蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程
胶内酶解
1.2.2 蛋白质谱鉴定（1）胶内酶解斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。
操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。
脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。
加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。
酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。
加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。
加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。
将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。
用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。
保存？？？（2）质谱鉴定①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。
取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。
②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。
肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。
谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。
imc空间蛋白质组流程
IMC空间蛋白质组流程是一种基于质谱的蛋白质组学技术，它利用离子迁移谱（IMS）和质谱（MS）的结合，对蛋白质混合物进行高分辨率和高灵敏度的分析。
以下是该流程的简要介绍：
蛋白质提取和分离：首先，从样本中提取蛋白质，然后使用凝胶电泳或色谱等方法将蛋白质进行分离，以获得不同蛋白质的混合物。
酶解：将蛋白质混合物酶解成肽片段，以便后续的质谱分析。
常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
肽段标记：使用稳定同位素标记技术对肽段进行标记，以便在质谱分析中进行相对定量。
常用的标记试剂包括TMT、iTRAQ等。
IMS分离：将标记后的肽段通过IMS进行分离，得到不同肽段的迁移时间和谱图。
IMS能够根据肽段的电荷状态和大小进行分离。
MS分析：将IMS分离后的肽段通过质谱进行分析，获得肽段的序列信息和相对丰度。
常用的质谱技术包括MALDI-TOF、ESI-Q-TOF等。
数据解析：将质谱数据解析成肽序列和相对丰度，然后进行蛋白质的鉴定和相对定量。
生物信息学分析：将鉴定的蛋白质进行功能分类、相互作用网络构建等生物信息学分析，以获得蛋白质组的全面信息。
通过以上流程，IMC空间蛋白质组流程可以对蛋白质混合物进行高分辨率和高灵敏度的分析，为研究蛋白质表达和功能提供有力手段。
蛋白质质谱 - 丁香园—医学药学生命科学专业网站
缺点：
•可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。 • 肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。肽段分子质量在 2000以上时，在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降 。 •无法进行混合蛋白质鉴定 •翻译后修饰鉴定能力稍低
LTQ（ESI-MS/MS）
由于该质谱具有高效液相分离与MS/MS结构分析功能，可以获得检测到 的每一肽段的序列。根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱 (MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。 优点：
总离子可信度
肽段序列
实际分子量 理论分子量
起始氨基酸位置 结束氨基酸位置
肽段离子得分
肽段固定修饰
分子量误差
肽段可信度
MS-MS (SeQuest)
BuildSummary
LTQ质谱（BuildSummary软件）结果说明
唯一肽段数 鉴定的肽段数 搜索到的蛋白 蛋白鉴定覆盖率 蛋白理论分子量 蛋白理论等电点 搜索到的蛋白可能有多个gi号，取最典型的gi号，选取次序为：sp > ref > first gi_number
• MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激 光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子 或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软 电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。
• TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器 的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行 时间成正比 ，检测离子。
压力差推动质子化样品进入质 量分析器进行检测 。
实验原理
适用样品
• 一般建议样品为溶液或考染胶。若为银染胶，需要采取快 速银染（即同质谱鉴定兼容）的方法染色。 • 溶液中一般不要有SDS、CHAPS、Triton X-100、NP40及 吐温 20、40等系列的去污剂。盐浓度小于50mM • 溶液样品蛋白浓度一般不小于1mg/ml，蛋白总量不小于 10ug。
质谱法全序列检测方法
质谱法全序列检测方法质谱法是一种常用于生物样品分析的技术，可以快速、准确地测定样品的氨基酸序列和蛋白质表达水平。
下面是质谱法全序列检测方法的步骤：1.样品准备在进行质谱分析前，需要将生物样品进行处理和准备。
通常需要将样品进行蛋白酶解，将蛋白质分解为氨基酸序列，以便于后续的分析。
此外，还需要对样品进行清洗、纯化等步骤，以去除杂质和干扰物质。
2.离子化离子化是质谱分析的关键步骤之一，即将样品中的化合物转化为带电离子。
常用的离子化方法有电喷雾离子化（ESI）和基质辅助激光解吸离子化（MALDI）。
在离子化过程中，样品中的化合物会吸收能量并转化为带电离子。
3.质量分析在离子化后，需要对样品中的离子进行质量分析。
常用的质量分析器有飞行时间质量分析器和四极杆质量分析器等。
通过质量分析器，可以测定离子的质荷比（m/z），即离子的质量和电荷之比。
根据离子的质荷比，可以初步推断离子的类型和分子量。
4.谱图解析通过对离子的质荷比和相对丰度的测定，可以生成质谱图。
质谱图是一种包含大量信息的图像，可以通过谱图解析来识别和解析离子的类型和分子量。
常用的谱图解析方法有指纹图谱法和数据库比对法等。
指纹图谱法是根据样品的质谱图与已知指纹图谱进行比较，确定样品中的化合物类型；数据库比对法则是将样品的质谱数据与已知数据库中的数据进行比对，从而识别出样品中的化合物类型。
5.数据库比对在进行谱图解析时，通常需要将样品的质谱数据与已知数据库中的数据进行比对。
常用的数据库包括Uniprot、NCBI等。
通过比对，可以确定样品中存在的氨基酸序列和蛋白质表达水平等信息。
同时，还可以利用数据库中的注释信息和其他相关数据，对样品的生物学功能进行深入分析。
总之，质谱法全序列检测方法是一种高效、准确的蛋白质分析技术，可以广泛应用于生物医学领域的研究。
通过对样品进行深入的质量分析和数据库比对，可以获得样品的氨基酸序列和蛋白质表达水平等信息，为进一步研究提供重要的参考依据。
蛋白质酶解操作规程
有还原烷基化蛋白质消化操作流程1.将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板中,并记录点号及相应的位置；2.加50μL DD.H2O 洗两次，10min/次；3.加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液(考染脱色液)50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；(若为银染, 一般不需要脱色; 若必须脱色,使用15mM K3Fe(CN)6/50mM Na2S2O3 , 轻摇直到变为淡黄色透明,再用水反复洗至无色)4.重复步骤3，直至蓝色褪去；5.加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干10min；6.加10 mM DTT（10μL 1M DTT，990μL 25mM NH4HCO3配制）20μL，56℃水浴1hr；7.冷却到室温后，吸干，快速加55 mM IAM （55μL 1M IAM，945μL 25mMNH4HCO3配制）20μL，置于暗室45min；8.依次用25 mM NH4HCO3 ( 2X10分钟)、25 mM NH4HCO3 +50％乙腈溶液( 2X10分钟)和乙腈洗(10分钟)，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干10min；9.将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10~20倍，每EP管加2~3μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3 至总体积10-15μL置37℃，消化过夜；10.加入1%TFA终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。
说明:1.每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。
2．如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色，使用的各种溶液的量也相应增加。
3．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子。
4．银染蛋白质点胶内消化不要脱色，步骤3、4省略。
蛋白质酶解步骤
蛋白质酶解步骤
一、蛋白质酶解
蛋白酶解是一种常用的生物学技术，用于分离、纯化和分析蛋白质复合物。
蛋白质酶解的主要步骤主要包括：
1. 蛋白酶解液的准备：将适宜的蛋白酶（如无菌胰蛋白酶等）与抑制剂（如EDTA等）混合，将蛋白质溶液加至混合物中，使溶液缓冲至适宜的pH值，然后加入一定量的 NaCl 和蛋白酶抑制剂，如硼砂或酒石酸钙。
2. 加入酶：将适宜的量的蛋白酶（如胰蛋白酶）加入解液中，并保持恒定的温度，使酶保持活力。
3. 进行反应：解液中的酶会将蛋白质降解成小于50 kDa的低分子量的肽。
4. 时间监测：不同蛋白质所需要的酶解时间是不同的，一般最小的反应时间为1小时，最大的反应时间可达几天，最好根据指标物的酶解速率来调节反应时间，当达到最近的指标物酶解质量时，可以停止反应。
5. 浓缩和离心：进行离心，以把蛋白质复合物从反应液中分离出来，然后将浓缩液冻存，以便后续分析。
6. 过滤：将反应液过滤，以去除剩余的酶，过滤后的溶液可作为蛋白质分析的样本。
二、总结
蛋白质酶解是一种常用的生物学技术，可用于分离、纯化和分析
蛋白质复合物。
蛋白质酶解的主要步骤包括：准备蛋白酶解液，加入酶，进行反应，时间监测，浓缩和离心，过滤。
通过这几个步骤，我们可以从反应液中分离出蛋白质复合物，从而实现蛋白质的分离、纯化和分析。
脱氧胆酸钠(sdc)促进的蛋白质酶解与鉴定
在探讨脱氧胆酸钠（Sodium deoxycholate, SDC）促进的蛋白质酶解与鉴定这一主题时，我们首先需要了解脱氧胆酸钠的作用机制和在蛋白质酶解中的作用。
脱氧胆酸钠是一种表面活性剂，通常用于蛋白质提取和溶解。
其作用包括破坏蛋白质间的非共价键和疏水作用，从而有利于蛋白质的酶解和鉴定。
1. 脱氧胆酸钠的作用机制脱氧胆酸钠在蛋白质酶解中起到了至关重要的作用。
其主要作用包括：（1）破坏蛋白质的结构脱氧胆酸钠能够与蛋白质分子中的疏水和非极性区域相互作用，从而使蛋白质发生构象改变，暴露更多的酶切位点，有利于酶解作用的进行。
（2）改善溶解性脱氧胆酸钠可以改善蛋白质的溶解性，使蛋白质更容易与酶结合，促进酶解的进行。
2. 蛋白质酶解与鉴定蛋白质酶解是指通过蛋白酶对蛋白质进行酶解作用，将复杂的蛋白质分解为易于分析和鉴定的片段。
鉴定这些片段可以帮助科研人员了解蛋白质的结构、功能和代谢途径，为进一步的研究提供重要信息。
蛋白质酶解和鉴定通常包括以下步骤：（1）蛋白质提取和定量（2）选择合适的蛋白酶进行酶解（3）酶解条件的优化（4）质谱分析3. 脱氧胆酸钠促进的蛋白质酶解与鉴定通过脱氧胆酸钠的作用，我们可以更好地进行蛋白质酶解与鉴定。
脱氧胆酸钠的应用可以使蛋白质更容易被酶切，从而得到更多的酶解产物。
脱氧胆酸钠也能提高蛋白质的溶解度，有利于进一步的质谱分析。
总结回顾脱氧胆酸钠在蛋白质酶解与鉴定中发挥着重要的作用。
它能够通过改变蛋白质结构和提高溶解度，促进蛋白质酶解的进行，并为质谱分析提供更多的酶解产物。
在蛋白质研究领域中，脱氧胆酸钠的应用具有重要意义。
个人观点和理解我个人认为，在蛋白质酶解与鉴定的过程中，脱氧胆酸钠的作用不可或缺。
其能够提高酶解效率，使我们能够更全面地了解蛋白质的结构和功能。
然而，在应用脱氧胆酸钠时，也需要注意其浓度和作用时间的控制，以免对蛋白质酶解和鉴定产生不良影响。
通过对脱氧胆酸钠促进的蛋白质酶解与鉴定的深入探讨，我们可以更好地理解其在蛋白质研究中的重要作用。
大豆蛋白酶解实验方案
大豆蛋白酶解实验方案
一、实验目的
通过大豆蛋白的酶解实验，探究酶解对大豆蛋白的影响，为了解大豆蛋白的营养成分及其应用提供实验依据。
二、实验材料
1、大豆蛋白粉
2、三倍体蛋白酶
3、磷酸盐缓冲液
4、氯化钠
5、紫外分光光度计
6、酶解仪
三、实验步骤
1、称取一定量的大豆蛋白粉，加入适量的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，调节pH 值至7.0。
2、加入一定量的三倍体蛋白酶，放置于酶解仪中，在恒温下酶解反应。
3、每隔一定时间取少量反应液，加入适量的氯化钠，用紫外分光光度计检测吸光度。
4、反应结束后，用紫外分光光度计检测吸光度，计算大豆蛋白酶解率。
四、数据处理
1、将实验记录表格中的各项数据，制作成折线图，以反映酶解过程中各项指标的变化趋势。
2、计算大豆蛋白酶解率，用酶解前后的蛋白质含量相减，再除以酶解前的蛋白质含量，即可得到酶解率。
3、进行统计学分析，比较不同组的实验结果，确定酶解参数。
五、实验结果
1、折线图反映了各项指标的变化趋势，如酶解时间、酶解温度、酶解剂量等。
2、实验结果表明，随着酶解时间的延长，大豆蛋白的酶解率增加；随着酶解温度的升高，酶解率也随之增加；酶解剂量也对酶解率有影响，但未能达到理想效果。
六、实验结论
1、本实验结果表明，大豆蛋白的酶解是可能的，随着酶解时间、温度和酶解剂量的增加，酶解率增加。
2、大豆蛋白的酶解对其营养成分有一定影响，酶解后可释放部分蛋白质和氨基酸，提高其生物利用度。
3、本实验结果可为大豆蛋白的应用提供参考，也为后续研究提供了实验依据。
蛋白质酶解实验步骤
凝胶蛋白质点的酶解一.蛋白质点酶解准备工作：1．检查冻干机，调好水浴锅（37℃，56℃）2．检查各种试剂的量是否足够（DTT IAA NH4HCO3）3．检查酶解房卫生状况每一步注意事项：1．每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和管壁上的液滴甩下来3. 每次打开EP管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。
开盖子动作尽量轻巧，以免胶块弹出。
4．在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。
酶解前配制1）、100 mmol/L的NH4HCO3参考配制10mL 称79.06mg NH4HCO3溶于10mL水中以后每一步25 mmol/L的NH4HCO3可用100 mmol/L的NH4HCO3稀释。
2）、1mol/L的DTT参考配制10ML 称1.55gDTT溶于10mL水中，1mL分装，避光贮存（锡箔包），-20度永久保存考染酶解步骤: 调水浴锅到37℃以便做脱色用，此外，调水浴锅到57℃，以便做还原用。
1.冲洗胶块：用水洗衣胶块2次，2. 脱色：用含有25mmol/L的NH4HCO3的50%的乙腈37℃保温30min。
如第一次脱色不完全可再脱一次色2.干燥：吸出液体后，先加50%的乙腈，再加100%的乙腈调水浴锅到57℃，以便做还原用。
4．还原：加入还原剂，封口，57℃水浴一小时，还原蛋白质。
还原剂：25mmol/L的NH4HCO3（含10mmol/L DTT）参考配制方法（4mL）：6.2mgDTT溶于4mL 25mmol/L的NH4HCO3中注意事项：1. 注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的协调和发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。
2．水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此处造成不必要的失误。
5．烷基化将样品从水浴锅中取出后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同样体积的烷基化试剂室温暗处放置45min，使之碘乙酰胺化。
液相色谱-质谱分析纯化的蛋白
百泰派克生物科技
液相色谱-质谱分析纯化的蛋白
纯化的蛋白在进入质谱分析前，通常需要将纯化的蛋白样品经过蛋白酶的酶切消化为肽段混合物，再经过高效液相色谱对多肽片段进行初步分离，以进一步提升质谱检测的准确度。
液相色谱不受蛋白样品挥发性、热稳定性及相对分子质量的限制，仅要求将蛋白样品制成溶液即可，在质谱分析前加了液相色谱分离这一步骤，可使得纯化的蛋白分析精度更高。
液相色谱-质谱分析纯化的蛋白，即纯化的蛋白加入胰蛋白酶酶解后注入液相色谱串联高分辨率质谱中分析，之后再经过一级、二级两个层级的质谱分析对蛋白质进行逐级分析。
经过液相色谱分离纯化的蛋白，随着质谱检测层级的加深，对肽段序列测定几乎可以的达到100%的准确度，蛋白鉴定的准确度也得到了提升。
百泰派克生物科技采用Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，能够对各种样品中的蛋白质进行高效精准的蛋白质组学相关服务。
您只需告知我们您的实验目的并寄出样品，我们将负责项目后续所有事宜，包括样品前处理、质谱分析、质谱原始数据分析和组学分析。
蛋白组学测序流程解析：从样品准备到数据分析的全方位指南
蛋白组学测序流程解析：从样品准备到数据分析的全方位指南蛋白组学测序是研究蛋白质组的关键技术，通过全面分析蛋白质的组成、结构和功能，为我们深入理解生物系统的机制和疾病的发生发展提供重要的信息。
本文将详细介绍蛋白组学测序的流程，从样品准备到数据分析，帮助读者全面了解蛋白组学测序的全过程。
1.样品准备。
样品准备是蛋白组学测序的关键步骤之一。
首先，需要从生物样品中提取蛋白质，常用的方法包括细胞裂解、组织切片和血清蛋白分离等。
其次，对提取的蛋白质样品进行蛋白质浓度测定和样品纯化，以去除干扰物和增加蛋白质检测的灵敏度。
最后，根据实验的目的，可以对样品进行进一步的预处理，如蛋白质降解、还原-巯基修饰和糖基化修饰等。
2.蛋白质分离与富集。
蛋白质分离与富集是蛋白组学测序中的重要步骤，旨在降低样品的复杂性并增加蛋白质检测的灵敏度。
常用的方法包括凝胶电泳、液相色谱和亲和层析等。
凝胶电泳主要用于分离蛋白质样品中的不同分子量的蛋白质，液相色谱可以根据蛋白质的化学性质和亲和性进行分离，而亲和层析则利用特定的亲和剂对目标蛋白质进行富集。
3.蛋白质鉴定。
蛋白质鉴定是蛋白组学测序的核心步骤，常用的方法是质谱技术。
首先，将蛋白质样品进行酶解，产生肽段。
然后，通过质谱仪将肽段进行分离和检测，得到质谱图谱。
最后，通过比对实验数据与已知蛋白质数据库进行匹配，确定样品中存在的蛋白质。
4.蛋白质定量。
蛋白质定量是测定样品中不同蛋白质的相对或绝对丰度的过程。
常用的方法包括定量质谱法和代谢标记法。
定量质谱法通过比较不同样品中特定肽段的信号强度来推断蛋白质的相对丰度。
代谢标记法则通过将同位素标记剂引入样品中，根据同位素标记的比例来推断蛋白质的相对或绝对丰度。
5.数据分析。
数据分析是蛋白组学测序流程的最后一步，旨在解读和解析蛋白质组学数据。
通过生物信息学工具和统计分析方法，对蛋白质鉴定和定量结果进行数据挖掘和功能注释。
数据分析可以包括蛋白质互作网络分析、差异表达分析和功能富集分析等，以获得更全面的生物学信息和洞察。
质谱操作步骤-中文
质谱操作步骤-中⽂micrOTOF-Q II液质联⽤⾼分辨质谱仪使⽤流程1. 使⽤质谱须知在使⽤质谱仪前请确认并检查以下条件：●仪器已经正确安装并且经过⼚商⼯程师的检测；●质谱仪属于精密贵重仪器，未经专门培训⼈员不得擅⾃开启使⽤，更不得随意“调校”氮⽓和氦⽓压⼒或更改仪器参数等；●检查液氮罐和氦⽓钢瓶是否有⼀定压⼒，以便为测试样品提供符合流速和压⼒要求的氮⽓（喷雾⽓体和⼲燥⽓体）和氦⽓（碰撞⽓体）；●常规ESI源已安装完毕●样品溶液必须澄清透明，不含有固体微粒，不得将粗提物直接⽤于测定，以免污染⽑细管。
2. 测样前仪器准备2.1 启动micrOTOFcontrol软件2.1.1.单击桌⾯图标或者通过程序⽬录启动micrOTOFcontrol软件；软件要求输⼊操作⼈员的姓名：2.1.2. 选择软件中质谱仪处于操作状态2.1.3. 调⽤⽅法: Method -> Open药物类⼩分⼦样品选⽤如蛋⽩酶解样品选⽤如⼤蛋⽩类样品选⽤如2.1.4. 仪器在操作状态下稳定20-30分钟后即可开始仪器质量准确度校正。
2.2. 仪器质量准确度校正2.2.1. 药物和酶解多肽样品，选⽤甲酸钠溶液作为校正标准液。
覆盖质量范围m/z90-1200；校正模式选⽤。
2.2.2. 蛋⽩质类样品选⽤三氟⼄酸钠溶液作为校正标准液。
覆盖质量范围m/z 200-2000；校正模式选⽤。
2.2.3. 校正液配制甲酸钠校正液：溶剂：异丙醇:⽔溶液= 1:1并含有0.2%甲酸10mM甲酸钠校正液：1ml 1M NaOH + 99ml溶剂三氟⼄酸钠校正液：溶剂：50%⼄氰含有0.1%三氟⼄酸钠(TFA)10mM甲酸钠校正液：1ml 1M NaOH + 99ml溶剂校正界⾯2.2.3.3. 测样⽅式3.1 直接进样测定对于标准品或相对较纯或混合组分较少并且不含盐的药物样品，如果仅需要进⾏鉴定，可以采⽤直接进样⽅法测定。
3.1.1 样品⽤标准溶剂（50%H2O，50%⼄腈或甲醇，0.1%甲酸）溶解或稀释3.1.2 将配好的样品或标准品吸⼊进样器（针），将进样器（针）放置于进样泵中。
蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程
蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程仪器：ABI 4800 MALDI-TOF/TOF串联质谱仪(ABI)、真空冷冻干燥机、水浴锅、Mascot分析软件、移液器、离心管主要溶液配置：考染脱色液：25mmol/L NH4HCO3、50%乙腈的水溶液银染脱色液：15mM K3Fe(CN)6、50mM NaS2O3的水溶液脱水液1：50%的乙腈溶液脱水液2：100%的乙腈吸胀液：25mmol/L NH4HCO3的水溶液酶解覆盖液：25mM的NH4HCO3、10%乙腈的水溶液酶解工作液：含0.02ug/ul胰蛋白酶的酶解覆盖液蛋白萃取液：含5% TFA、67%乙腈的水溶液一、实验操作：1、将0.2ml的枪头前端剪去0.5cm，以增大孔径，2、将枪头垂直戳向凝胶上的蛋白点，旋转枪头直至将胶点取下，3、将取好的胶粒转入装有去离子水的0.5ml离心管里，用枪头反复吸打溶液至枪头内胶粒进入离心管，4、吸干去离子水后封盖保存并做好标记。
二、注意事项：1、离心管最好用进口离心管，以免塑料污染；水最好用去离子水，2、取点时带好口罩与手套以及头套，以免皮屑等角蛋白的污染，3、蛋白鉴定需要的蛋白量越多越好，所以尽可能把某一个点里所有的蛋白全部取到，不过某些比较大的点就只要取一部分就可以了，4、针对特别小的蛋白点，枪头孔径可能会比蛋白点面积大，取点时把该蛋白点的边上空白部分也一起取一些下来也不要紧，5、蛋白点的纯度越高越容易鉴定，一般双向电泳的点都是独立的蛋白，纯度完全满足鉴定的要求，针对有部分交叉的蛋白点，取点时注意不要取混，混合的蛋白点增加质谱鉴定的难度，降低鉴定成功率，6、取完的蛋白点可以放在室温下保存1周左右，可以放在-20度或者-80度保存半年以上，7、只有胶图上清晰可见的蛋白点，其含量就足够用于质谱鉴定，所以只要取一次蛋白点就可以了，不需要把几张胶上的蛋白点取了放在一起进行鉴定，同时注意不要把胶点弄得太碎8、条件允许的话可以多取一次胶点的重复以做好备份。
蛋白质酶解产物的分离和鉴定
蛋白质酶解产物的分离和鉴定蛋白质酶解产物，是指在蛋白质水解（酶解）过程中所生成的不同大小和形状的多肽和氨基酸分子。
这其中的物质成分以及它们的化学性质，对于许多生物医学和食品科学的应用具有很大的意义。
因此，对于蛋白质酶解产物的分离和鉴定，一直是许多生物科学领域的重要研究方向之一。
分离分离方法主要有离心、过滤、电泳和色谱等。
离心法在蛋白质酶解产物的分离和鉴定中常用于固定产物的分离；过滤法则在产物分子大小的筛选上有很好的优势；电泳法得益于其快速准确地分离速度而常用于序列分析和质谱鉴定等方面；色谱法则在含多种氨基酸混合物的蛋白质酶解产物中很有用。
色谱分离方法可分为高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）等。
前者在制备工业中常常被使用。
不同的色谱方法会导致产物分离效率和纯度的不同。
产物纯度的提高会极大地影响后续分子结构和性质的研究。
鉴定鉴定方法主要有紫外吸收光谱法、红外光谱法、荧光光谱法、核磁共振法等。
紫外吸收光谱法，适用于氨基酸和普通的多肽鉴定；红外光谱法则可以用于复杂产物结构的鉴定；荧光光谱法可以用于溶液中的产物的鉴定；核磁共振法可以确定化合物的结构和原子序列，对复杂产物的结构鉴定十分有用。
质谱分析质谱分析是分子质量的测定技术之一，可以应用于产物的分离和结构鉴定中。
质谱分析的技术路线主要包括抽样和样品预处理、仪器分析和数据解释等步骤。
其中，分子质量和分子结构的确定都起到了至关重要的作用。
总体而言，分离和鉴定蛋白质酶解产物是一个复杂的过程，涉及到多个领域的知识体系。
但是，通过合适的分离和鉴定技术，我们可以更好地了解这一过程的产物及其性质，以便将来进行更深入的研究和应用。
蛋白质串联质谱鉴定
蛋白质串联质谱鉴定蛋白质串联质谱技术（Tandem Mass Spectrometry，MS/MS）是一种基于质谱技术的高效、精准、灵敏的蛋白质定性、定量鉴定方法，广泛应用于蛋白质组学研究、生物药品质量控制、疾病标志物发现等领域。
其通过对蛋白质的酶解产物（肽段）进行质谱分析，实现目标蛋白质的鉴定，包括对未知蛋白质的鉴定。
该技术产生于20世纪90年代初，起初以液相色谱与质谱联用为主（LC-MS/MS），随着基质辅助激光解吸电离（MALDI）等技术发展，蛋白质质谱鉴定进入了一个新时代。
现如今串联质谱技术已成为蛋白质组学研究的重要手段，对于解析复杂生物样品中蛋白质结构与功能具有重要意义，有助于揭示生物体内蛋白质相互作用、信号传导机制，推动生物科学的发展和疾病治疗的进步。
百泰派克生物科技BTP蛋白质串联质谱鉴定技术流程。
1.样品准备：根据实际情况选择合适的方法（如高效液相色谱或凝胶电泳等）对客户提供的蛋白质样品进行纯化、浓缩和脱盐处理，以去除杂质并提高蛋白质纯度。
2.蛋白质酶解：将纯化的蛋白质进行多重酶解，将蛋白质切割成多肽片段，便于后续质谱分析。
3.肽段分离：采用纳米高效液相色谱（nano-HPLC）对肽段进行分离，有效提高分辨率和检测灵敏度。
4.串联质谱分析：我们采用高分辨率、高灵敏度的质谱仪（Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos，Orbitrap Exploris 240）通过串联质谱（MS/MS）对分离的肽段进行质量和碎片离子分析。
5.数据分析：采用专业的数据处理软件Mascot和蛋白质数据库进行肽段的质量匹配和碎片离子搜索，最终实现蛋白质鉴定，包括蛋白质名称、氨基酸序列、匹配得分等详细信息。
蛋白质串联质谱鉴定技术的主要应用。
1.高通量蛋白质鉴定：串联质谱在蛋白质组学研究中发挥着关键作用，用于鉴定和定量生物样品中的蛋白质，揭示蛋白质的表达差异、相互作用和功能。
质谱检测蛋白的方法
第一种是将完整的蛋白质离子化，使用质谱仪对分子量进行分析。
但是，由于处理的是整个蛋白质，加上蛋白质的异质性和分析的复杂性，此方法主要限于低通量单蛋白质研究。
第二种方法是使用蛋白酶（例如胰蛋白酶）将蛋白质酶解为较小的肽，随后，利用质谱仪并通过肽质谱指纹图谱或串联质谱法进行鉴定，因此，这种方法是在肽水平上来鉴定推断蛋白质。
与完整蛋白质相比，这种更小且更均匀的片段更易于分析，并能提高鉴定的精确度。
用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法
附件1：用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法基本原理：将蛋白样品还原并烷基化后，用胰蛋白酶把蛋白酶解成肽段，然后用液相色谱/质谱仪对其进行分析。
试剂、生产厂家以及产品编号：使用方法：1.取约1毫克的总蛋白样品放入离心管中，加入1毫升6M的Guanidine(配制在100mMNH4HCO3中，PH 8.0)溶液，得到1mg/mL的蛋白溶液。
2.加入20微升1M的DTT到上述离心管中，震荡混合5秒钟。
3.将上述离心管恒温在37℃条件下反应1小时(以还原蛋白中的双硫键)。
4.加入25微升1M新鲜配制在1M NaOH中的Iodoacetic acid，在避光、室温条件下放置30分钟。
5.将以上样品平均注入两个(每个约注入500mL)具有分离10kDa以下蛋白的Centriconfilter，以12000rpm离心50分钟。
6.在以上离心管中分别加入200mL 0.1M的NH4HCO3，并离心30分钟。
多次重复此操作，以使蛋白样品中的Guanidine含量降到0.5M左右。
7.将以上两个离心管滤层上的蛋白样品，分别、多次加入总量约500mL 0.1M的NH4HCO3溶液以完全溶解，并将这些含有蛋白样品的溶液转移到装有20mL的Trypsin试管中，再加入500mL 0.1M的NH4HCO3溶液。
使试管中液体的总量为1000mL，Trypsin约占总量的1/50。
8.将上述试管恒温在37℃水浴中反应16小时。
9.分别吸取上述样品500mL到两个Centricon filter中，以13400rpm离心50分钟。
这样可以除去多余的Trypsin，终止酶切反应。
(为节省时间，这里的过滤步骤可省略)10.将上述两个离心管下部的滤出液收集到一个离心管中，在35℃下真空干燥浓缩60分钟。
此过程有助于NH4HCO3的分解并挥发，降低样品中盐的浓度。
继续干燥浓缩至样品量到100mL左右。
11.加0.1%的甲酸溶液定量到所需要的样品浓度，并注意观察样品溶液是否澄清。
蛋白质酶解
一．还原烷基化1．将目的蛋白溶液冷冻浓缩至50ul以下，每种蛋白溶液预留10ul测蛋白含量和Zip-Tip脱盐（脱盐后可上MALDI-TOF），其他的还原烷基化2．配制还原buffer：0.2M Tris-HCl+5.0mM EDTA+6M HCl-胍+0.1M DTT （5.72gHCl-胍+2ml 10mg/ml EDTA+0.2M Tris-HCl（pH8.3）至10ml+154mg DTT）3．每种目的蛋白溶液加入150ul还原buffer，同样称量1mg目的蛋白150ul还原buffer，各自混匀，40℃温浴4 h4．冷至室温，加3mg碘代乙酰胺烷基化，暗中放置15min以上二．反相柱脱盐（也可Zip-Tip脱盐）1．配制蛋白流动相：A：0.1%TFAB：0.09%TFA +60%乙氰2．接好色谱柱，同三中步骤，平衡色谱柱，B相冲洗系统，0.2ml/min小流速平衡柱子，冲洗残留蛋白至基线走平3．进样，100ul进样环，流速1ml/min，进样时间设置为15-30s，检测时间20min 4．设置流程：time A B0.0 100% 0%12.0 100% 0%12.1 0% 100%20.0 0% 100%21.0 100% 0%注意接收目的蛋白，为使盐分能充分的洗脱下来，洗脱时间可以变。
5．样品走完后先关紫外灯，95%水/乙氰冲盐15min，流速1.5ml/min，更换甲醇流动相0.2ml/min冲一夜。
三．酶解1．将脱盐后的蛋白液冷冻浓缩至50ul以下，预留5ul上MALDI-TOF2．称取15mg NH4HCO3稀释至1.5ml，浓度为1%3．每个样品加100ul 1% NH4HCO3，按蛋白含量20：1—100：1加胰酶13—15ul，酶解过夜四．脱盐（也可Zip-Tip脱盐）将酶解的肽段反相脱盐，步骤同六五．分析蛋白用MALDI-TOF分析未烷基化Zip-Tip脱盐，烷基化后液相脱盐，酶解后液相脱盐样品六．MOSCOT鉴定蛋白将蛋白片段峰输入，查看得分，超过68分即得到鉴定。