水稻转基因方法及培养基配放个
水稻转基因组织培养步骤
水稻转基因组织培养步骤农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4?7H2O 3.7gCaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录：第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。
5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。
实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125mlTE （pH8.0）：1M Tris-HCl （pH8.0）：5ml 0.5M EDTA （pH8.0）：1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
水稻转化方法
水稻转化方法1．愈伤组织的诱导选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2 s-1）。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2．农杆菌的准备农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。
3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。
3．愈伤组织和农杆菌的共培养挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。
同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4．农杆菌的洗脱将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
水稻转基因实验操作手册整理解析
水稻转基因实验操作一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、预培养将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。
预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。
乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、农杆菌（工程菌）培养把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。
3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。
分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、感菌与共培养1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
水稻转基因策略-第三版
水稻转化体系的构建（第三版，2015年3年10日）N6D 诱导愈伤，前培养2N6-AS 共培养N6DS 筛选MS-NK 再分化MS-HF 生根AB 农杆菌生长MSL 侵染N6D 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min2N6-AS 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gCasamino acid 0.3gSucrose 30gGlucose 10g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml AS（200mg/L）不要吹的太干，该培养基要湿度高一些较好。
N6DS 1LChu N6Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-NK 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Casamino acid 2gSucrose 30gSorbitol 30gNAA 0.02mg/LKinetin 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-HF 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Sucrose 30gGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃AB 200mlGlucose 1gAgrose 3gAB Buffer(20倍) 10mlAB Salt (20倍) 10mlddH2O 180ml120℃15min 冷却至50℃加相应的抗生素。
水稻转基因方法及培养基配放个
根癌农杆菌介导的转化方法将水稻成熟种子去壳。
仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。
挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。
离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。
将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。
转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。
新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。
将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。
农杆菌介导转化水稻所用培养基-1-1 626蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖，pH7.0AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2预分化与分化再生MSPR MS（Murashige和Shog，1962）盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，50g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA, 5mg·L-1ABA ，3.0g·L-1Phytagel, pH 5.8，50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素。
转基因的步骤
1.5 农杆菌介导的水稻快速转化1.5.1 各种培养基成分水稻快速转化的培养基成分如表2-1，N6D培养基用于愈伤组织诱导和筛选，2N6-AS 为共培养培养基，AAM 用于配制农杆菌浸染液，RE-III 为分化培养基，HF 为生根培养基，AB 培养基用于农杆菌的活化。
其中，配制固体培养基时，固定剂使用0.4%的Gerite。
1.5.2 种子的消毒（1）水稻成熟种子去壳；（2）置70%乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5 次；（3）在每50ml 的 2.5%次氯酸钠溶液中滴 1 滴吐温20 混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗 5 次；（4）在 2.5%次氯酸钠溶液中再灭菌15min，无菌水清洗 5 次。
1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。
1.5.4 浸染液的制备（1）取出 1.4 中所保存的含有目标质粒的单克隆，吸取50μl 保菌液均匀涂布于固体AB培养基上，AB培养基中含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，28℃条件下培养2-3d；（2）刮取AB 培养基上的农杆菌，用AAM 重悬农杆菌，用AAM 稀释至OD600为0.1。
1.5.5 愈伤组织侵染和共培养（1）取出诱导5-8d 的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘；（2）将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；（3）取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液；（4）在2N6-AS 培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM 浸湿；（5）将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS 培养基；（6）在25℃、黑暗条件下共培养3d。
1.5.6 抗性愈伤的筛选（1）共培养愈伤组织的洗涤：取出共培养的愈伤组织，放入含400mg/L 羧苄青霉素的抑菌液中清洗，共洗 5 次，每次浸泡6min左右；（2）倒去洗涤液，将愈伤组织移到无菌滤纸上，尽量蘸干愈伤组织表面的液体；（3）将愈伤组织均匀平放于N6D+培养基上，32℃、常光照条件下培养，直到新的愈伤组织长出，需两周左右。
转基因水稻培育实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将具有特定功能的基因导入水稻中，培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供新的途径。
二、实验原理转基因技术是指将外源基因导入目标生物体基因组中，使目标生物体获得新的性状或功能。
本实验采用农杆菌介导法将目的基因导入水稻中，通过基因重组，使水稻获得抗病、抗虫、抗逆等优良性状。
三、实验材料1. 水稻品种：Oryza sativa L.（籼稻）2. 抗病基因：Xa213. 抗虫基因：Bt蛋白基因4. 抗逆基因：海藻糖合成酶基因5. 农杆菌：Agrobacterium tumefaciens EHA1056. 实验试剂：限制酶、DNA连接酶、质粒、抗生素等四、实验方法1. 目的基因的克隆与构建（1）从基因库中获取抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的DNA序列。
（2）利用PCR技术扩增目的基因。
（3）将扩增的目的基因与载体质粒连接，构建重组质粒。
2. 农杆菌转化（1）将重组质粒转化农杆菌EHA105。
（2）将转化后的农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，筛选阳性克隆。
3. 转化水稻（1）将阳性农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
（2）将农杆菌与水稻叶片接触，进行转化。
4. 筛选转基因植株（1）将转化后的水稻苗移栽至田间，进行抗性鉴定。
（2）根据抗性表现，筛选出转基因植株。
5. 分子鉴定（1）提取转基因植株的DNA。
（2）利用PCR技术检测目的基因是否整合到水稻基因组中。
五、实验结果1. 成功构建了含有抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的重组质粒。
2. 转化后的农杆菌能够将目的基因导入水稻中。
3. 通过抗性鉴定，筛选出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻。
4. 分子鉴定结果显示，目的基因已整合到水稻基因组中。
六、实验结论本实验成功培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供了新的途径。
水稻的遗传转化
水稻的遗传转化1）种子消毒：用75%乙醇浸泡去皮的水稻种子1min（剧烈摇动），再用2.5%的次氯酸钠分别处理两次，每次15min，然后用无菌水冲洗3-5次后均匀铺于诱导培养基上，不宜过多，一个培养皿大概14-20粒。
2）水稻愈伤组织的诱导和继代培养：消毒好的成熟种子在诱导培养基上28℃暗培养25-28天。
待愈伤组织长至合适大小，在培养基中来回剧烈摇动几次，使一些小块愈伤从大的组织块上脱离，从中挑选光滑、淡黄色、较硬、大小在2-3mm的胚性愈伤，均匀铺放在继代愈伤培养基上，28℃避光培养7-8天，即可用于农杆菌转化。
3）农杆菌介导的水稻愈伤组织转化及共培养：刮取已活化3天的农杆菌，放入液体共培养培养基中，用力打散，置摇床摇培0.5-2h，使得菌液的OD600在0.1-0.15（0.125最宜）之间。
将挑选的愈伤组织小粒放入已加农杆菌的液体培养基中，轻轻摇动几次，放置15-20min。
倒去菌液，用无菌滤纸吸干均匀的铺在已加滤纸的共培养基中。
愈伤在共培养培养基中22℃条件下暗培养3天。
4）转化愈伤组织的选择培养：共培养后的愈伤先用灭菌水洗涤三次，后用含头孢500mg/L的灭菌水浸泡30min，期间轻轻摇动，之后用滤纸吸干，均匀铺放在选择培养基上，28℃暗培养10天，之后进行第二次筛选，挑选淡黄色、生长状态良好的愈伤，均匀铺放在含潮霉素和头孢的选择培养基中，28℃暗培养15天。
5）愈伤组织的分化培养：挑选黄色、圆形的愈伤组织，均匀铺放在预分化培养基上，28℃暗培养7天。
之后挑选生长状态良好、淡黄色的胚性愈伤，放入分化培养基上，28℃光照培养30-60天左右，直至转基因小苗长出。
中间每隔25天左右将愈伤转移到新鲜的分化培养基上。
6）水稻的壮苗培养与移栽：将长出的小苗去掉周围的愈伤，在无菌条件下转移到1/2MS的壮苗培养基中，使根部浅插入培养基中，28℃光照培养（14h光/10h暗）。
当苗长至瓶口、约10cm以上时，打开瓶口所覆塑料膜，瓶内加入约1/3 的水，使苗暴露于空中炼化培养。
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理是通过将具有特定基因的外源DNA导入到水稻细胞中，并使其正常表达，在水稻中产生所需的特定性状。
转基因水稻的原理主要包括以下几个步骤：
1. 基因选择：选择具有所需特性的基因，这些基因可以来自同一物种或其他物种。
例如，选择具有抗虫性、抗草木得、耐盐碱等性状的基因。
2. 基因克隆：将选定的基因从其原始来源中克隆出来，通常使用PCR等分子生物学技术来扩增目标基因序列。
3. 插入载体：将目标基因插入携带基因转移所需的DNA片段的载体中。
常用的载体是冠状病毒、细菌或酵母等。
4. 基因转移：将插入载体的基因导入到水稻细胞中。
目前常用的方法有农杆菌介导转化和基因枪转化等。
转化过程中，目标基因被导入水稻细胞的染色体中。
5. 基因整合和表达：插入的基因在水稻细胞中整合到染色体上，并在细胞的遗传物质DNA中被正常复制和遗传。
转基因水稻的这些细胞和后代可以继续表达改良后的特性。
6. 选育和鉴定：基于获得的转基因水稻植株，进行纯系选育和鉴定，确保其稳
定性和所需特性的遗传传递。
通过这些步骤，转基因水稻可以获得具有所需特性的水稻品种，以提高水稻的抗病虫害、抗逆性、增加产量等特性，进而提高农作物的生产效益。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
水稻遗传转化步骤
实验流程：种子灭菌（ms+, 28天，暗培养，28℃）---愈伤继代（ ms,7天，28℃自然光照）--转化共培养（co,暗培养3天，上面放一层滤纸19℃，很重要！）---第一次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第二次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第三次选择（选抗性愈伤，S250，暗培养7天，28℃）---预分化（m,暗培养8天，28℃）---第一次分化（f,先暗培养2天，28℃，后光照13天）---第二次分化（ f，光照15天）---壮苗（1/2，光照，时间不定）种子灭菌：（1）用75%酒精泡5分钟，倒出酒精，加2.5%次氯酸钠摇10分钟以上（2）倒出次氯酸钠，再加2.5%次氯酸钠15-20分钟，猛烈摇动，在超净台上倒去次氯酸钠，用灭菌水洗10次以上，然后放于滤纸上吸干，接种于ms+培养基。
共培养处理：种子愈伤处理28天左右，挑优质愈伤继代培养一次，挑颗粒用农杆菌浸泡15分钟，共培养三天后，挑无褐色愈伤颗粒，用灭菌水洗三次，放入NBL中，摇床摇2小时（200rpm），滤纸吸干后放入筛选培养基S中。
培养基配制；接种培养基（ms+）MS大量，微量，有机，2，4-D（2mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸2.8g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l接种继代培养基（ms）MS大量，微量，有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Phytagel 3g/l共培养培养基（co，pH5.3）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l），蔗糖30g/l，葡萄糖10g/l，phytagel（3g/l），灭菌后加AS20mg/lNBL：就是co加上头孢500mg/l，不加AS选择培养基S500N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢500mg/l，潮霉素50mg/l抗性愈伤继代培养基（S250）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l成熟培养基（m）N6大量，B5微量，B5有机，NAA1mg/l，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l，ABA3mg/l，BA2mg/l分化培养基（f）N6大量，B5微量，B5有机，NAA0.5mg/l, Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l,水解酪蛋白0.3g/l, phytagel4.6g/l灭菌后加BA3mg/l壮苗培养基（1/2）MS大量，微量，有机，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Agar5.8g/l 注：2，4-D浓度为2mg/l，溶于0.1NNaOH或酒精硝酸银浓度为0.85mg/ml，避光保存。
水稻转基因方法 自己
转基因步骤：2-3月完成水稻幼胚愈伤组织的培养1.去壳成熟的水稻种子经70%乙醇消毒5min。
2.倒去乙醇，再用2.5%次氯酸钠（每50mL加一滴吐温20）消毒15min，无菌水洗5次，再用2.5%次氯酸钠消毒15min，再用无菌水浸泡30min。
3．倒去次氯酸钠，将种子倒到无菌滤纸上吸干，再将种子放在N6D （0.6% Gelrite）培养基上29.5度光照培养30-60天（白天12h29.5度，晚上12h29.5度）。
注;培养基每2周换一次。
农杆菌的准备1．选择有活力的愈伤组织（相对干的、淡黄色的。
如图1）转到新的N6D培养基上，29.5度光照培养3天。
注: 褐色的愈伤千万不能选，不然会影响转化效率。
2．挑取含有目的基因的农杆菌单菌落或吸取所保存的农杆菌液100ul 于5ML YEP培养液中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+），28度、250rp振荡培养12-36h至OD600饱和。
3.从上述菌液中吸取500ul于50mlYEP培养液中（50mg/l Kan+，50mg/l（利福平） Str+）. 28度、250rp振荡培养12-36h至OD600=0.6-0.8。
注;农杆菌培养时要避光。
因为农杆菌对光敏感。
农杆菌本身对利福平有抗性，质粒对Kan+ 有抗性，所以能在YEP培养基中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+）生长的菌斑基本上转进去质粒了，只需做下菌落PCR验证下。
农杆菌的侵染1．取15ml培养好的菌液，4度，4000rpm离心10min，去上清。
2. 挑取农杆菌放入30ml AAM感菌液中（10-20mg/l AS），轻轻混匀使OD600=0.05-0.1。
3．将愈伤放入无菌50ml离心管中。
（在准备一个滤膜）4．将步骤2中农杆菌液倒入步骤3中，侵染90s，其中不停要摇晃。
5．弃菌液，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干30-45min。
水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因实验操作方法步骤一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中（种子数量约占1/3体积），用200ml70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿（一般保鲜膜），在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。
用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；3）倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（MicroporeTMSurgicalTape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周（2周愈伤组织更为松散）。
（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）二、农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100国于4mlYEP（含50mg/lKan和50mg/lStr）培养液中，28℃,250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0（颜色接近橙黄色）。
水稻转基因步骤
在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。
这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。
目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。
共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。
转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。
共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。
Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。
目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。
花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。
本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。
在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。
水稻转基因技术的研究与应用
水稻转基因技术的研究与应用水稻是我国的主要粮食作物之一，也是全球最重要的粮食作物之一。
随着社会和经济的不断发展，人们对水稻品质和产量的要求也不断提高。
而转基因技术作为一种创新性技术，为水稻的改良提供了新的途径。
本篇文章将探讨水稻转基因技术的研究与应用。
一、水稻转基因技术的研究1.背景水稻转基因技术是将外源基因导入水稻细胞中，使水稻获得某些特定基因的性状。
这样可以通过调整水稻的生长和发育，使其在抗病、耐旱、提高产量等方面得到改善。
2.研究方法水稻转基因技术主要包括以下三种方法：(1) 农杆菌介导转化：将所需基因导入农杆菌载体，经过处理后将其导入水稻细胞中，使细胞产生抗病、提高产量等性状。
(2) 基因枪法转化：将所需基因载入金属小粒子上，压缩空气将粒子“射”入水稻细胞中。
(3) 电穿孔法转化：利用电场作用使水稻细胞短暂性开放，使基因能够有效导入细胞中。
3.研究进展目前，水稻转基因技术已取得了一些重要的进展，主要体现在以下几个方面：(1) 抗虫基因的成功导入：2007年，我国科学家成功将抗虫基因导入水稻，并以此培育了多个抗虫水稻品种。
(2) 抗病基因的成功导入：我国科学家通过细胞融合技术，将米瘟抗病基因导入一种水稻品种中，并获得了抵御米瘟病的水稻品种。
(3) 抗旱基因的成功导入：我国科学家成功将抗旱基因导入水稻，良种生长在干旱条件下的产量大大提高。
二、水稻转基因技术的应用1. 抗虫作物的生产目前，我国已经培育了多个抗虫作物品种。
这些品种通过导入相关基因并与优良品种杂交，产生出的基因工程作物比传统种植方法的作物更加耐虫。
2. 抗病作物的生产目前，我国已经获得了多个抗病作物品种。
这些品种通过导入相关基因并与优良品种杂交，产生出的基因工程作物比传统种植方法的作物更加耐病。
3. 提高产量基因工程水稻的生产方式与传统水稻生产方式相比，具有很大的优势。
通过导入相关基因，可以提高水稻的产量，并缩短生长周期。
4. 改善品质基因工程水稻的应用还可以改善水稻品质，如改良失酬水稻的品质和味道等。
水稻转基因技术
1.报告基因的酶法检测,常用的报告基因有:gus、nos、ocs等。
当然最后转基因植株必须移栽于大田,进行田间鉴定,不仅对改 良性状还要对其它农艺性状进行评价,选育综合性状优良的株系。
11
三、存在的问题
外源基因的稳定遗传、高效表达及目的基因的沉默。 转基因水稻的安全性问题。 水稻育种转入的基因多数为抗病虫基因，这类基因 产生的毒蛋白等物质，随着人们长期食用，是否会有 累积效应？
水稻转基因技术
第二组
1
目录
1 2
水稻装基因技术
外源基因鉴定
存在的问题与展望
3
7
黄金大米:
又名“金色大米”，是一 种 转基因大米，由美国先正达 公司研发。其不同于正常大米 的主要功能为帮助人体增加维 生素A吸收。因为色泽发黄， 该大米品种被称为“黄金大 米”。
左为普通大米，右为黄金大米
3
水 稻 转 基 因 技 术
12
基因枪法
农杆菌介导发
PEC介导转化法
其他方法
花粉管通道发 电击法
4
一、水稻转基因技术
基因枪法：
定义：又称微弹轰击法，是利用基因枪，将载有目的
基因的金属颗粒加速，高速射入受体作物细胞，并随机 整合到受体细胞的基因组上，然后通过细胞和组织培养 技术，再生出新的植株。
原理：是将外源DNA包在微小的金粒或钨粒表面,再 通过高压将微粒高速地射入受体细胞或组织。
7
PEC介导转化法：
原理：是利用化合物聚乙二醇(PEG)及高pH条件诱 导原生质体体外摄取外源DNA。 特点：原生质体作为受体具有群体数大,便于操作,DNA 分子易于进入,获得纯合性的转化子等优点,但原生质体培 养难度大、再生频率低、周期长、不适合水稻转化研究。
水稻转基因实验操作[2]
![水稻转基因实验操作[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/ee8ee83143323968011c927c.png)
水稻转基因实验操作（谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理）（2006.7）一、水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30℃光照培养箱，培养4周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30℃光照培养箱，继代培养1-2周。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、农杆菌（工程菌）培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100µl于4ml YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。
三、感菌与共培养1）取培养好的工程菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清。
用含200µmol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。
2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可）。
3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；4）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
28℃（组培室）暗培养2.5天。
四、愈伤组织的抗生素筛选将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡（组培室震荡机最大速率）。
水稻转化方法
水稻转化方法配置1升诱导培养基：1.水解酪蛋白300 mg/L2.谷氨酰胺500 mg/L3.脯氨酸500 mg/L4.肌醇100 mg/L5.蔗糖30g/L6.PHytagel 2.6 mg/LN6大量50毫升，B5微量5毫升，B5维生素5毫升，铁盐毫升，2,4-D母液2毫升，pH 5.85.1水稻转化受体的准备5.1.1水稻幼胚愈伤组织的诱导培养取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟，进行表面灭菌。
(灭菌时要经常搅拌)用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。
在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。
约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
5.1.2水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。
约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。
以后每两周继代培养一次。
挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织共培养。
成熟季节的天气；颖壳和种皮表面没有麻点（病斑）；按成熟度分开（青米优于完熟米）注意：粳稻不适宜用NaClO灭菌。
5.2农杆菌的培养将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线，28℃黑暗培养2-3天，用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养为0.3-0.5，加入AS，使AS终浓度为CM液体培养基中，调整菌体浓度至OD600100mΜ，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
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根癌农杆菌介导的转化方法
将水稻成熟种子去壳。
仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；
将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；
农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。
挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。
离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。
将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。
转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。
新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。
将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。
农杆菌介导转化水稻所用培养基
-1-1 626
蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8
N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素
2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖，
pH7.0
AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖，
100-400µmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2
N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2
预分化与分化再生
MSPR MS（Murashige和Shog，1962）盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，50g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA, 5mg·L-1ABA ，3.0g·L-1
Phytagel, pH 5.8，50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素。
MSR MS( Murashige和Shog，1962) 盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，30g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，0.5mg·L-1NAA, 0.5mg·L-1KT,
3.0g·L-1Phytagel, pH5.8 , 50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素
1mg·L-1多效唑（可不加），0.5mg·L-1NAA, 50mg·L-1潮霉素，
2.5g·L-1Phytagel, pH5.8。