC area under curve was 0.946（95% confidence interval was 0.904-0.988）；When 95.20 pg/mL was used as the critical value，the sensitivity，specificity，positive predictive value and negative predictive value of experiment were 84.8%，93.5%，80.0% and 93.3%. The clinical accordance rate reached 89.1%. The Kappa value was 0.784 （P＜0.05）. Conclusion The serum glucan level can be used for the diagnosis of deep fungal infection. This study uses the GKT-1M Set dynamic fungal detection kit of Beijing Jinshan Company to detect the serum glucan level. The optimal critical value for deep fungal infection diagnosis is 95.20 pg/mL and when this critical value is used for the diagnosis of deep fungal infection，the clinical consistency is better.[Key words] Deep fungal disease；Diagnosis；Serum 1，3-β-D-glucan；ROC curve现今，尽管存在有效的治疗方法，但是侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）仍然是免疫抑制患者发病和死亡的重要原因[1]。
210944315_深部真菌耐药机制及检测方法研究进展
㊃综述㊃深部真菌耐药机制及检测方法研究进展李敏1赵建平2(1.内蒙古医科大学内蒙古临床医学院,呼和浩特010010;2.内蒙古自治区人民医院检验科,呼和浩特010010)ʌ关键字ɔ深部真菌;耐药机制;检测方法ʌ中图分类号ɔ R519ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ1673-3827(2023)18-0090-07深部真菌感染又称侵袭性真菌感染(i n v a s i v e f u n g a l i n f e c t i o n s,I F I)其致病真菌主要包括念珠菌属㊁曲霉属㊁隐球菌属及毛霉属等㊂全世界因深部真菌感染引起的耐药率不断上升,死亡率居高不下[1],严重威胁患者生命健康㊂随着抗真菌药物被广泛用于治疗深部真菌感染,耐药性的产生严重影响药物疗效[2],如何改善深部真菌的耐药性成为研究热点㊂本文就深部真菌感染现状㊁深部真菌的耐药机制及检测方法展开综述,旨在为临床治疗和控制深部真菌感染提供新的策略㊂1常见深部真菌感染现状1.1侵袭性念珠菌病20世纪70年代以来,随着介入性治疗㊁全胃肠外营养以及广谱抗生素的大量使用,侵袭性念珠菌病的发生率逐年升高[3]㊂侵袭性念珠菌病的临床症状和体征是非特异性的,最常见的临床表型为念珠菌血症[4]㊂念珠菌是最常见的深部真菌感染病原体㊂中国医院侵袭性真菌耐药监测网(C H I F-N E T)的临床研究结果表明:念珠菌属占深部真菌分离株的91.8%,其中又以白念珠菌最为常见(占念珠菌属47.4%)[5]㊂白念珠菌广泛存在于人体的口腔㊁胃肠道㊁泌尿生殖系统等,属于机会性病原菌㊂当机体免疫力低下时,白念珠菌可趁势引起浅部甚至深部真菌感染,这也是医院获得性感染的主要原因㊂近年来,非白念珠菌(光滑念珠菌㊁热带念珠菌以及近平滑念珠菌等)引起感染的病例也在不作者简介:李敏,女(汉族),在读硕士研究生,检验师.E-m a i l: l i m i n19971211@163.c o m通信作者:赵建平,E-m a i l:139********@126.c o m 断增加,这也是临床不容忽视的问题[6]㊂1.2侵袭性曲霉病侵袭性曲霉病大多发生在免疫缺陷的患者中,通常伴随着血液系统恶性肿瘤㊁造血干细胞移植或实体器官移植等危险因素㊂在全世界范围内,侵袭性曲霉病每年大约影响30多万患者,其中大约有1/3的患者有生命危险,死亡率较高[1],对人类健康有巨大影响㊂曲霉感染通常是由呼吸道吸入环境中的分生孢子引起,属于外源感染[7]㊂侵袭性曲霉病亦无特征表现,可表现为各种过敏反应或危及生命的全身感染㊂对于中性粒细胞减少症的患者,如有发热且使用广谱抗生素后无反应,首先考虑是侵袭性曲霉病的早期症状[4]㊂1.3隐球菌病隐球菌病常发生于H I V感染晚期㊁器官移植和癌症化疗患者中,机体免疫力降低使其发生的风险极高㊂隐球菌感染[8]通常是吸入空气中的真菌孢子引起肺部感染,后可传播到中枢神经系统,引起隐球菌性脑膜脑炎㊂据估计,全球每年约发生20多万例隐球菌性脑膜脑炎,导致18万人死亡,隐球菌病已经成为最危险的深部真菌感染之一[9]㊂1.4毛霉病毛霉病过去很少引起关注,与其他深部真菌相比,毛霉引起的深部真菌感染病例较少,但死亡率非常高,在全球新型冠状病毒肆虐的情况下,毛霉病的发病率是以往的50倍[10]㊂毛霉病同样好发于免疫力低下的情况,如患有糖尿病㊁血液系统恶性肿瘤以及烧伤㊁创伤的患者㊂毛霉病[11]临床表现多样化,最常见于鼻眼眶,其次为皮肤㊁肺部和胃肠道等㊂㊃09㊃中国真菌学杂志2023年2月第18卷第1期 C h i n J M y c o l,F e b r u a r y2023,V o l18,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.2常见深部真菌耐药机制现阶段,深部真菌感染仍以药物治疗为主㊂常用的抗真菌药物主要有以下几类:唑类(氟康唑㊁伊曲康唑㊁伏立康唑等)㊁多烯类(两性霉素B㊁两性霉素B含脂质剂等)㊁棘白菌素类(卡泊芬净㊁米卡芬净等)㊁氟胞嘧啶类等㊂然而,多年的临床应用使这些药物的耐药性已经明显增加㊂深部真菌耐药已成为临床治疗深部真菌感染的一大障碍㊂为了制定有效的抗深部真菌感染的治疗方案,我们必须充分了解深部真菌的耐药机制㊂2.1念珠菌属的耐药机制白念珠菌是念珠菌属中最常见的病原菌㊂由于长期㊁大量㊁预防性使用抗真菌药物,白念珠菌的耐药性随之增强㊂靶基因突变在白念珠菌的耐药机制中一直备受关注㊂甾醇14-a去甲基化酶(C Y P51)属于细胞色素P450家族,是麦角甾醇合成的关键酶,可催化羊毛甾醇去甲基化形成麦角甾醇[12]㊂唑类药物可靶向抑制C Y P51,干扰麦角甾醇合成,通过改变细胞膜通透性而达到抗真菌效果㊂E R G1~27是编码C Y P51的主要基因,其中与白念珠菌对唑类耐药性最相关的是E R G11㊂E R G11基因突变会导致氨基酸发生替换,通过改变C Y P51分子结构来降低与唑类药物的结合率,导致白念珠菌耐药[13-15]㊂研究发现,E R G11基因突变主要聚集在其催化位点㊁真菌特异性外环或血红素结合位点附近[16],且伴随的杂合性缺失(l o s s-o f-h e t e r o z y g o s i-t y,L O H),会进一步增强白念珠菌对唑类药物的耐药性[17]㊂当C Y P51被抑制时,E R G3和E R G6会在白念珠菌中合成有毒甾醇,从而减弱了唑类药物对白念珠菌细胞膜的作用,促使白念珠菌产生耐药性[18]㊂棘白菌素类药物相关的1,3-β-D葡聚糖聚合酶由F K S基因(F K S1㊁F K S2㊁F K S3)编码[19]㊂当F K S1的H S区域突变,1,3-β-D葡聚糖聚合酶的结构发生改变,棘白菌素对该酶的敏感度下降,导致白念珠菌会对棘白菌素类药物耐药[20-21]㊂F a r m a k i o t i s等[22]发现,E R G2㊁E R G3㊁E R G6及E R G24基因突变可导致细胞膜中麦角甾醇的结构改变或含量增加,从而降低白念珠菌对多烯类的敏感度㊂药物外排泵是存在于真菌生物膜上的一类蛋白质㊂过度表达的药物外排泵可降低胞内的药物浓度,是白念珠菌耐药的重要机制之一㊂目前,主要有两种药物外排泵:①A B C转运蛋白家族(C d r1与C d r2)的过度表达参与白念珠菌对唑类药物的耐药,N i s h i m o t o等[23]研究发现,C D R1与C D R2的过度表达是通过其启动子内顺式作用元件相互作用来调节的,比如药物反应元件(d r u g r e a c t i o n e l e m e n t,D R E)以及独立基础表达元件(s e p a r a t e b a s a l e x p r e s s i o n e l e m e n t,B B E)有助于C D R1与C D R2的表达㊂L i u等[24]研究发现,由T A C1基因编码的锌族转录因子T a c1能够调控C D R1和C D R2的表达,T A C1基因C端激活域中的共显性突变赋予T a c1的过度活性,从而引起C D R1与C D R2过度表达,增强了白念珠菌对唑类的外排率㊂②M F S转运蛋白家族是降低白念珠菌中药物浓度的主要外排泵之一㊂研究表明,与白念珠菌相关的M F S蛋白约有95种,其中多效耐药蛋白1 (m u l t i d r u g r e s i s t a n c e p r o t e i n1,M d r1p)与唑类药物耐药性的产生相关[25]㊂MD R1是M d r1p的编码基因㊂S h i等[26]发现,过表达的MD R1能够增强外排泵的能力,从而降低胞内的药物浓度,与唑类的耐药性呈正相关㊂锌族转录因子通过影响耐药基因的表达而介导耐药㊂U p c2属于锌族转录因子,可靶向麦角甾醇相关合成基因(E R G11㊁E R G2和E R G5等)[27]㊂研究发现,U P C2的功能获得性突变(g a i n-o f-f u n c-t i o n,G O F)可上调E R G11的表达,降低白念珠菌对氟康唑的敏感性低[15]㊂除了E R G11以外, U P C2的G O F突变也可增加E R G2㊁E R G5㊁E R G9和E R G10的表达,这种突变能够增加唑类药物的耐药性[18]㊂当U P C2基因被敲除时,不仅诱导E R G11的表达被取消,而菌株对唑类药物以及其他药物靶点E R G1㊁E R G2和E G R24也变得敏感[23]㊂此外,锌族转录因子T a c1和M r r1可分别上调C D R1与MD R1,通过调节药物外排泵的表达而影响深部真菌对唑类耐药[28]㊂这更加证实了U P C2调节白念珠菌对唑类药物耐药机制的重要作用㊂白念珠菌形成生物膜以后,比浮游白念珠菌或无生物膜生长的白念珠菌可高出几百倍的耐药性[29]㊂有关生物膜耐药机制十分复杂,上述靶基因突变㊁药物外排泵以及锌族转录因子的过表达都发生于生物膜形成后,其形成过程中的基因表达调控也值得关注㊂有研究证实菌丝壁蛋白1(h y p h a l㊃19㊃中国真菌学杂志2023年2月第18卷第1期 C h i n J M y c o l,F e b r u a r y2023,V o l18,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.w a l l p r o t e i n1,H w p1)是白念珠菌生物膜形成的必需物质,其表达受锌簇转录因子B c r1的调控[15]㊂生物膜形成过程中关键一步为黏附,凝集素样序列(A L S)基因家族控制这一步,其中A L S1与A L S3被锌族转录因子S f p1p负向调控,被B c r1p与E f-p g1p正向调控[30]㊂H s p90是所有真核生物中的一种重要的分子伴侣,其可充当热传感器来控制白念珠菌的形态转变,进而协助生物膜增强耐药性[31]㊂白念珠菌生物膜中的持久细胞对于抗真菌类药物有极强的耐药性㊂当持久细胞处于休眠状态时,抗真菌药物需要更高的最低抑菌浓度(m i n-i m u m i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n,M I C)来达到预期治疗目标[32]㊂2.2曲霉属的耐药机制烟曲霉是侵袭性曲霉病最常见的病原菌㊂治疗侵袭性曲霉病主要应用唑类药物,其中首选伏立康唑㊂在全世界范围内,烟曲霉耐唑菌株的发生率为6.6%~28%[33]㊂烟曲霉的耐药机制主要包括以下几种:①在烟曲霉中有两种基因(c y p51A和c y p51B)编码C Y P51,其中,c y p51A突变是烟曲霉对唑类药物耐药的主要原因[33],突变的c y p51A 改变了C Y P51的分子结构,唑类药物无法与靶点结合,从而使烟曲霉产生耐药㊂c y p51A突变发生于基因序列密码子G54㊁L98㊁Y121和T289㊁G138和M22[34]㊂此外,c y p51A启动子区域的串联重复(T R)序列通过增加甾醇调节元件结合蛋白的活性来驱动c y p51A的过表达,增加的麦角甾醇超出唑类药物抗真菌范围,这也会使曲霉产生耐药性[35]㊂②研究发现,耐药的烟曲霉过表达A B C转运蛋白家族中的C D R1B和a b c A-E,过度表达的外排泵能够降低胞内的抗菌药物浓药度[36]㊂③烟曲霉的生物膜结构有助于其对唑类产生耐药㊂糖磷脂酰肌醇(G P I)锚定蛋白是烟曲霉生物膜的主要组分, G P I锚定蛋白的缺乏影响烟曲霉生物膜的形成及完整性,进而增加对抗真菌药的敏感性[37]㊂④环境因素促使烟曲霉耐药㊂存在于环境中的烟曲霉在反复受到农用杀菌剂的胁迫下,随着氧化应激反应㊁活性氧稳态以及膜流动性发生改变,从而对农用杀菌剂产生耐药[38]㊂黄曲霉是除烟曲霉之外最常见的侵袭性曲霉病病原菌㊂已知的黄曲霉耐药机制有:①靶基因突变影响耐药性㊂c y p51A㊁c y p51C基因突变影响14-α脱甲基酶的结构,导致黄曲霉对伏立康唑的耐药性增加[39]㊂②黄曲霉内酶活性的变化影响耐药性㊂较高的过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,可增加黄曲霉对两性霉素B的耐药性[39]㊂2.3隐球菌属的耐药机制隐球菌感染的治疗因其独特细胞结构而极具挑战性㊂目前,隐球菌的耐药机制如下:①在抗真菌药物的攻击下,隐球菌可由染色体1㊁4㊁6和10的非整倍体介导,改变其基因组的结构㊂这种现象称为异质耐药性,是隐球菌对唑类药物产生耐药性的主要原因[8]㊂②隐球菌的形态学改变也会促进对抗菌药物的耐药性㊂Z a f a r等[40]发现,隐球菌独特的细胞壁结构及其动态的组分能够增强对抗真菌药物的抵抗力㊂③隐球菌对棘白菌素存在固有耐药性,这是治疗隐球菌病的一个限制㊂2.4毛霉的耐药机制大多数的毛霉存在先天的耐药性,这加大了临床治疗毛霉病的难度㊂关于毛霉对抗真菌药物的耐药机制研究较少,可概括为以下几点:①毛霉的先天耐药性也可能与其基因组区域和全基因组的广泛复制有关㊂S a g a t o v a等[41]比对了几个物种中编码C Y P51的基因序列,发现了单位点(Y140F/ H)突变,促进了毛霉对唑类耐药㊂②A B C转运蛋白家族中的多效耐药转运蛋白(p l e i o t r o p i c d r u g r e s i s t a n c e,P D R)与毛霉的耐药性关系密切㊂N a g y 等[42]发现,在8个编码P D R转运蛋白的基因中,缺失的P D R1㊁P D R2基因可提高毛霉对唑类的敏感性,但其中涉及的具体机制尚不明确㊂③C h a n g 等[11]发现毛霉依赖于一种新型瞬时R N A干扰(R N A i n t e r f e r e n c e,R N A i)依赖性机制对抗抗真菌药物,这种新机制属于表突变,表观突变通过沉默多种药物靶基因而促进耐药㊂现已在5-氟甲酸(5-F O A)耐药的表突变株中鉴定出p y r F位点或p y r G 位点沉默㊂3深部真菌耐药性检测方法临床上通常会用抗真菌药物对深部真菌感染导致的高危患者进行经验性治疗,但此种治疗策略会在很大程度上促进耐药性的发展和蔓延㊂此外,不进行或延迟进行治疗又会导致深部真菌感染患者死亡率的增加㊂因此,快速且敏感的检测深部真菌耐药性的方法有助于最大限度地提高患者的疗效㊂3.1药物敏感试验传统的药物敏感试验包括纸片扩散法㊁微量肉㊃29㊃中国真菌学杂志2023年2月第18卷第1期 C h i n J M y c o l,F e b r u a r y2023,V o l18,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.汤稀释法和E-t e s t试验等㊂美国临床和实验室标准化委员会(C l i n i c a l a n d L a b o r a t o r y S t a n d a r d s I n s t i t u t e,C L S I)和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(E u r o p e a n C o mm i t t e e o n A n t i m i c r o b i a l S u s-c e p t i b i l i t y T e s t i n g,E U C A S T)提出的参考方法为微量肉汤稀释法(酵母菌微量肉汤法)㊂此方法在临床应用最为频繁㊂将一定浓度的菌悬液加入药敏条的反应孔内,孵育24~48h后,参考对照杯并按照C L S I与E U C A S T推荐的念珠菌属分界点来判读,得出M I C值,判断真菌对氟康唑㊁伊曲康唑㊁伏立康唑㊁5-氟胞嘧啶以及两性霉素B的敏感性/耐药性㊂值得补充的是,某些念珠菌在使用仪器判读M I C时会出现拖尾现象,从而导致M I C偏高,故必要时需要用肉眼进行判定[43]㊂研究表明, M I C对于深部真菌(念珠菌㊁曲霉㊁隐球菌)感染的治疗非常重要[44]㊂提供抗真菌药物的M I C,有利于支持临床医生合理用药,并能够追踪耐药性的出现㊁阻止其传播㊂但这种方法有一定的局限性:在不同实验室条件下可能会出现不同的结果且所需的培养时间较长㊂当深部真菌感染严重危及患者生命时,临床上难以快速实施有针对性的抗真菌治疗㊂此外,V i t e k-2C o m p a c t型全自动微生物分析仪,可用于真菌鉴定以及M I C值测量,将含有4~6种不同浓度的抗真菌药物的试卡放入待测菌悬液,引入系统中,根据光学扫描原理,自动进行读数判定㊂与微量肉汤稀释法相比,V i t e k-2系统操作简单且方便快捷,现广泛应用于临床㊂但该系统在检测前标本培养需要一定的时间且成本过高㊂3.2基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(m a-t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e o f f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y,MA L D I-T O F M S)MA L D I-T O F M S是近几年发展起来的一种新型软电离质谱技术㊂此方法除了可快速㊁准确地鉴定细菌和真菌以外,近年来还被用于检测深部真菌的耐药性㊂现阶段M S技术主要有两种应用方法:其中一种是将接触不同浓度(高㊁中或零浓度)抗真菌药物的深部真菌分离物进行质谱分析,基于不同的光谱特征变化,创建相关复合指数(c o m-p o s i t e c o r r e l a t i o n i n d e x,C C I),确定类似M I C值的最小轮廓变化浓度(m i n i m u m p r o f i l e c h a n g e c o n-c e n t r a t i o n,M P C C),判断其是否耐药[45]㊂P a u l 等[46]对比了M S技术与微量肉汤稀释法检测34株热带念珠菌(15株耐药以及19株敏感)对氟康唑的敏感情况,实验结果显示16株的M P C C与M I C值相当,其余18株的M P C C比相应的M I C 值低一倍,M P C C和M I C值之间存在高度相关性,而且前者的检测时间缩短为5h㊂虽然在M S技术正式应用于临床之前,还需大量验证其他深部真菌对抗真菌药物的药敏检测情况,但此研究可以表明该技术可以用来快速筛查耐药菌株㊂其二是进行MA L D I生物型抗生素敏感性试验快速分析(MA L D I B i o t y p e r a n t i b i o t i c s u s c e p t i b i l i t y t e s t r a p i d a s s a y,M B T-A S T R A),通过深部真菌的生长程度评估其药物敏感性水平㊂以量化后的M S内标光谱为对照,敏感菌株峰值较低(表示缺乏生长),耐药菌株峰值较高(表示生长良好)[47]㊂V a-t a n s h e n a s s a n等[48]用M B T-A S T R A方法检测白念珠菌和光滑念珠菌对卡泊芬净药敏效果,与微量肉汤稀释法相比,M B T-A S T R A的敏感度㊁特异度以及有效性均为80%~100%,且检测时间为6h㊂这两种基于M S的耐药性检测方法的分析结果具备快速㊁准确㊁客观等优点,有助于临床上为患者及时提供针对性治疗方案,减少经验性抗菌治疗㊂然而,M S技术最理想的应用方法是设定与耐药性或敏感性相关的特定峰值,利用光谱亚型直接测定深部真菌菌株的敏感性/耐药性[47]㊂遗憾的是,这种应用方法尚在理论阶段,还需要进一步的完善㊂3.3聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n, P C R)P C R是一种快速㊁灵敏且准确的方法,通过检测核糖体基因18S或28S㊁中间非编码区I T S1和I T S2,能够在短时间内准确检测病原菌的属和种㊂实时荧光定量P C R(q P C R)因其高度动态性的优势,可通过区分单核苷酸多态性(s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m,S N P)来测定深部真菌耐药[49]㊂在大多数情况下,测量M I C值无法区分耐药菌株是野生型还是非野生型,研究表明q P C R可通过检测F K S基因的特异性突变[50],快速确定棘白菌素耐药菌株类型,具有从遗传基因水平确定深部真菌是否耐药的优势㊂M a e n c h a n t r a r a t等[51]利用q P C R 与M S分别从基因水平和蛋白水平验证了耐药菌株的C D R1与C D R2的表达情况,两者的联合应用可以更好的提高对耐药菌株的检测能力㊂当然, P C R具有核酸提取过程繁杂㊁分析灵敏度可变㊁缺乏标准化及只能检测已知突变位点[52]的缺点㊂因㊃39㊃中国真菌学杂志2023年2月第18卷第1期 C h i n J M y c o l,F e b r u a r y2023,V o l18,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.此,利用P C R检测深部真菌耐药性的方法尚未成熟,未来仍有很大发展㊁改进空间㊂3.4基因测序基因测序的应用极大改变了现代生物学研究方法㊂全基因组测序(w h o l e g e n o m e s e q u e n c i n g, WG S)可以产生大量数据,但覆盖率较低,数据分析负担过重㊂S a n g e r测序耗时过长且高成本㊂与WG S和S a n g e r测序相比,下一代测序(n e x t g e n-e r a t i o n s e q u e n c i n g,N G S)根据其有针对性的测序设计,可在短时间内同时分析大量分离株上千或数十亿个耐药基因片段,不仅降低了成本,而且生成的数据易于管理[49]㊂S p e t t e l等[53]使用N G S对40株耐药白念珠菌和光滑念珠菌中的耐药基因进行测序,检测出54种不同的错义突变㊂共确定了43种突变与耐药相关,其中30株为已知突变,13株为新突变㊂另外,在6株多重耐药的光滑念珠菌中,有两个株的F K S1和C g P D R1均出现突变,充分揭示了光滑念珠菌对唑类和棘白菌素的耐药性㊂实验结果表明N G S不但可以确定不同突变的相关性,而且在患者的深部真菌感染发生多重耐药的情况下,能够检测其潜在性的基因突变[53-54],从而帮助临床在治疗前选用更合适的治疗策略㊂美中不足的是,N G S也存在仪器设备价格高㊁操作难度大㊁数据库不够完善㊁患者治疗成本增加等一些缺陷㊂3.5流式细胞仪流式细胞仪一开始用于研究细菌的生长和代谢,后来也被应用于检测真菌耐药性㊂其通过不同浓度抗真菌药物浓度下的深部真菌的活力变化来评估药敏情况㊂尽管流式细胞术获得药敏的时间相对较短,但因其缺乏标准化,并未得到广泛使用㊂4小结近年来,深部真菌对传统抗真菌药物的耐药情况越来越严重,给临床治疗造成了很大的难度㊂未来如果能全面揭示深部真菌的耐药机制㊁开发出准确且快速检测深部真菌耐药性的方法,将有助于为逆转深部真菌耐药性提供新的治疗靶点,也可以在临床上有效控制深部真菌感染,改善患者的治疗方案㊂参考文献[1]F I R A C A T I V E C.I n v a s i v e f u n g a l d i s e a s e i n h u m a n s:a r e w ea w a r e o f t h e r e a l i m p a c t[J]?M e m I n s t O s w a l d o C r u z,2020,115:e200430.D O I:10.1590/0074-027********.[2]朱丽芳.深部真菌感染研究进展[J].现代医药卫生,2017,33(16):2484-2487.[3]C H OW E W L,P A N G L M,WA N G Y.F r o m J e k y l l t oH y d e:t h e y e a s t-h y p h a l t r a n s i t i o n o f C a n d i d a a l b i c a n s[J].P a t h o g e n s,2021,10(7):859.[4]S C HM I E D E L Y,Z I MM E R L I S.C o mm o n i n v a s i v e f u n g a ld i se a s e s:a n o v e r v i e w of i n v a s i v e c a n d i d i a s i s,a s p e rg i l l o s i s,c r y p t o c o c c o s i s,a nd P ne u m o c y s t i s p n e u m o n i a[J].S w i s sM e d W k l y,2016,146:w14281.D O I:10.4414/s m w.2016.14281.[5]段思蒙,肖盟,黄晶晶,等.2012年度侵袭性真菌耐药监测网(C H I F-N E T)侵袭性酵母菌感染的分布特征[J].中国真菌学杂志,2021,16(4):234-242.[6]F R I A S-D E-L E O N M G,H E R N A N D E Z-C A S T R O R,C O ND E-C UE V A S E,e t a l.C a n d i d a g l a b r a t a a n t i f u n g a lr e s i s t a n c e a n d v i r u l e n c e f a c t o r s,a p e r f e c t p a t h o g e n i c c o m b i-n a t i o n[J].P h a r m a c e u t i c s,2021,13(10):1529. [7]V O N L I L I E N F E L D-T O A L M,WA G E N E R J,E I N S E L EH,e t a l.I n v a s i v e f u n g a l i n f e c t i o n[J].D t s c h A r z t e b l I n t, 2019,116(16):271-278.[8]I Y E R K R,R E V I E N M,F U C,e t a l.T r e a t m e n t s t r a t e g i e sf o r c r y p t o c o c c a l i n f e c t i o n:c h a l l e ng e s,a d v a n c e s a n d f u t u r eo u t l o o k[J].N a t R e v M i c r o b i o l,2021,19(7):454-466.[9]S T O N E N R,R H O D E S J,F I S H E R M C,e t a l.D y n a m i cp l o i d y c h a n g e s d r i v e f l u c o n a z o l e r e s i s t a n c e i n h u m a n c r y p t o-c o c c a l m e n i n g i t i s[J].J C l i n I n v e s t,2019,129(3):999-1014.[10] G A R R E V.R e c e n t a d v a n c e s a n d f u t u r e d i r e c t i o n s i n t h e u n-d e r s t a n d i n g o f m u c o r m y c o s i s[J].F r o n t C e l l I n f e c t M i c r o b i-o l,2022,12:850581.D O I:10.3389/f c i m b.2022.850581.[11] C H A N G Z,B I L L MY R E R B,L E E S C,e t a l.B r o a d a n t i-f u ng a l r e s i s t a n c e m e d i a t e d b y R N A i-d e p e n d e n t e p i m u t a t i o ni n t h e b a s a l h u m a n f u n g a l p a t h o g e n M u c o r c i r c i n e l l o i d e s[J].P L o S G e n e t,2019,15(2):e1007957.[12] O S MA N MO HAM E D A,S U L I MA N MO H AM E D M,A B D E L R A HMA N HU S S A I N M,e t a l.D e t e c t i o n o f a n t i-f u ng a l d r u g-r e s i s t a n t a n d E R G11g e n e m u t a t i o n s a m o n gc l i n i c a l i s o l a t e s o f C a nd i d a s pe c i e s i s o l a t e df r o m K h a r t o u m,S u d a n[J].F1000R e s,2020,9:1050.D O I:10.12688/ f1000r e s e a r c h.24854.2.[13] V U B G,MO Y E-R OW L E Y W S.A z o l e-r e s i s t a n t a l l e l e s o fE R G11i n C a n d i d a g l a b r a t a t r i g g e r a c t i v a t i o n o f t h e P d r1a n d U p c2A t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s[J].A n t i m i c r ob A g e n t sC h e m o t h e r,2022,66(3):e0209821.[14] Z A R E-K H A F R I M,A L I Z A D E H F,N O U R I P O U R-S I S A-K H T S,e t a l.I n h i b i t o r y e f f e c t o f m a g n e t i c i r o n-o x i d e n a n o-p a r t i c l e s o n t h e p a t t e r n o f e x p r e s s i o n o f l a n o s t e r o l14α-d e m-e t h y l a s e(E R G11)i nf l u c o n a z o l e-r e s i s t a n t c o l o n i s i ng i s o l a t eo f C a n d i d a a l b i c a n s[J].I E T n a n o b i o t e c h n o l o g y,2020,14(5):375-381.[15]纪凌云,周爱萍,马俊,等.白念珠菌唑类药物耐药机制研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2019,19(2):218-223.[16] V I L L A S M I L M L,B A R B O S A A D,C U N N I N G H AM J L,㊃49㊃中国真菌学杂志2023年2月第18卷第1期 C h i n J M y c o l,F e b r u a r y2023,V o l18,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.e t a l.A n E r g11l a n o s t e r o l14α-d e m e t h y l a s e-A r v1c o m p l e xi s r e q u i r e d f o r C a n d i d a a l b i c a n s v i r u l e n c e[J].P L o S O n e,2020,15(7):e0235746.[17] P R A S A D R,N A I R R,B A N E R J E E A.E m e r g i n g m e c h a-n i s m s o f d r u g r e s i s t a n c e i n C a n d i d a a l b i c a n s[J].P r o g M o l S u b c e l l B i o l,2019,58:135-153.D O I:10.1007/978-3-030-13035-0_6.[18] B HA T T A C H A R Y A S,S A E-T I A S,F R I E S B C.C a n d i d i a-s i s a n d m e c h a n i s m s o f a n t i f u n g a l r e s i s t a n c e[J].A n t i b i o t i c s(B a s e l),2020,9(6):312.[19] S A T I S H S,P E R L I N D S.E c h i n o c a n d i n r e s i s t a n c e i n A s-p e r g i l l u s f u m i g a t u s h a s b r o a d i m p l i c a t i o n s f o r m e m b r a n e l i p i d p e r t u r b a t i o n s t h a t i n f l u e n c e d r u g-t a r g e t i n t e r a c t i o n s[J].M i c r o b i o l I n s i g h t s,2019,12:1178636119897034.D O I:10.1177/1178636119897034.[20] C A S T A N H E I R A M,D E S H P A N D E L M,D A V I S A P,e ta l.M o n i t o r i n g a n t i f u n g a l r e s i s t a n c e i n a g l ob a lc o l l e c t i o n o fi n v a s i v e y e a s t s a n d m o l d s:a p p l i c a t i o n o f C L S I e p i d e m i o l o g i-c a l c u t o f f v a l u e s a nd w h o l e-ge n o m e s e q u e n c i n g a n a l y s i sf o rd e t e c t i o n o f a z o l e r e s i s t a n c e i n C a n d i d a a l b i c a n s[J].A n t i-m i c r o b A g e n t s C h e m o t h e r,2017,61(10):e00906-17.[21] E N O C H D A,Y A N G H,A L I Y U S H,e t a l.T h e c h a n g i n ge p i d e m i o l o g y of i n v a s i v e f u ng a l i n f e c t i o n s[J].M e th o d s M o lB i o l,2017,1508:17-65.D O I:10.1007/978-1-4939-6515-1_2.[22] F A RMA K I O T I S D,K O N T O Y I A N N I S D P.E p i d e m i o l o g yo f a n t i f u n g a l r e s i s t a n c e i n h u m a n p a t h o g e n i c y e a s t s:c u r r e n t v i e w p o i n t a n d p r a c t i c a l r e c o mm e n d a t i o n s f o r m a n a g e m e n t[J].I n t J A n t i m i c r o b A g e n t s,2017,50(3):318-324. [23] N I S H I MO T O A T,S H A R MA C,R O G E R S P D.M o l e c u-l a r a n d g e n e t i c b a s i s o f a z o l e a n t i f u n g a l r e s i s t a n c e i n t h e o p-p o r t u n i s t i c p a t h o g e n i c f u n g u s C a n d i d a a l b i c a n s[J].J A n t i-m i c r o b C h e m o t h e r,2020,75(2):257-270. [24] L I U J Y,W E I B,WA N G Y,e t a l.T h e H741D m u t a t i o n i nT a c1p c o n t r i b u t e s t o t h e u p r e g u l a t i o n o f C D R1a n d C D R2e x p r e s s i o n i n C a n d i d a a l b i c a n s[J].B r a z J M i c r o b i o l,2020,51(4):1553-1561.[25] F E N G W,Y A N G J,Y A N G L,e t a l.R e s e a r c h o f M r r1,C a p1a n d MD R1i n C a n d i d a a l b i c a n s r e s i s t a n t t o a z o l e m e d i-c a t i o n s[J].E x p T h e r M e d,2018,15(2):1217-1224.[26]S H I H,Z H A N G Y,Z H A N G M,e t a l.M o l e c u l a r m e c h a-n i s m s o f a z o l e r e s i s t a n c e i n f o u r c l i n i c a l C a n d i d a a l b i c a n s i-s o l a t e s[J].M i c r o b D r u g R e s i s t,2021,27(12):1641-1651.[27]寿晓岚,张继丰,葛玉梅.女性生殖道白色念珠菌唑类药物耐药转录因子编码基因U P C2的多态性研究[J].中国卫生检验杂志,2021,31(12):1434-1436.[28] L U N A-T A P I A A,W I L L E M S H M E,P A R K E R J E,e ta l.L o s s o f U p c2p-i n d u c ib l e E R G3t r a n sc r i p t i o n i s s u f f i c i e n tt o c o n f e r n i c h e-s p e c i f i c a z o l e r e s i s t a n c e w i t h o u t c o m p r o m i-s i n g C a n d i d a a l b i c a n s p a t h o g e n i c i t y[J].m B i o,2018,9(3): e00225-18.[29] D E N G K,J I A N G W,J I A N G Y,e t a l.A L S3e x p r e s s i o n a sa n i n d i c a t o r f o r C a n d i d a a lb ic a n s b i o f i l m f o r m a t i o n a nd d r u gr e s i s t a n c e[J].F r o n t M i c r o b i o l,2021,12:655242.D O I:10.3389/f m i c b.2021.655242.[30]王航,阎澜.白念珠菌耐药机制研究进展[J].中国真菌学杂志,2018,13(5):314-317.[31] Y U A N R,T U J,S H E N G C,e t a l.E f f e c t s o f H s p90i n h i b-i t o r g a n e t e s p i b o n i n h i b i t i o n o f a z o l e-r e s i s t a n t C a n d i d a a l b i-c a n s[J].F r o n t M i c r o b i o l,2021,12:680382.D O I:10.3389/f m i c b.2021.680382.[32] L O H S E M B,G U L A T I M,J O H N S O N A D,e t a l.D e v e l-o p m e n t a n d r e g u l a t i o n o f s i n g l e-a n d m u l t i-s p e c i e s C a n d i d aa lb ic a n s b i o f i l m s[J].N a t R e v M i c r o b i o l,2018,16(1):19-31.[33] N YW E N I N G A V,R Y B A K J M,R O G E R S P D,e t a l.M e c h a n i s m s o f t r i a z o l e r e s i s t a n c e i n A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s[J].E n v i r o n M i c r o b i o l,2020,22(12):4934-4952. [34] C H E N P,L I U M,Z E N G Q,e t a l.U n c o v e r i n g n e w m u t a-t i o n s c o n f e r r i n g a z o l e r e s i s t a n c e i n t h e A s p e r g i l l u s f u m i g a-t u s C Y P51A g e n e[J].F r o n t M i c r o b i o l,2019,10:3127.D O I:10.3389/f m i c b.2019.03127.[35] MA C E D O D,B R I T O D E V O T O T,P O L A S,e t a l.A n o-v e l c o m b i n a t i o n o f C Y P51A m u t a t i o n s c o n f e r s p a n-a z o l e r e-s i s t a n c e i n A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s[J].A n t i m i c r o b A g e n t sC h e m o t h e r,2020,64(8):e02501-19.D O I:10.1128/A A C.02501-19.[36]S H I S HO D I A S K,T I WA R I S,S HA N K A R J.R e s i s t a n c em e c h a n i s m a n d p r o t e i n s i n A s p e r g i l l u s s p e c i e s a g a i n s t a n t i-f u ng a l a g e n t s[J].M y c o l o g y,2019,10(3):151-165.[37] MO R E L L I K A,K E R K A E R T J D,C R AM E R R A.A s-p e r g i l l u s f u m i g a t u s b i o f i l m s:t o w a r d u n d e r s t a n d i n g h o wg r o w t h a s a m u l t i c e l l u l a r n e t w o r k i n c r e a s e s a n t i f u n g a l r e s i s t-a n c e a n d d i s e a s e p r o g r e s s i o n[J].P L o S P a t h o g,2021,17(8):e1009794.[38] B U R K S C,D A R B Y A,GóM E Z L O N D OñO L,e t a l.A z-o l e-r e s i s t a n t A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s i n t h e e n v i r o n m e n t:i-d e n t i f y i n g k e y r e s e r v o i r s a n d h o t s p o t s o f a n t i f u n g a l r e s i s t-a n c e[J].P L o S P a t h o g,2021,17(7):e1009711.[39] R U D R AMU R T H Y S M,P A U L R A,C H A K R A B A R T IA,e t a l.I n v a s i v e a s p e r g i l l o s i s b y A s p e r g i l l u s f l a v u s:e p i-d e m i o l o g y,d i a g n o s i s,a n t i f u n g a l r e s i s t a n c e,a n d m a n a g e-m e n t[J].J F u n g i(B a s e l),2019,5(3):55. [40] Z A F A R H,A L T AM I R A N O S,B A L L O U E R,e t a l.A t i-t a n i c d r u g r e s i s t a n c e t h r e a t i n C r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s[J].C u r r O p i n M i c r o b i o l,2019,52:158-164.D O I:10.1016/j.m i b.2019.11.001.[41]S A G A T O V A A A,K E N I Y A M V,W I L S O N R K,e t a l.T r i a z o l e r e s i s t a n c e m e d i a t e d b y m u t a t i o n s o f a c o n s e r v e d a c-t i v e s i t e t y r o s i n e i n f u n g a l l a n o s t e r o l14α-d e m e t h y l a s e[J].S c i R e p,2016,6:26213.D O I:10.1038/s r e p26213. [42] N A G Y G,K I S S S,V A R G H E S E R,e t a l.C h a r a c t e r i z a t i o no f t h r e e p l e i o t r o p i c d r u g r e s i s t a n c e t r a n s p o r t e r g e n e s a n d t h e i r p a r t i c i p a t i o n i n t h e a z o l e r e s i s t a n c e o f M u c o r c i r c i n e l-l o i d e s[J].F r o n t C e l l I n f e c t M i c r o b i o l,2021,11:660347.D O I:10.3389/f c i m b.2021.660347.[43]武芳,张叶毛,赵建平,等.2012 2019年某医院临床分离念珠菌的耐药性监测[J].中国真菌学杂志,2021,16(5): 341-345.[44] B A S S E T T I M,V E N A A,B O U Z A E,e t a l.A n t i f u n g a l㊃59㊃中国真菌学杂志2023年2月第18卷第1期 C h i n J M y c o l,F e b r u a r y2023,V o l18,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g i n C a n d i d a,A s p e r g i l l u s a n d C r y p t o-c o c c u s i n f e c t i o n s:a r e t h e M I C s u s e f u l f o r c l i n i c i a n s[J]?C l i nM i c r o b i o l I n f e c t,2020,26(8):1024-1033.[45] F L O R I O W,T A V A N T I A,G H E L A R D I E,e t a l.MA L-D I-T O F M S a p p l i c a t i o n s t o t h e d e t e c t i o n o f a n t i f u n g a l r e s i s t-a n c e:s t a t e o f t h e a r t a n d f u t u r e p e r s p e c t i v e s[J].F r o n t M i-c r o b i o l,2018,9:2577.D O I:10.3389/f m i c b.2018.02577.[46] P A U L S,S I N G H P,A S S,e t a l.R a p i d d e t e c t i o n o f f l u-c o n a z o l e r e s i s t a n c e i n C a nd i d a t r o p i c a l i s b y MA L D I-T O FM S[J].M e d M y c o l,2018,56(2):234-241.[47] D E L A V Y M,D O S S A N T O S A R,H E I MA N C M,e t a l.I n v e s t i g a t i n g a n t i f u n g a l s u s c e p t i b i l i t y i n C a n d i d a s p e c i e sw i t h MA L D I-T O F M S-b a s e d a s s a y s[J].F r o n t C e l l I n f e c tM i c r o b i o l,2019,9:19.D O I:10.3389/f c i m b.2019.00019.[48] V A T A N S H E N A S S A N M,B O E K H O U T T,L A S S-F LöR LC,e t a l.P r o o f o f c o n c e p t f o r M B T A S T R A,a r a p i d m a t r i x-a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n-t i m e o f f l i g h t m a s s s p e c-t r o m e t r y(MA L D I-T O F M S)-b a s e d m e t h o d t o d e t e c t c a s p o-f u ng i n r e s i s t a n c e i n C a n d i d a a l b i c a n s a n d C a n d i d a g l a b r a t a[J].J C l i n M i c r o b i o l,2018,56(9):e00420-18. [49] G A B A L DóN T.R e c e n t t r e n d s i n m o l e c u l a r d i a g n o s t i c s o f-y e a s t i n f e c t i o n s:f r o m P C R t o N G S[J].F E M S M i c r o b i o lR e v,2019,43(5):517-547.[50] K I D D S E,C H E N S C,M E Y E R W,e t a l.A n e w a g e i nm o l e c u l a r d i a g n o s t i c s f o r i n v a s i v e f u n g a l d i s e a s e:a r e w e r e a d y[J]?F r o n t M i c r o b i o l,2019,10:2903.D O I:10.3389/f m i c b.2019.02903.[51] MA E N C HA N T R A R A T H C,K HUM D E E P,S AMO S O R N S U K S,e t a l.I n v e s t i g a t i o n o f f l u c o n a z o l e s u s-c e p t i b i l i t y t o C a nd i d a a l b i c a n s b y MA L D I-T O F M S a n d r e-a l-t i m e P C R f o r C D R1,C D R2,MD R1a n d E R G11[J].B MC M i c r o b i o l,2022,22(1):153.[52] B U I L J B,Z O L L J,V E RW E I J P E,e t a l.M o l e c u l a r d e t e c-t i o n o f a z o l e-r e s i s t a n t A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s i n c l i n i c a l s a m-p l e s[J].F r o n t M i c r o b i o l,2018,9:515.D O I:10.3389/f m i c b.2018.00515.[53]S P E T T E L K,B A R O U S C H W,MA K R I S T A T H I S A,e ta l.A n a l y s i s o f a n t i f u n g a l r e s i s t a n c e g e n e s i n C a n d i d a a lb i-c a n s a nd C a n d i d a g l a b r a t a u s i n g ne x t g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g[J].P L o S O n e,2019,14(1):e0210397.[54] B I S WA S C,C H E N S C,H A L L I D A Y C,e t a l.W h o l e g e-n o m e s e q u e n c i n g o f C a n d i d a g l a b r a t a f o r d e t e c t i o n o f m a r k-e r s of a n t i f u ng a l d r u g r e s i s t a n c e[J].J V i s E x p,2017,(130):56714.D O I:10.3791/56714.[收稿日期]2022-03-18[本文编辑]施慧(上接第90页)[35] Z E L A N T E T,WO N G A Y,M E N C A R E L L I A,e t a l.I m-p a i r e d c a l c i n e u r i n s i g n a l i n g i n m y e l o i d c e l l s r e s u l t s i n d o w n-r e g u l a t i o n o f p e n t r a x i n-3a n d i n c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t y t o a s-p e r g i l l o s i s[J].M u c o s a l I mm u n o l,2017,10(2):470-480.[36] C U N H A C,MO N T E I R O A A,O L I V E I R A-C O E L HO A,e t a l.P T X3-b a s e d g e n e t i c t e s t i n gf o r r i s k o f a s p e rg i l l o s i s a f-t e r l u n g t r a n s p l a n t[J].C l i n I n f e c t D i s,2015,61(12): 1893-1894.[37] B R U N E L A S,WO J T OW I C Z A,L AMO T H F,e t a l.P e n-t r a x i n-3p o l y m o r p h i s m s a n d i n v a s i v e m o l d i n f e c t i o n s i n a-c u t e l e u k e m i a p a t i e n t s r e c e i v i n g i n t e n s i v e c h e m o t h e r a p y[J].H a e m a t o l o g i c a,2018,103(11):e527-e530. [38]WO J T OW I C Z A,L E C OM P T E T D,B I B E R T S,e t a l.P T X3p o l y m o r p h i s m s a n d i n v a s i v e m o l d i n f e c t i o n s a f t e r s o l-i d o r g a n t r a n s p l a n t[J].C l i n I n f e c t D i s,2015,61(4):619-622.[39]H E Q,L I H,R U I Y,e t a l.P e n t r a x i n3g e n e p o l y m o r-p h i s m s a n d p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s i n c h r o n i c o b s t r u c t i v ep u l m o n a r y d i s e a s e p a t i e n t s[J].C l i n I n f e c t D i s,2018,66(2):261-267.[40] L I H,L I U L,Z H O U W,e t a l.P e n t r a x i n3i n b r o n c h o a l v e-o l a r l a v a g e f l u i d a n d p l a s m a i n n o n-n e u t r o p e n i c p a t i e n t s w i t hp u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s[J].C l i n M i c r o b i o l I n f e c t,2019, 25(4):504-510.[41] T A N G T,D A I Y,Z E N G Q,e t a l.P e n t r a x i n-3p o l y m o r-p h i s m s a n d p u l m o n a r y f u n g a l d i s e a s e i n n o n-n e u t r o p e n i c p a-t i e n t s[J].A n n T r a n s l M e d,2020,8(18):1142. [42] N A T H R,B A R U A H S,S A I K I A L,e t a l.M y c o t i c c o r n e a lu l c e r s i n u p p e r A s s a m[J].I n d i a n J O p h t h a l m o l,2011,59(5):367-371.[43] C H OWD H A R Y A,S I N G H K.S p e c t r u m o f f u n g a l k e r a t i t i si n N o r t h I n d i a[J].C o r n e a,2005,24(1):8-15.[44] X I E L,Z HO N G W,S H I W,e t a l.S p e c t r u m o f f u n g a l k e r-a t i t i s i n n o r t h C h i n a[J].O p h t h a l m o l o g y,2006,113(11):1943-1948.[45] G U P T A M K,C H A N D R A A,P R A K A S H P,e t a l.F u n-g a l k e r a t i t i s i n n o r t h I n d i a;S p e c t r u m a n d d i a g n o s i s b y C a l-c o f l u o r w h i t e s t a i n[J].I nd i a n J Me d M i c r o b i o l,2015,33(3):462-463.[46]MA HMO U D I S,MA S O OM I A,A HMA D I K I A K,e t a l.F u n g a l k e r a t i t i s:A n o v e r v i e w o f c l i n i c a l a n d l a b o r a t o r y a s-p e c t s[J].M y c o s e s,2018,61(12):916-930. [47] Z HA N G J,Z H A O G Q,Q U J,e t a l.E a r l y e x p r e s s i o n o fP T X3i n A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s i n f e c t e d r a t c o r n e a[J].I n tJ O p h t h a l m o l,2018,11(7):1084-1089.[48] Z H A N G J,Z HA O G,L I N J,e t a l.R o l e o f P T X3i n c o r n e-a l e p i t h e l i a l i n n a t e i mm u n i t y a g a i n s t A s p e r g i l l u s f u m i g a t u si n f e c t i o n[J].E x p E y e R e s,2018,167:152-162.D O I:10.1016/j.e x e r.2016.11.017.[收稿日期]2022-06-19[本文编辑]陈雪红㊃69㊃中国真菌学杂志2023年2月第18卷第1期 C h i n J M y c o l,F e b r u a r y2023,V o l18,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.。
rDNAITS序列鉴定深部真菌菌种的研究进展
ｂｐ之间。
ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析的应用原理 ｒＤＮＡ上的１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓ ｒＤＮＡ基因序列进化
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ均被正确检测出，结果与生化检测和形态 学鉴定的结果一致，且检测时间（６ ｈ）远远小于生 化检测（２６ ｈ）和形态学鉴定（８２ ｈ）所需时间。 速率慢且相对保守，存在广泛的异种同源性，其中 小亚基１８Ｓ ｒＤＮＡ序列常被用来研究属及属以上 分类群的演化关系，大亚基２８Ｓ ｒＤＮＡ中的Ｄ１／Ｄ２ 区域可用于属及临近等级的分类群＂Ｊ。ｒＤＮＡ—ＩＴＳ 由于不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较 小，进化速率较快，具有广泛的序列多态性，在其保 守性上表现为在种内不同菌株之间高度保守，而在 真菌种间差异明显，这种特点使得ＩＴＳ适合于真菌 物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明 显的菌群间的系统发育关系分析【８ｊ。ＩＴＳ区域相 对较短，能够很容易根据其保守区设计通用引物， 进行ＰＣＲ扩增，且该序列具有重复的多拷贝特性， 使ＩＴＳ区很容易从少量、稀疏或高度降解的ＤＮＡ 样品中获得一１。
由于ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列能准确快速地反映出属
间、种间以及菌株间的碱基对差异，目前已越来越
万方数据
・１２４・
澳大利亚的９６株新生隐球菌菌株的ＩＴＳ区进行序
序列存在４种亚型。中国发现的原新生隐球菌上
列分析，并明确地将新生隐球菌鉴定至变种水平。
Ｗａｔａｎａｂｅ等ｕ副曾对１２个国家的临床标本中分离 的２０４株申克孢子丝菌的ＩＴＳｌ、５．８ＳＲＮＡ基因和 ＩＴＳ２区测序分析，发现在各株之间碱基对差异一 般是８个以内，最大差异率是３．２％，而在申克孢 子丝菌和Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｉｓ ｓｔｅｎｏｃｅｒａｓ之间碱基对的差异 率是１０％以上。
存在费时及易受实验条件影响等不足，核糖体ｒＤＮＡ—ＩＴＳ序列分析法已越来越广泛的应用于真菌属内不同种间的系统发育 研究中。本文综述了核糖体ｒＤＮＡ．ＩＴＳ鉴定深部真菌菌种的研究进展，展望了其应用前景。
深部真菌感染血清真菌成分检测方法研究进展
深部真菌感染血清真菌成分检测方法研究进展
廖军;郝飞
【期刊名称】《国际检验医学杂志》
【年(卷),期】2002(023)002
【摘要】烯醇化酶、beta-葡聚糖、甘露糖和Cand-Tec等是真菌胞壁或细胞内的组成成分.文中就其生物学特性及其作为深部真菌感染宿主的特征性标志物在诊断深部真菌感染中的价值等方面加以综述.
【总页数】2页(P85-86)
【作者】廖军;郝飞
【作者单位】第三军医大学西南医院皮肤科,400038;第三军医大学西南医院皮肤科,400038
【正文语种】中文
【中图分类】R446.112
【相关文献】
1.血清(1-3)-β-D-葡聚糖检测对深部真菌感染辅助诊断的价值 [J], 孙晓红;帅丽华;汪红;潘斌
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3.呼吸道深部真菌感染检测方法分析 [J], 郭治伟
4.深部真菌感染患儿血清PCT、HBP、SAA变化与预后的关系 [J], 李倩;丁翔宇;张古英
5.血清1-3-β-D葡聚糖和降钙素原联合检测在深部真菌感染诊断中的价值 [J], 张增美;张文瑜
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深部真菌感染血清真菌成分检测方法研究进展
1.1病例选择深部真菌感染患者35例，年
真菌在人体中，与细菌之间起着重要的生态平衡作用。
近年来，随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用，器官移植、导管插管普遍开展，深部真菌感染率越来越高。
据统计，近30年深部真菌感染的发病率增加了3-5倍，真菌感染为艾滋病的重要死亡原因之一。
引起深部真菌感染的病原菌主要有白色念珠菌、曲菌和隐球菌等。
传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培养历时太长，且阳性率较低，而深部真菌感染的临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏曲型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法所起的作用极为有限。
近年来，用于检则真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。
目前的血清学检查主要针对真菌胞壁或胞内成分——烯醇化酶、beta-葡聚糖、甘露糖和Cand-Tec抗原等。
烯醇化酶
烯醇化酶又称2-磷酸-D甘油盐水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化磷酸甘油盐向磷酸烯醇式丙酮盐转变，同时也在糖异生过程中催化逆向反应。
烯醇化酶广泛存在于真菌细胞中，含量丰富且高度保守。
它也是白色念珠菌中含量最为丰富的蛋白质之一，近年来已被分离纯化。
研究显示只有在深部白色念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄生在浅表部位的白色念珠菌一般不会释放该酶。
Walsh等采用白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体检测血标本中的白色念珠菌烯醇化酶以确定是否有深部真菌感染，并以组织活检和血培养加以对照。
在组织活检或血培养中阳性的24例肿瘤患者中，抗原阳性18例，146例组织活检或血培养阴性的肿瘤患者中中，抗原阳性6例。
敏感性和特异性分别为75%和96%。
另外烯醇化酶在体内具有很强的抗原性，导致其在体内清除较快，数量减少，及抗折色念珠菌烯醇化酶抗体与其它念珠菌烯醇化酶有较弱的交叉反应，均可导致烯醇化酶在体内不能检出。
ZÖller等在免疫健全和免疫缺陷的混合人群占以血清中是否含有抗烯醇化酶抗体来诊断深部念珠菌病，其特异性和敏感性分别为96.4%和81.5%。
我们可通过监测患者血清中抗烯醇化酶抗体及抗体滴度的动态变化来提高烯醇化酶抗体检出率及临床应用价值。
2 Beta-葡聚糖
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%-90%。
其中（1→3）-beta-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，尤其在酵母样真菌中其含量可更高，其形式以（1→3）-beta-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状（1→6）-beta-D-葡聚糖残基作为侧链.cf gf (1→3)-beta-葡聚糖在深部真菌感染中的作用，Yoshida M等认为可能与内毒素在革兰氏阴性杆菌感染中的作用类似，但目前暂未明了。
由于（1→3）-beta-D-葡聚糖仅广泛存在于真菌的细胞壁中，当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，（1→3）-beta-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液（如尿，脑脊液，腹水，胸水等）中（1→3）-beta-D-葡聚糖含量增高。
当真菌在体内含量减少时，机体免疫可迅速清除（1→3）-beta-D葡聚糖。
而在浅部真菌感染中，（1→3）-beta-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。
20世纪90年代初发现，（1→3）-beta-D-葡聚糖可特异性激活自鲎变形细胞溶解产物提取的G因子，从而旁路激活鲎试验，此过程称为G试验。
临床上，由于深部真菌感染的严重程度常常与血浆多糖的升高水平一致，故可将G试验应用于深部真菌感染的诊断（包括念珠菌感染和曲菌感染等）。
为了解G试验在深部真菌感染和真菌性发热中的诊断价值，Oba-yashi等检测了202例病员标本。
（1→3）-beta-D-葡聚糖的血浆浓度20pg/ml为界值，41例确诊病员（以活检和培养阳性为标准）中有37例为阳性，阳性率为90%；59例其他原因所致发全部阴性，阴性率为100%；102例不明原因发热有26例阳性102wgqji明原因发热当作非真菌感染的话，则本试验的阳性率为59%，阴性率为97%，有效率为85%。
若有一个能区别非真菌和真菌感染的更敏感的金标准的话，则可进一步提高本试验的阳性指标率。
（1→3）-beta-D-葡聚糖可用于早期诊断深部真菌感染，其缺点是不能定性，且此法不能检测出隐球菌感染，可能是因为隐球菌具有厚壁胞膜，且在免疫缺体内生长缓慢，导致试验呈假阴性。
Kawayana等检测了92例病员标本以比较深部真菌感染中血清学方法和培养的临床价值，其中17例为深部真菌病确诊病员。
在取自17例确诊病员的52份血标本中，45份血标本G试验阳性，与此同时，仅有10份血标本真菌培养阳性，结果显示，G试验在深部真菌感染的早期诊断中具有较高敏感性和特异性。
甘露糖
甘露糖是目前研究最为广泛的一种抗原，它对热稳定，广泛存在于真菌胞壁中，是真菌胞壁的重要组成成分，它的主要结构为D-甘露糖，由N-连接（90%）和O-连接（10%）的寡糖组成，N-连接的甘露糖以一个外展性α-1，6-寡甘露糖为骨架，α-1，2-和α-1，3-连接的寡甘露糖为侧链。
O-甘露糖由短的、线性α-1，2-和α-1，3-连接的寡甘露糖组成。
甘露糖在不同真菌中的含量和作用不是恒定不变的，常常受周围环境的营养状态和细胞形态的影响。
其在真菌致病过程中参与了免疫调节、防御，且抗甘露糖抗体具有保护性作用。
已有多种血清学方法用于外周循环中甘露的检测，包括Pastorex法、FACE法（免疫荧光碳氢化合物电泳）等。
Kume等使用Pastorex法检测深部念珠菌血症得到其特异性和敏感性分别为28.6%和91.7%。
但它并不与克柔念珠菌的甘露糖发生反应，故不能应用于克柔念珠菌病的诊断。
由于甘露糖广泛存在于各真菌细胞中，导致此检测方法特异性很低，限制了它的临床应用。
FACE法是一种用于检测寡糖的免疫荧光碳氢化合物电泳方法，由于甘露糖由大量的寡糖组成，Goins等应用FACE法将不同大小的寡糖分离开来，可帮助鉴别不同菌株的念珠菌，包括克柔念珠菌，所以此法是一种易行的、敏感的定量方法，并可用于研究寡糖在真菌致病过种中的作用。
4 Cand-Tec抗原
Cand-Tec抗原是指可用念珠菌属检测系统（Cand-Tec,一种颗粒凝集试验系统）检测的一类念珠菌蛋白抗原，它对稳定，至少包含3种成分。
Tananka等将100例病员根据Cand-Tec 乳胶凝集反应的反应滴度分为两组。
滴度低于1：2的为C1组，高到1：4的为C2组。
结果显示，当滴度高于1：4时，对于不明原因的发热进行预防性抗真菌治疗是有利的。
Iwasaki等检测了12例急性白血病病员在化疗后发生的12次发热，相对于化疗前，化疗后的Cand-Tec 抗原端度有明显增高，而在进行抗真菌治疗后有9次发热抗真菌治疗有效，同时Cand-Tec抗原滴度明显降低或恢复正常；2例抗真菌治疗无效且其Cand-Tec抗原滴度也无降低。
结果提示此种方法是一种可用于早期诊断深部念珠菌病的快速、有效的方法，可用于决定进行抗真菌治疗的时间。
Mitsutake等比较上述四种方法，他们以免疫凝集反应检测烯醇化酶，以Cand-Tec系统检测Cand-Tec抗原，G试验检测beta-葡聚糖，Pastorex法检测甘露糖，39例病中包括10例
浅表念珠菌感染，10例深部真菌感染。
结果分别为：烯醇化酶、Cand-Tec抗原、beta-葡聚糖和甘露糖的特异性和敏感性分别为100%和71.8%、76.9%和87.5%84.4%和87.5%、25.6%和100%，结果显示，深部真菌感染的血清真菌成分检查快速、有效、当患者经抗真菌治疗病情好转后，血清滴度可逐渐降低，但尚无一种方法的敏感性和特异性令人满意，如能结合两种以上方法进行检测，则可明显提高诊断的准确性。