分子克隆技术
生物学实验室中的分子克隆技术
生物学实验室中的分子克隆技术分子克隆技术是生物学中非常重要的技术之一，它可以用于生物学研究、医学诊断、基因治疗等方面。
而生物学实验室中的分子克隆技术也是其中重要的一环。
下面让我们来了解一下生物学实验室中的分子克隆技术。
什么是分子克隆技术？分子克隆技术就是将DNA从一个物种中剪切出来，然后将其插入到另一个物种的DNA中，从而制造出具有新的遗传特征的重组DNA。
这种技术可以在DNA分子水平上对基因进行操作，而且是一种广泛应用于分子遗传学和生物化学的技术。
分子克隆技术在生物学实验室中的应用生物学实验室中的分子克隆技术有很多应用，下面介绍一下几个比较常见的应用。
1. 基因克隆分子克隆技术可以用于基因克隆。
这种技术可以从一个物种中分离出一个基因并进行改组，然后插入到另一种物种的DNA中。
通过基因克隆，可以研究某个特定基因的功能以及作用机制。
基因克隆也可以用于设计药物、疫苗和农作物改良等领域。
2. 亚克隆亚克隆技术是一种通过制造DNA片段并插入到克隆向量（如质粒）中来实现的分子克隆技术。
亚克隆技术可以用于分析基因功能、生物学过程、新药开发等领域。
此外，亚克隆技术也可以用于产生大量的DNA片段，以用于DNA测序等分子生物学实验。
3. PCR扩增PCR扩增是一种用于扩增特定DNA序列的方法。
PCR扩增利用酶的催化作用，在高温条件下在目标DNA片段两端分别链接一个引物，然后进行DNA复制和扩增。
基因组DNA或cDNA如此扩增后，可以进行克隆、测序或其他实验。
PCR扩增技术可用于分析DNA序列变异和DNA指纹鉴别。
这些都是分子克隆技术在生物学实验室中应用的一些例子。
分子克隆技术的应用非常广泛，可以用于基础研究和应用研究。
这种技术的应用正在不断扩展，将来还有很大潜力。
分子克隆技术的发展分子克隆技术的发展与进步可以追溯到上世纪70年代，这是DNA重组技术的诞生时期。
此后，在分子克隆技术的不断发展和完善下，许多新技术得以发展出来，如亚克隆、PCR扩增、RT-PCR等技术。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆技术
分子克隆技术分子克隆技术是一种以DNA技术开展生物学研究的新方法。
它可以非常有效地复制出大量基因序列，从而为更深入地解析基因组给出生物特性提供可能。
作为一种生物信息学技术，分子克隆技术基本上利用质粒或载体把被学习的DNA片段提取出来，通过该质粒或载体可携带DNA片段，并用作接种细菌的载体，解析基因组的形态结构及功能。
分子克隆技术的发展历史自20世纪70年代的DNA克隆的研究开始，经过几十年的发展，它在许多领域都取得了巨大的成就，如医学、生物工程、食品处理等。
该技术使得研究人员可以获取精确的DNA信息，并为复制基因序列提供迅速、低成本、高效率的方法，为科学家研究基因组和解析生命过程提供了强大的工具。
分子克隆技术的应用在世界范围内非常广泛，有很多诸如基因定位、基因突变、DNA测序、转基因有机体、基因工程植物、分子诊断等应用。
例如，经过分子克隆技术，科学家可以定位出特定生物中的特定基因，并直接拷贝该基因，使它聚集成为一个基因组，用于基因突变和异位表达，以解析基因组的结构和功能。
研究人员还可以利用这种技术研究基因的进化史，研究基因的转移路径以及特定物种在进化过程中的变化，更多地了解物种的进化。
此外，分子克隆技术在药物研究以及重大疾病的预防和治疗过程中也发挥着至关重要的作用。
例如，非洲猪瘟是一种严重危害猪类及其产品安全的传染病，经过分子克隆技术，研究人员获得了病原体所对应的基因，为预防和治疗猪瘟提供了重要的基础。
此外，分子克隆技术还可用于生产重要的生物制品，包括激素、抗体、细胞因子、抗生素及病原体的疫苗等。
它使得科学家可以迅速地制造出各种重要的生物制品，对人类健康有着重要意义。
值得一提的是，最近几年，随着基因组学技术的飞速发展，分子克隆技术也取得了长足的进步，使科学家能够非常准确地表达基因，并开展全基因组测序及基因功能分析。
许多生物学实验，如基因表达、RNA干扰、体细胞基因修饰等都依赖于分子克隆技术或相关技术的支持。
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
单击此处添加正文具体内容
主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆法
分子克隆法
分子克隆法是一种分子生物学技术，用于在体外制备和复制DNA 分子，包括基因、DNA片段和整个染色体。
这种技术允许科学家复制和操纵DNA，以进行各种研究和应用，包括基因工程、药物开发和基因治疗。
下面是分子克隆法的主要步骤：
1.DNA提取：首先，需要从源材料（通常是细胞或组织样本）中
提取DNA。
这可以通过细胞裂解和蛋白质分离等方法来完成。
2.DNA切割：提取的DNA通常是大片段，需要将其切割成较小
的片段，以便后续克隆。
这一步通常使用限制性内切酶来实现，
这些酶可以在特定DNA序列上切割。
3.DNA连接：切割后的DNA片段可以通过DNA连接酶与载体
DNA（如质粒或病毒DNA）连接在一起，形成重组DNA分子。
这个过程称为DNA重组。
4.DNA转化：重组DNA可以被引入宿主细胞中，这个过程称为
DNA转化。
这可以通过热激冷却法、电穿孔法、化学法等方法
来实现。
5.宿主细胞培养：转化后的细胞被培养，以允许它们繁殖并扩增
重组DNA。
6.筛选与识别：在宿主细胞中，可以筛选出携带重组DNA的细
胞，通常使用抗生素抗性标记或荧光标记等方法来进行筛选。
7.DNA提取与纯化：从筛选出的细胞中提取和纯化重组DNA，
以便进一步的研究或应用。
8.分析与验证：最后，分析和验证克隆的DNA，确保它是所需的
目标DNA，并不包含错误或突变。
分子克隆法有许多应用，包括基因表达、基因编辑、蛋白质生产、疾病研究等。
它在生物学研究和生物工程领域发挥着关键作用，允许科学家操纵和研究DNA，以深入了解生命的分子机制。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
分子克隆技术的基本原理与应用
分子克隆技术的基本原理与应用分子克隆技术是一种重要的生物学实验技术，它通过复制DNA分子来生成大量相同的DNA分子，并将其插入到宿主细胞中，从而实现对基因的精确操控和研究。
本文将介绍分子克隆技术的基本原理和应用。
一、基本原理分子克隆技术主要包括DNA片段的制备、载体的选择、DNA插入和转化等步骤。
1. DNA片段的制备DNA片段可以通过多种方法获得，例如PCR扩增、限制性内切酶切割、化学合成等。
其中，PCR扩增是最常用的方法，它利用DNA聚合酶酶与引物的特异性序列，选择性地复制目标DNA序列。
2. 载体的选择载体是DNA分子在宿主细胞中复制和表达的媒介。
常用的载体包括质粒、噬菌体、人工染色体等。
选择载体时需要考虑其复制数目、大小、选择标记和表达效率等因素。
3. DNA插入将目标DNA片段与载体连接形成重组DNA，常用的连接方法有限制性内切酶连接、DNA连接酶连接等。
连接后的重组DNA称为重组载体。
4. 转化将重组载体导入宿主细胞中，使其内复制和表达。
转化方法多种多样，包括化学法、电渗法、电穿孔法等。
二、应用领域分子克隆技术在许多领域都有重要的应用，主要包括基因工程、基因功能研究和药物开发等方面。
1. 基因工程基因工程利用分子克隆技术对特定基因进行精确操控，可以实现基因的克隆、修饰和表达。
通过基因工程，可以生产重组蛋白、转基因植物、转基因动物等，为农业、医学和工业等领域提供了许多重要的应用。
2. 基因功能研究分子克隆技术为基因功能研究提供了有力的工具。
通过构建基因敲除、基因突变或过表达等模型，可以研究基因在生物体发育、生理、代谢等方面的功能和调控机制，深入了解生物体的生物学过程。
3. 药物开发分子克隆技术在药物开发中起到了重要的作用。
通过分子克隆技术可以快速高效地获得特定基因的大量DNA片段，从而加速对新药靶点的筛选和鉴定，提高药物研发的效率。
总结：分子克隆技术由于其独特的原理和广泛的应用领域，成为现代生物学研究中不可或缺的技术手段。
分子克隆技术
分子克隆技术分子克隆技术是指利用体外的人工方法将一个DNA分子（称为目的DNA）复制到一组DNA分子（称为载体DNA）中的过程。
这项技术能够在体外精确复制和扩增DNA分子，从而可以用于研究基因功能、制备重组蛋白、基因治疗等领域。
下面是分子克隆技术的详细步骤：1.选择载体DNA：首先需要选择一个合适的载体DNA，一般会使用细菌的质粒作为载体，因为细菌质粒具有稳定、易扩增和实验操作简单的特点。
2.制备DNA片段：将目的DNA通过PCR扩增或者其他方法制备出来。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶在体外将目的DNA的特定序列进行大规模复制的过程，一般需要利用引物引导PCR反应。
3.处理载体DNA：将载体DNA进行处理，一般需要进行酶切。
通过选择性酶切酶将载体DNA的一部分切除，形成切口，为接下来的目的DNA连接提供空位。
4.连接DNA：将目的DNA与处理后的载体DNA连接起来。
一般利用DNA连接酶进行连接，将目的DNA的末端与载体DNA的末端互补连接。
连接反应通常需要一定时间和温度来保证连接的效率和稳定性。
5.转化细胞：将连接好的DNA转化到细菌等宿主细胞中。
这一步可以通过热激转化、电转化等方法实现。
转化后，将细胞培养在含有相应抗生素的培养基上，只有携带目的DNA的细菌才能存活，从而筛选出含有目的DNA的克隆。
6.筛选克隆：通过筛选抗生素抗性或其他标记物的方法来筛选出含有目的DNA的细菌克隆。
一般需要进行筛选接种、PCR鉴定、酶切及测序等手段来确认克隆是否含有目的DNA，并进一步分析目的DNA的表达和功能。
这些步骤是分子克隆技术的基本流程，但在实际操作中可能会根据具体情况进行相应的调整和优化。
分子克隆技术的发展和应用使得我们可以对基因进行精确操作和研究，对于推动生命科学的发展和应用具有重要的意义。
分子克隆技术
大肠杆菌转化体系的 建立：感受态菌制备 经氯化钙处理的大肠 杆菌能够摄取质粒 DNA。 1.双抗性（TerKar)重组 质粒DNA及双抗性转 化大肠杆菌细胞的获得。
2.真核动物非洲爪蟾 的基因在原核细胞中 转录
意义：1.解决了无复制能力的DNA片断在宿主 细胞中进行繁殖克隆的关键问题；2.质粒分子 可作为基因克隆的载体将外源DNA分子导入宿 主细胞；3.真核细胞的基因可被转移到原核细 胞中进行克隆及表达。
分子克隆技术
分子克隆（molecular cloning）
又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术
克隆（Clone） 指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
分子克隆 指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体 （质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合---重组DNA分子 （重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达， 即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。
基本原理： 将编码某一多肽 或蛋白质的基因（外 源基因）组装到细菌 质粒（质粒是细菌染 色体外的双链环状 DNA分子）中，再将 重组质粒转入大肠杆 菌，这样重组质粒就 随大肠杆菌的增殖而 复制，从而克隆基因 或表达出外源基因编 码的相应多肽或蛋白 质。
At Stanford Berg and his colleagues spliced two DNA molecules together in vitro and were able to insert a set of three genes responsible for metabolizing galactose in Escherichia coli into the SV40 DNA genome.
分子克隆原理
分子克隆原理分子克隆是指利用DNA重组技术，将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA中，然后将这些重组的DNA导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达的过程。
分子克隆技术是生物学研究中的重要工具，它不仅可以用于基因的克隆和表达，还可以用于分析基因的结构和功能，研究蛋白质的结构和功能等。
分子克隆的原理主要包括DNA片段的获取、载体DNA的选择、DNA片段与载体的连接、重组DNA的导入宿主细胞等几个步骤。
首先，要获取感兴趣的DNA片段，可以通过PCR扩增、限制酶切割等方法进行。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶酶和引物将目标DNA片段在体外进行大量复制，从而获得大量的目标DNA片段。
限制酶切割是指利用特异性的限制酶切割DNA，从而获得特定的DNA片段。
其次，选择合适的载体DNA。
常用的载体包括质粒、噬菌体、人工染色体等。
质粒是一种环状的DNA分子，可以在细菌中进行复制和表达。
噬菌体是一种侵染细菌的病毒，可以将外源DNA插入到其基因组中。
人工染色体是一种由人工合成的染色体，可以在宿主细胞中稳定复制和表达。
然后，将DNA片段与载体DNA连接。
这一步通常需要利用DNA 连接酶将DNA片段与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化、转染等方法导入到宿主细胞中。
最后，重组DNA在宿主细胞中进行复制和表达。
宿主细胞通常选择大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。
在宿主细胞中，重组DNA会进行复制，使得宿主细胞中含有大量的重组DNA。
重组DNA还可以通过转录和翻译过程进行表达，从而产生感兴趣的蛋白质。
总的来说，分子克隆原理是利用DNA重组技术将感兴趣的DNA 片段插入到载体DNA中，然后导入宿主细胞中进行复制和表达。
这一技术在基因工程、蛋白质表达、基因功能研究等领域有着广泛的应用，对于推动生物学研究和生物技术的发展起着重要的作用。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介二、分子克隆实验材料与设备三、分子克隆实验步骤1.设计引物2.合成目的基因3.构建表达载体4.转化受体细胞5.筛选转化子6.鉴定目的基因四、分子克隆实验注意事项五、实验结果分析与应用正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，通过复制特定DNA序列，将目的基因在受体细胞中稳定表达。
该技术在基因工程、生物科学等领域具有广泛应用，有助于研究基因功能、蛋白质表达及药物筛选等。
二、分子克隆实验材料与设备1.实验材料：DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液等。
2.实验设备：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、分子克隆实验步骤1.设计引物根据目的基因序列，设计一对互补的引物。
引物应具备一定的特异性，避免非特异性扩增。
2.合成目的基因利用PCR技术，以DNA模板为基础，通过引物扩增目的基因。
反应条件需根据所使用DNA聚合酶的要求进行优化。
3.构建表达载体将目的基因与载体DNA连接，形成表达载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4.转化受体细胞将构建好的表达载体转化到受体细胞中，如大肠杆菌、酵母等。
转化方法有化学法、电转化法等。
5.筛选转化子转化后的受体细胞在含相应抗生素的培养基上生长，筛选出含有目的基因的转化子。
6.鉴定目的基因对筛选出的转化子进行进一步鉴定，如DNA测序、基因表达分析等。
四、分子克隆实验注意事项1.实验过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.选择合适的引物长度和退火温度，以提高扩增特异性。
3.转化受体细胞时，注意操作力度，避免细胞损伤。
4.筛选转化子时，严格控制抗生素浓度，避免过度筛选。
五、实验结果分析与应用1.分析PCR产物，判断目的基因是否成功克隆。
2.鉴定目的基因的表达水平，评估实验效果。
3.将成功克隆的目的基因应用于基因敲除、基因表达等研究。
通过以上步骤，您可以顺利完成分子克隆实验。
实验过程中需严格操作，确保实验结果的准确性。
分子生物学分子克隆技术
克隆示意图
克隆技术流程
分 切 连 转 筛
分
分离 来自生物组织 、扩增 设计引物,PCR扩增 mRNA-------DNA------扩增
引物设计与订购
酶切位点
双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液,
引物订购
保护碱基
1.用限制性酶消化 DNA 样品
单酶切
双酶切
选择合适的双酶切缓冲液
提取正确的克隆菌中的质粒,转入表达型的菌株,如BL21等,诱导表 达蛋白
鉴定方法
鉴 定
PCR
原 位 杂 交
免疫学方法 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出
蛋白质的纯化
谢谢
多利诞生的过程
为什么震惊和惊呼,我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和 体细胞克隆的区别这两个基本问题,对我们学习后面内容或许有所帮助和 启发,
四、分子克隆的技术支撑
核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术 细菌转化技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应 PCR 技术 DNA序列测定技术
核酸凝胶电泳
细菌转化技术 包括感受态细胞制备
聚合酶链反应 PCR 技术
大规模生产生物活性物质
野生细胞
目的基因高效表达规律
1. 目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达方式 2. 对于翻译后需要修饰蛋白质结构,能够进行目的蛋白结构修饰的
表达方式 3. 能够将目的蛋白分泌到细胞（ZHOU）质、特别是分泌到细胞外
的分泌型表达方式 4. 降低不含目的基因细胞的比例,保持目的基因的稳定性,使目的基
因在宿主细胞内长时间超持和表达 5. 通过选择好的培养方法和能够进行高密度培养的细胞,提高细胞
1 真核基因组庞大而复杂,不易制得基因图谱,
分子克隆技术
Transformation
Culture in the medium containing antibiotic
E.Coli without vector die
E.Coli with vector grow
PCR
RT-PCR RTase
基因克隆需要一些工具酶。
Taq DNA Pol
Target DNA fragment
获取目的基因片段的几种方法：
（一）体外扩增法
1、DNA聚合酶链式反应（PCR）
2、逆转录-PCR（RT-PCR）NA的体外扩增 1、PCR
基本程序：
模板的变性 引物的退火 新链的延伸
如何利用PCR技术获得目的基因片段？
1、确定目的基因
G C T T A A A A T T C G
nick
Annealing
G A A T T C C T T A A G
nick
Sealed
T4 DNA ligase
Sealed
G A A T T C C T T A A G
T4 DNA连接酶连接单链切口：
应用T4 DNA连接酶时需注意的问题：
（1）低温操作。连接酶对温度非常敏感，很容 易失活。 （2）连接时，可根据厂家的建议选择最佳温度 和时间，一般16oC连接需要12-16小时。
CT……….. GA………. CC……….. GG………. GATCC…. G….
…..A …..TTCGA
…..G …..CTTAASticky endAGCTT…. A….
AATTC…. G….
有两种粘性末端：
1）5-端突出的粘性末端
5 ………GAATTC……… 3 3 …… CTTAAG……… 5
分子克隆技术及其应用
分子克隆技术及其应用分子克隆技术是指利用特定的分子生物学方法，在实验室中制备出与原细胞完全一致的生物体或物质的一种技术。
这种技术于1970年代被首次开发并应用，随着技术的不断完善，现今已广泛应用于基因工程、生物医药、农业等领域。
一、基本概念及原理分子克隆技术包括以下基本步骤：1.基因重组 2.转化 3.繁殖 4.筛选。
其中，基因重组指将被复制的DNA序列插入向量DNA中，形成重组质粒；转化是将重组质粒引入宿主细胞中，形成重组宿主细胞；繁殖是让重组宿主细胞自我复制，使其得到强大的繁殖能力；而筛选则是从繁殖出的重组宿主细胞中筛选出目的基因并放大。
具体而言，基因重组可以通过酶切、连接、转移等操作实现。
首先，将要克隆的DNA序列以及向量DNA进行酶切，用限制酶切分别切断它们的中间部分，得到“粘性末端”。
接着，将两者的“粘性末端”连接起来，形成插入向量，再将其转移到细胞中。
重组宿主细胞的选择一般依据所传递的向量类型选择合适的细胞系，如大肠杆菌、酵母等。
繁殖过程中，选定的细胞在合适的培养基中生长繁殖，细胞数目呈指数级增长，几天后细胞就可达到数百万个。
最后，通过特定的方法筛选出所需的克隆基因就完成了整个克隆过程。
二、分子克隆技术的应用分子克隆技术已成为现代生物技术的重要手段，被广泛应用于基因工程、生物医药、农业等领域。
1.基因工程分子克隆技术的应用最为广泛的领域，也是发展得最为成熟的领域之一。
利用分子克隆技术，科学家们可以构建基因工程菌株，来生产大量特定的蛋白质，如生长激素、乳糖酶等，以及进行人工基因的定点突变。
此外，还可利用分子克隆技术将外源基因植入植物、微生物等生物体中，来实现短期内大规模的基因导入，如通过基因工程技术开发新品种作物等。
2.生物医药分子克隆技术也为生物医药领域带来了新的变革和机遇。
利用它可以生产出各种高质量的同位素、抗体、药物、疫苗等生物标本，以及对病毒、细菌、疾病等进行精准治疗。
也可以用于研究基因的构造、调控和功能等信息，进一步提高人类对癌症、心脑血管疾病等重大疾病的认识和治疗水平。
分子克隆技术
分子克隆技术实验操作手册课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。
分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。
实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和分子杂交两大部分：分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting等。
Southern blotting 是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。
DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。
本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。
在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。
为让学生初步了解有关RNA的操作过程注意事项，我们还列出Northern blotting的操作步骤以供选择。
目录系列一分子克隆技术 (4)实验一质粒的制备 (4)实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳 (5)实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆 (7)实验四感受态细胞的制备 (9)CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 (9)电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 (10)实验五质粒的转化及转化子的鉴定 (11)热激法转化实验步骤： (11)质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 (12)实验六PCR技术 (12)系列二 Southern杂交技术 (14)实验一植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法） (14)实验二总DNA质量检测及酶切 (15)实验三电泳、转膜 (16)实验四Southern Blotting (18)系列三 Northern Blotting (24)实验一RNA Extraction (mini prep) (24)实验二RT-PCR (Reverse transcription PCR) (26)实验三RNA的电泳，转膜和杂交 (28)附录试剂配方 (29)一细菌培养试剂 (30)二质粒抽提试剂 (30)三DNA操作试剂 (31)四RNA操作试剂 (34)Stock Solution: (34)Work Solution (35)系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）
分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。
其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。
由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入到不同的子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。
（一）质粒DNA的制备质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环DNA分子，它能赋予细菌（宿主细胞）某些特定的遗传表型。
质粒并非细菌生长所必需，但由于其编码一些对宿主细菌有利的酶类，从而使宿主细菌具有抵抗不利自身生长的因素如抗药性等的能力。
目前发现的质粒主要分为F质粒（性质粒），R质粒（抗药性质粒），E.coli质粒（大肠杆菌肠毒素质粒）。
根据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可将质粒分为严紧型（低拷贝，复制1-2次）和松弛型（高拷贝，复制10-200次）。
由于质粒的不相容性细菌经分裂后就只留下了拷贝数较高的一种质粒，例如R1和R2两种抗药性质粒同属于一类，由于不相容性使它们不能共存于同一细菌中，但不同类群的质粒可以在一个细菌中共存。
质粒存在于细菌中，所以制备质粒DNA时，首先应将含有质粒的细菌在含有相应抗生素的液体培养基中生长至对数期,使质粒在细菌中得到扩增。
通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA变性，然后再加中和液，使溶液PH值恢复到中性，这样质粒DNA又可以复性至天然双链构象状态，而细菌染色体DNA不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体DNA与变性蛋白质缠绕在一起，易被离心去处，而质粒DNA仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最后经离心即可得到质粒DNA。
分子克隆技术的概念
分子克隆技术的概念分子克隆技术，这可真是个让人又好奇又有点摸不着头脑的东西啊！不过别担心，听我给您细细道来。
您知道吗？分子克隆技术就像是一个神奇的建筑师，能在微观世界里搭建出我们想要的“大厦”。
想象一下，我们的细胞就像是一个巨大的建筑工地，里面有各种各样的材料和工具。
而分子克隆技术呢，就是指挥这些材料和工具的设计师和工程师。
它到底是怎么回事呢？简单来说，就是把一段我们感兴趣的基因，比如说能让植物抗病虫害的基因，从原来的基因组中“剪”下来，然后再“粘”到一个载体里，就像把一块珍贵的宝石镶嵌到一个漂亮的戒指托上。
这个载体呢，就像是一辆小货车，能把这段基因运送到我们想要的地方，比如运到细菌里，让细菌帮我们大量生产这个基因所编码的蛋白质。
这是不是有点像我们搬家？把家里最心爱的东西挑出来，打包好，然后搬到新的房子里去。
只不过分子克隆技术搬的不是家具，而是基因！再打个比方，分子克隆技术就像拼图游戏。
我们要从一堆杂乱的基因碎片中，找到我们需要的那一块，然后把它准确无误地拼接到正确的位置上，形成一个完整的、有特定功能的基因组合。
那分子克隆技术有啥用呢？用处可大了去啦！比如说，我们可以用它来生产药物。
有些药物的成分是蛋白质，通过分子克隆技术，让微生物大量生产这些蛋白质，不就能满足我们的需求了吗？这不就像是有了一个超级工厂，源源不断地为我们制造宝贝！还能用来研究基因的功能。
把一个基因克隆出来，放到别的生物里，看看会产生什么效果，不就能知道这个基因到底是干啥的啦？这难道不有趣？而且啊，在农业上也能大显身手。
把优良的基因克隆到农作物里，让农作物长得更好、产量更高，这不就能让农民伯伯乐开花嘛！您瞧瞧，分子克隆技术是不是很神奇？它就像一把神奇的钥匙，能打开微观世界的大门，让我们看到更多的奥秘，创造更多的可能。
它就像一个魔法棒，轻轻一挥，就能给我们的生活带来巨大的改变。
所以说，分子克隆技术可真是个了不起的东西，您说呢？。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子克隆技术生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！克隆载体ll是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序 列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。
其共性有四点： 1. 启动自发复制的能力. 2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。
3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA 4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片 段。
生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生pBR322物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生pBR322物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体，有2个抗 药性基因（四环素和氨 苄青霉素），一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。
当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化 时，它便从该质粒获得 了抗生素抗性。
两个抗 生素基因中均含供插入 外源DNA用的不同的单一 酶切位点。
一般只选一 个抗生素基因作为插入 外源DNA之用。
外源DNA 插入后该抗生素抗性失 活。
另一抗生素抗性基 因则作为转化细菌后筛 选阳性克隆之用。
生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！四个重要位点l (1)负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！pUC系列质粒l是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。
在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。
如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！pUC19生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！pUC18 和 pUC19l单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域含有CAP （代谢物活化蛋白）结合位点, 启动子Plac, lac 阻遏蛋白结合位点 编码beta-半乳糖苷酶N-端的多肽的 lacZ基因的5‘端(来自 M13mp18/19).。
这个多肽片段的 合成可受IPTG诱导， 与突变菌(mutation lacZDM15)实 现 alfa互补。
生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子pUC18和 pUC19生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！pUC19图生物秀-专心做生物！w w w .b b i o o .c o mpBluescript II KS/SK 生物秀-专心做生物！w w w .b b i o o .c o mM13mp18/19结构图生物秀-专心做生物！w w w .b b i o o .c o m生物秀-专心做生物！w w w .b b i o o .c o m-专心做b b i o o .cLambda噬菌体载体生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！cos质粒l 是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！cos质粒 载体生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！一个典型的质粒克隆技术涉及5步用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 l 4) 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 5) 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选l 1)生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！克 隆 示 意 图生 物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！克隆示意图1. 用限制性酶消化 DNA 样品生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生粘性末端物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！2.用 限制 性内 切酶 消化 质粒 DNA生 物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！3.连接样品DNA和质粒DNA的 消化产物生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生冷循环器物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！转化细菌有两个基本方法。
一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以 促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进 DNA 吸收。
生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！4.用连接产物转化大肠杆菌感 受态细胞用氯化钙化学转化生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！用氯化钙化学转化生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生电激转化物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！一个电激转化程序50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细 菌中 l 将混合物放入一个预冷的电激杯中 l 施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8 to 12ms l 立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡 2-4 小时。
分别取10ul 和 100ul 涂布在到两个加有 抗菌素的LB 琼脂平板上， 保温培养1 天。
生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！l加l 连接会有三种结果，一是要插入的序列自连；二是切开的质粒重连；三是 要插入的序列与质粒相连。
第一种连 接结果没有菌落形成。
第二种连接结 果表现为蓝色菌落。
只有后一种结果 是符合需要的，产生白色的抗氨苄青 霉素菌落。
生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！5. 细菌在加有Amp+X-Gal的培 养基上生长以进行筛选灭 菌 器生 物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！加IPTG和X-GAL生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！倒平板生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！划 线生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！筛选结果l 蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的α LacZ序列编码的功 能性的 α 片段 l 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉 素菌，质粒上α LacZ序列上有插入 片段生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！重 组 体 筛 选生筛选结果模式图物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！蓝 菌 落生物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生蓝菌落物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！蓝 白 菌 落生 物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生蓝白菌落物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！生蓝白菌落物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！乳糖和诱导物IPTG的化学结构物 ww 秀 -专 w. bb 心 io 做 o. 生 co 物 m ！isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside生。