水稻转基因组织培养步骤的具体事宜

农杆菌介导的转化

一．试剂

1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-5898

2 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-0753

3 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-0640

4 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-5148

5 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-8407

6 Kanamycin USB Cat No. 17924

7 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-7290

8 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-010

9 Cn (Carbenicillin) 国产分装

10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-0765

11 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-8666

12 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-3902

13 Inositol Sigma Cat No. I-3011

14 Phytagel Sigma Cat No. P-8169

15 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-5879

16 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-3783

17 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG

二．溶液

1.MS max

NH4NO316.5g

KNO319.0g

KH2PO4 1.7g

MgSO4∙7H2O 3.7g

CaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g

逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。

2.MS min母液(100×)

KI 0.083g

H3BO30.62g

MnSO4∙4H2O 2.23g 或MnSO4∙ H2O 1.69g

ZnSO4∙7H2O 0.86g

Na2MoO4∙ 2H2O 0.025g

CuSO4∙ 5H2O 0.0025g

CoCl2∙ 6H2O 0.0025g

注意：Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。

加dH2O定容到1000ml室温保存。

3.N6max母液(10×)

KNO328.3g

KH2PO4 4.0g

(NH4)2SO4 4.63g

MgSO4∙ 7H2O 1.85g

CaCl2∙ 2H2O 1.66g 或CaCl2 1.25g

逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。

4.N6 min母液(100×)

KI 0.08g

H3BO30.16g

MnSO4∙ 4H2O 0.44g 或MnSO4 ∙ H2O 0.3335g

ZnSO4∙ 7H2O 0.15g

加dH2O定容到1000ml室温保存。

5.Fe2+-EDTA(100×)

取一个烧杯加300ml dH2O以及FeSO4∙ 7H2O 2.78g；

在另一个烧杯中也加300ml dH2O加热到70℃后加入Na2 EDTA ∙ 2H2O 3.73g；

待到两种药品都溶解了，混合，70℃保温2hr，然后加dH2O定容到1L，4℃保存。

6.维生素(100×)

Nicotinic acid 0.1g

Pyridoxine HCl (VB6) 0.1g

Thiamine HCl (VB1) 0.1g

Glycine 0.2g

Inositol 10g

加dH2O定容到1000ml 4℃保存。

7.AA max母液(10×)

KCl 29.50g

NaH2PO4 1.50g 或NaH2PO4 ∙ 2H2O 1.95g

MgSO4· 7H2O 2.50g

CaCl2∙ 2H2O 1.50g 或CaCl2 1.13g

加dH2O定容到1000ml室温保存。

8.AA min母液(1000×)

MnSO4∙ H2O 1.0g

H3BO30.3g

ZnSO4∙ 7H2O 0.2g

KI 0.075g

NaMoO4∙ 2H2O 0.025g

CuSO4∙ 5H2O 0.0025g

CoCl2∙ 6H2O 0.0025g

Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合，加dH2O定容到1000ml室温保存。

9.2,4-D母液(1mg/ml)

2,4-D 100 mg

先加1.0 ml 1N KOH 摇5min，然后加10ml H2O 继续摇直到2,4-D溶解，加水定容到100 ml室温保存。

10.6-BA母液(1mg/ml)

6-BA 100mg

加1.0 ml 1N KOH摇直到6-BA溶解，加水定容到100 ml室温保存。

11.N AA母液(1mg/ml)

NAA 100mg

加1.0ml 1N KOH 并搅动直到NAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。

12.I AA母液(1mg/ml)

IAA 100mg

加1.0 ml 1N KOH摇直到IAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。

13.100mM AS母液(1mg/ml)

AS 0.196g

DMSO 10ml

分装到1.5 ml离心管4℃保存。

14.1N KOH母液(1mg/ml)

KOH 5.6g

用100ml H2O溶解后室温保存。

15.羧苄青霉素2钠(CN) （200mg/ml）

CN干粉1g

用5ml灭菌dH2O溶解后，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。

或者用5ml 75％酒精溶解，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。

16.A stock solution （继代A）:

硝酸铵16.5g

硝酸钾19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

七水硫酸镁 3.5g

二水氯化钙4g/无水氯化钙3g

加水依次溶解，定容1000ml，室温保存

17.B stock solution （继代B）:

四水硫酸锰 5.0g

硼酸 1.5g

七水硫酸锌 2.0g

碘化钾0.75g （未完）