血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验

一．实验原理

1、电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。

2、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。

3、影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。

4、采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。

5、醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。

6、本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。

二．实验仪器和试剂

✧器材

醋酸纤维素薄膜（3×8cm），培养皿，载玻片，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子

✧材料

新鲜血清（未溶血）

✧试剂

1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：

巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，备用。（已配置）

2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏

水40ml，混匀。

3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。

4、NaOH溶液：称取NaOH 16g，定容至1000ml。

三．实验过程

一.准备与点样

1.将薄膜剪成3×8cm的小条，在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位置。

2.将薄膜无光泽面向下，浸泡于PH8.6的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之完全浸泡透。

3.将浸泡的薄膜取出，用滤纸吸去多余水分。用毛细管吸取新鲜血清约5ul，涂于厚0.5厘米的载玻片末端，然后轻轻压在划痕处，待血清完全浸入膜内以后移开载玻片。

二、电泳

将点样后的薄膜置于电泳槽支架上，无光泽面朝下，点样末端置于负极。槽架上用四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5分钟后通电，电压110伏，电泳1小时左右关电源。

三、染色和漂洗

通电完毕后，用镊子将膜取出，直接浸于染色液中2分钟后取出，立即浸泡于漂洗液中，反复漂洗，直至背景漂洗净为止。用滤纸吸干薄膜。

四、定量（洗脱法）

⒈取6支试管，编号，每管加入0.4mol/LNaOH4毫升，剪下薄膜上各条蛋白色带。另于无色部分剪一大小与色带相仿的薄膜作空白对照。

⒉将各条区带分别放入试管内，不时摇动，待蓝色完全脱下后。在波长650nm处比色。以空白调零，分别读出各蛋白组分的光密度，然后计算出总光密度：

光密度总和T=清蛋清（A)+A1+A2+B+ r各管的0.D。各部分蛋白质的百分数为：

清蛋白A=A/T

α1球蛋白= α1/T

α2球蛋白= α2/T

β球蛋白= β/T

γ球蛋白= γ/T

四．注意事项

保持薄膜清洁，务必戴上塑料手套，勿用手指接触薄膜表面，以免油污或污物沾上，影响电泳结果。

✧注意醋酸纤维膜的质量，至少浸泡10分钟，浸泡很久仍有大块白色硬点者须弃之不

用。

✧加样时一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。以免影响蛋

白质区带图谱的完美。

✧电泳槽两边的缓冲液应保持液面在同一水平面上，槽里的缓冲液要保持清洁。

✧电泳电压大小，时间长短与缓冲液的离子强度都有一定的关系。一般电流约

0.4—0.6mA/cm,电压110—160V，通电时间40—60min。电压高，电流大，电泳速度

加快，时间可缩短，但薄膜上蒸发严重，因此不能无限增大电流。

✧使用比色皿时要润洗。

✧染色的同时也是蛋白质的固定，所以，不要将很多蛋白条重叠在一起。

✧注意薄膜正负极不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的时候注意血样不要与滤

纸接触了。

✧通电完毕时，必须切断电源，以防触电事故。

五、失败图谱的分析

✧拖尾状点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成5条区带或产生拖

尾。

✧有斑点点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出现斑点。

✧边流现象点样板蘸取血清一边多一边少，导致区带分离不清，出现边流现

象。

✧区带模糊薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。

✧锯齿状薄膜用滤纸吸水过度（薄膜上出现白斑）或点样过慢，又未及

时大桥，导致薄膜过于干燥，使区带成锯齿状。

✧区带倾斜薄膜搭载滤纸上的位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行，或点样

一边多一边少，区带容易泳斜。

✧显色过浅点样太少，区带显色不明显。

✧区带重叠染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固

定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。

✧区带过密电泳时电压，电流或电泳过小或时间不够，造成区带未分离。

六、思考题

请你回忆一下你的实验过程，并圆满解释你的结果！

本次实验对细节的要求较高，请大家务必耐心仔细，

预祝大家实验成功！·^_^