酵母发酵法制备超氧化物歧化酶

邻苯三酚自氧化法原理
桔酚
邻苯三酚─────── O2
pH=8.2
-
+红
（自氧化：有色物质积累，吸光值增加）
SOD
+ O2 +2H+────H202+O2
-
O2
（SOD催化：阻止中间产物积累，吸光值降低）
实验步骤
1．测定邻苯三酚溶液自氧化速 率： 取两支试管按右表加入25℃预 热过的缓冲液,然后加入预热过 的 邻 苯 三 酚 （ 空 白 管 用 10mmol/L HCl 代 替 邻 苯 三 酚 ），迅速摇匀，立即倾入 1cm比色杯中，在325nm波长 处测定光吸收值，每隔30s读数 一次，测定4min内每分钟光吸 收值的变化。要求自氧化速率 控制在每分钟的光吸收值为 0.070（可增减邻苯三酚的加 入量，以控制光吸收值）。
SOD酶活力测定
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2 - （超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物 （红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分 钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的 中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚 自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～ 45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在 4min的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光 吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结 合生成O2和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累， 导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得 光吸收变化速率计算出SOD的酶活性 。
试剂
空白 自氧化 管 管 （mL） （mL）
pH8.2、 50mmol/ L Tris-HCl 10mmol/ L HCl 50 mmol/L 邻苯三 酚
2.98 2.98
0.01 ——
—— 0.01
2.SOD样液活力测定： 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入 预 热 的 待 测 酶 液 ， 在 25℃ 水 浴 锅 中 保 温 10min，再加入预热的邻苯三酚。其余步骤 同邻苯三酚自氧化速率的测定 。
SOD与其他抗氧化剂的区别
工艺简要介绍
•
0.3M海藻糖：本来是0.5M的蔗糖的，但经过查找文献，发现不同浓度的海 藻糖对SOD 均有较强的保护作用，其中浓度在0.3mol/L 时效果最佳，而蔗 糖对SOD既无激活作用也没抑制作用，所以改成了海藻糖。
•
DNase I：即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可 以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的
• 酵母菌中SOD 的提取及纯化：将离心分离得到的酵母菌体， 悬浮于缓冲液（50mM 磷酸钾缓冲液，0.3M海藻糖，10M 氯 化镁，pH7.0~7.5）中，用蜗牛酶酶解后，超声波破碎细胞壁， 菌体碎片再用DNaseⅠ酶酶解，离心除去残渣，得粗酶提取液； 在搅拌下加入乙醇-氯仿（5∶3）溶液，离心除去杂蛋白；再 加入磷酸氢二钾盐析； 上清液加入0.75 倍冷丙酮，冷冻离心 得粗酶沉淀； 将沉淀溶于pH7.8磷酸钾（2.5mM）缓冲液中透 析1~2d，即得Cu，Zn-SOD 酶液。
SOD性质
工艺流程
• 发酸罐中发酵培养： 平皿上挑取取H2O2 性能好的单个菌落， 经斜面培养、液体培养（一级）、扩大培养（二级）后，按 10%的量接入发酵罐（2L）中通气培养。每隔2h 取样一次， 于650mm 处测定发酵液的OD 值，当OD 值恒定而有下降趋 势时，放出发酵液，离心收集菌体供提取SOD。
• 研究证实，SOD 添加于化妆品中可起到四方面的作用： 一是有明显 的防晒效果；二是SOD 作为抗氧化酶能有效防止皮肤衰老、祛斑、 抗皱；三是有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果；四是 SOD 具有一定的防治瘢痕形成的作用。
SOD的用途
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• 自1969 年McCord 和Fridovich 首次从牛红细胞中分离出 超氧化物歧化酶（SOD）以来，人们相继从牛、猪、羊、 马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织以及植物中分离和纯 化出SOD。
酵母发酵法制备超氧化物歧化酶
• SOD 在食品工业中， 作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂， 该保健品具有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的 效果。目前已有添加SOD 的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白 酒、果汁饮料、矿泉水、奶糖、酸牛乳、冷饮类等类型的保健食品 面市。制成多种剂型的SOD 或复合型食品。已有SOD胶囊剂、片剂、 口服液、脂质体、颗粒剂等形式的SOD 保健食品。 • SOD 可作为罐头食品，果汁、啤酒等的抗氧剂， 防止过氧化物酶引 起的食品变质及腐败现象。此外，还可作为水果、蔬菜的保鲜剂。
个别试剂用途解释
在一般情况下，SOD活性测定只能应用间接活性 测定法。其测定方法很多，常见的有化学法、免疫法 和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的 原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有 色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。 在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻 苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法， 光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚 自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自 氧化方法。
• •
•
• SOD属于人体内自身就含有的一种抗氧化 酶，（如蛋白酶、唾液淀粉酶等都属于酶 类），而抗氧化剂是一种单线补充。酶参 与人体化学反应，所有的新陈代谢都还有 酶类，所以他的起效和吸收式建立在人体 化学反应上的，而抗氧化剂真正生物利用 率低，需要在体内进行转化后才能被人体 吸收利用，所以相同剂量的酶和剂，酶的 效果高于剂的1000倍以上。
SOD的使用现状
• 超氧化物歧化酶是广泛存在于动物、植物 及微生物细胞内的金属酶，至少可分为三 种类型：Cu，Zn-SOD、Fe-SOD、MnSOD。 • 该酶系一种酸性蛋白质，较稳定， 能耐热。 pH7.6~9 时稳定，pH6 以下和12 以上不稳 定，pH2 以下极度不稳定。具有较强的抗 胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。
SOD酶活力计算：
SOD应用领域
• 1.药物类 主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢 性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放 射性治疗炎症病患者； 2.生化制药 作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，可 抗衰老，抗肿瘤、调节人体内分泌系统； 3.化妆品 可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。 以SOD为主要成份的化妆品风靡世界，引发了化妆品历史 上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真； 4.保健食品、饮料 SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销。在 饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性 延长保质期，又可调节人体内分泌系统。
• 国外已有多种药用SOD 应用于临床，主要集中在抗炎、 抗辐射、抗肿瘤、抗衰老老及由超氧阴离子自由基引发 疾病自身免疫性疾病等。目前，国内SOD 的应用主要集 中在食品和化妆品等方面，在吸收机制质量稳定性、有 效性等方面的基础研究取得一些新进展。国内现有SOD 产品主要是从牧畜血液中提取， 发酵法生产还未产业化。
核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3' 端为羟基。
• 10M氯化镁溶液：是DNase I激活剂。 DNase I活性依赖于钙离子，并能被 镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链
DNA的任意位点。
• 蜗牛酶：是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶 酶，淀粉 酶，蛋白酶等20多种酶。 蜗牛酶是很有价值的一种酶。它可以用 于酵母细胞壁的破碎
试剂 pH8.2 50mmol/LTris-HCl 10mmol/L HCl SOD样酶 50 mmol/L邻苯三酚 空白管（mL） 样品管（mL）
2.98 0.02 ——
2.98 —— 0.01
——
0.01
3.2
(酶活力单位定义:在一定条件下,每1mL反应 液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50 %时的 酶量定义为一个活力单位。)