浓缩苹果汁中蛋白质的提纯与性质研究
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
样品装入透析袋，留三分之一至一半的空间，两 端用夹子夹紧，于去离子水中透析。６ ～８ｈ 更换一次去 离子水，并使用磁力搅拌器搅拌以加快透析速度。用 １％ ＢａＣｌ２ 检查透析效果，直到无白色沉淀生成。将透 析后的样品浓缩并冷冻干燥。 １．４．３ 离子交换色谱纯化
缓冲液：０．０２ｍｏｌ／Ｌ 醋酸钠缓冲溶液，ｐＨ５．８； 洗脱液：先用 １００ｍｌ ０．０２ｍｏｌ／Ｌ 醋酸钠缓冲溶液将不 吸附的蛋白质洗下来，再用 ５００ｍｌ ０～０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 溶 液（溶于 ０．０２ｍｏｌ／Ｌ 醋酸钠缓冲溶液，ｐＨ５．８）线性梯度洗 脱，最后用 １００ｍｌ １ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 溶液（溶于 ０．０２ｍｏｌ／Ｌ 醋酸 钠缓冲溶液，ｐ Ｈ ５ ． ８ ） 洗脱吸附较为牢固的蛋白质； 流速：２ ｍ ｌ ／ ｍ ｉｎ； 温度：４ ℃；
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｗｏ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ， ｏｎｅ ｉｓ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅ ａｐｐｌｅ ｆｒｕｉｔ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅰ）， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎｅ ｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｗｈｉｃｈ ａｄｄｅｄ ｉｎｔｏ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅱ）． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅰ ｉｓ ｓｍａｌｌ， ａｂｏｕｔ ２５ｋＤａ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅱｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ３１ｋＤａ． Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅱ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｓ ｌｏｗ， ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅱｎｏｔ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｏｓｔ－ｈａｚｅ ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 中图分类号：ＴＳ２０１．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００６）１１－０２４４－０５
１．５．４ 染 色 、 脱 色 先加入染色液 １００ｍｌ，常温下摇床摇动染色 ｌｈ，弃
染色液，加入脱色液 １ ０ ０ ｍ ｌ ，摇动脱色 ｌ ｈ ，换脱色液 后再次脱色 ２ ｈ ，观察结果，用白光扫描仪，选择透射 模式进行凝胶扫描。 １．６ 氨基酸组成分析
将离子交换得到的蛋白Ⅱ采用 ＨＩＴＡＣＨＩ Ｌ－８８００ 型氨 基酸自动分析仪测定。样品用 ６ｍｏｌ／Ｌ 盐酸于 １１０℃水解 ２４ｈ，将水解液处理后蒸干（约 ４０℃），加入 ０．０２ｍｏｌ／Ｌ 盐 酸，此液上机测定氨基酸含量。
厂；分光光度计（Ｔ６） 北京普析通用仪器有限责任公 司；旋转蒸发器（Ｒ－２０１） 上海申顺生物科技有限公司； 磁力搅拌器（７８－２） 国华电器有限公司；电热套（９８－１－Ｂ） 天津市泰斯特仪器有限公司；恒温循环器（ＨＸ－１０５０） 北 京德天佑科技发展有限公司；电热恒温水浴锅（ＤＫ－Ｓ２４） 上海精密实验设备有限公司；自动部分收集器 上海沪 西分析仪器厂；恒流泵 上海沪西分析仪器厂；层析 柱（２．６ × ２０ｃｍ） 上海青浦沪西仪器厂；循环水式多用 真空泵（ＳＨＺ－Ｄ） 巩义市英峪予华仪器厂；真空冷冻干 燥机（ＬＧＪ－１８） 军事医学科学院实验仪器厂；精密ｐＨ计 （ｐＨＳ－３Ｃ型） 上海雷磁仪器厂；电子天平（ＢＰ２１１０型） 上 海天平仪器厂。 １．３ 浓缩苹果汁的制备
１ 材料与方法
１．１ 材料 小国光苹果 中国农业大学农贸市场；Ｄ Ｅ Ａ Ｅ －
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（１７－０７０９－０１，７５ｍｌ） Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ； 果胶酶 山东烟台北方安德利果汁股份有限公司，淀粉 酶 山东烟台北方安德利果汁股份有限公司。 １．２ 设备
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ Ａｐｐｌｅ Ｊｕｉｃｅ
ＬＩ Ｑｕａｎ－ｈｏｎｇ，ＬＩ Ｎａ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ）
饮料中关于蛋白质的研究已做了大量的研究，通常 是通过离心或硫酸铵沉淀来收集蛋白质，然后进行化学 分析、氨基酸分析、色谱分析或电泳［１］。Ｗａｔｅｒｓ 等人 用硫酸铵沉淀结合超滤的方法分离出了葡萄酒中不同分 子量的蛋白质，氨基酸组成分析发现这些蛋白都富含疏 水性氨基酸［２］。Ｂａｙｌｙ 和 Ｂｅｒｇ 用离子交换色谱分离出了 葡萄酒中的蛋白质，并得到四个单一组分［ ３ ］ 。
１．４ 浓缩苹果汁蛋白质的提纯 １．４．１ 硫酸铵沉淀
取一定体积的浓缩苹果汁稀释到 １１．５Ｂｒｉｘ，加入 ８０％ 的饱和硫酸铵，所加硫酸铵需用研钵磨成细粉状，缓 慢加入，为防止局部硫酸铵浓度过高引起蛋白质变性， 可用磁力搅拌器搅拌使硫酸铵完全溶解，静置过夜后高 速冷冻离心（１２０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），所得沉淀于去离子水 中透析。 １．４．２ 透析
本实验以市售成熟小国光为原料，按照山东烟台安 德利果汁股份有限公司的生产工艺制得不加酶和加酶酶 解的两种浓缩苹果汁。在实验过程中，均将浓缩果汁 稀释到 １１．５Ｂｒｉｘ。
苹果中的蛋白质种类很多，但是所有的蛋白质并不 能完全存在于苹果汁中［ ８ ］ ，在巴氏杀菌、酶解、超滤
和吸附过程中会将多种蛋白除去。图 ２ 是不加酶苹果汁 的蛋白质的离子交换洗脱曲线，可以看出在 Ｎ ａ Ｃ ｌ 浓度 为 ０．２ｍｏｌ／Ｌ 下有唯一的蛋白峰。而图 ３ 中酶解后的蛋白 质离子交换洗脱图上除了在 ０．２ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＣｌ 浓度下有一 小峰（蛋白Ⅰ），在 ＮａＣｌ 浓度为 ０．３～０．４ｍｏｌ／Ｌ 之间还有一 大峰（ 蛋白Ⅱ） 。分别将这两个峰收集后透析冻干。 ２．３ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
１．５．２ 聚丙烯酰胺凝胶的灌制 按照电泳模具说明书组装好模具，配制 １５％ 的分离
胶，待聚合后再配制 ５ ％ 的浓缩胶，插好梳子，约半 小时后凝胶形成，从制胶模具上取下，放入电泳槽。
１．５．３ 电泳 取离子交换纯化得到的苹果汁蛋白和酶（果胶酶和蛋
白酶按 １：１ 的比例混合），上样，样品溶液先与 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 上样缓冲液混合，沸水加热 ５ ｍ ｉ ｎ 。样品和标准相对分 子量蛋白的上样量均为 ２０μｌ，电泳时间 ３ｈ 左右。电泳 条件：８０Ｖ １５ｍｉｎ；后 １００Ｖ 待溴酚蓝走到胶下端停止。
每管收集 ４ ｍ ｌ。 紫外吸收法跟踪检测蛋白含量，在紫外分光光度计 上直接读取 ２８０ｎｍ 的吸光度值 Ａ ２８０，根据洗脱曲线分别 收集各洗脱峰，将收集到的蛋白于去离子水中充分透 析，用 １ ％ Ａ ｇ Ｎ Ｏ ３ 检查透析效果，将收集的样品浓缩 后冷冻干燥。 １．５ 十二烷基硫酸钠 － 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
色谱条件：离子交换柱 ２．６ × １５０ｍｍ；流速 ０．２２５ｍｌ／
246 2006, Vol. 27, No. 11
食品科学
※工艺技术
ｍｉｎ 、流动相柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液、进样量 ５０μｌ。
２ 结果与分析
２．１ 离子交换缓冲液和 ｐＨ 值的选择 本实验分别采用了磷酸氢二钠 － 磷酸二氢钠缓冲液
１．５．１ ＳＤＳ－ 聚丙烯酰胺凝胶的配制 丙烯酰胺贮存液 以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去
离子水配制含有 ２９％（Ｗ／Ｖ）丙烯酰胺和 １％（Ｗ／Ｖ） Ｎ，Ｎ－ 亚 甲双丙烯酰胺的贮存液置棕色瓶中；
十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ） 用去离子水配成１０％ （Ｗ／ Ｖ） 贮存液保存于室温；
分离胶缓冲液 １．５ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ８．８； 浓缩胶缓冲液 １ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ６．８； 过硫酸铵溶液 １０％（现配现用）； Ｔｒｉｓ－甘氨酸电泳缓冲液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、２５０ｍｍｏｌ／ Ｌ 甘氨酸（ｐＨ８．３）、０．１％ ＳＤＳ； 样品处理液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ６．８）、１００ｍｍｏｌ／ Ｌ ＤＴＴ（或 ５％ 巯基乙醇）、２％ ＳＤＳ、０．１％ 溴酚蓝、１０％ 甘油； 脱色液 ４０％ 乙醇、１０％ 冰醋酸水溶液； 染色液 １０００ｍｌ 脱色液中加入 ０．２５ｇ 考马斯亮蓝 Ｒ２５０。
目前国内外对苹果汁蛋白质的研究很少，主要是因
为苹果汁中蛋白质含量很少［ ５ ～７ ］ 。本实验为了研究蛋白 质与后混浊的关系，采用山东烟台北方安德利果汁股份 有限公司的生产工艺，酶的添加量为 ５０μｌ／Ｌ，使果汁 易于产生混浊。利用硫酸铵沉淀和离子交换柱层析相结 合的方法提纯果汁蛋白，减少了分离步骤，同时最大 程度的保留了目的蛋白。考虑到酶是整个生产工艺中唯 一的外源蛋白，因此本实验分别研究了不加酶和加酶的 果汁中蛋白质的变化，以确定酶在苹果汁中的作用。
高速冷冻离心机（ＧＬ－２０Ｇ－Ⅱ） 上海安亭科学仪器
收稿日期：２００６－０８－１７ 基金项目：国家 ８６３ 项目（２００２ＡＡ２４５０９１） 作者简介：李全宏（ １ ９ ６ ６ － ） ，男，副教授，研究方向为农产品加工与贮藏。
※工艺技术
食品科学
2006, Vol. 27, No. 11 245
（０．０２ｍｏｌ／Ｌ）和醋酸－醋酸钠缓冲液（０．０２ｍｏｌ／Ｌ）。发现无论 在何种 ｐＨ 下，磷酸氢二钠 － 磷酸二氢钠缓冲液均不能将 蛋白质分开，醋酸 － 醋酸钠缓冲液则有较好的分离效果。
在用离子交换树脂进行生物大分子分离时，ｐ Ｈ 值 是很重要的因素。对于蛋白质两性电解质而言，在不
同 ｐ Ｈ 值时，所带电荷不同，其在离子交换树脂上的吸 附程度也不同。图 １ 是不同 ｐ Ｈ 值的洗脱曲线。可以看 到，ｐＨ４．０ 无法将蛋白分开，ｐＨ５．４ 和 ｐＨ６．２ 能将蛋白 分开，但是蛋白峰的形状不好，根据 ｐ Ｈ 值升高时洗脱 峰型的变化趋势，选择最适 ｐ Ｈ 值为 ５ ． ８ 。 ２．２ 色谱纯化结果分析
244 ห้องสมุดไป่ตู้006, Vol. 27, No. 11
食品科学
※工艺技术
浓缩苹果汁中蛋白质的提纯与性质研究
李全宏，李 娜 （中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 １０００８３）
摘 要：采用离子交换和 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 分离纯化浓缩苹果汁中蛋白质，并对其进行性质分析。结果表明存在于浓缩 苹果汁中的蛋白质组分有两种，一种是苹果本身的蛋白（蛋白Ⅰ），另一种是果汁加工中的外源酶蛋白（蛋白Ⅱ）。蛋 白Ⅰ分子量很小，为 ２ ５ ｋ Ｄ ａ，疏水性氨基酸含量高，易和酚类物质结合产生后混浊。蛋白Ⅱ分子量均大于 ３ １ ｋ Ｄ ａ， 氨基酸组成分析发现其脯氨酸含量极少，认为其不直接参与后混浊的形成。 关键词：苹果汁；蛋白质；分离；纯化
当前生产中酶解工艺主要是应用于浊度的减轻，果 汁的酶解主要是加入果胶酶和淀粉酶，生产上的添加量 均为 ２ ５μｌ ／ Ｌ ，反应温度 ４ ５ ℃，酶解 ２ ｈ ，目的是为了 分解果胶和淀粉，减轻果汁的浊度，但酶的加入，也 使果汁中的蛋白质含量增加，也有可能是造成后混浊的 因素之一。同时液化酶的加入使细胞壁的糖蛋白溶解到 果汁中，形成混浊［４］。根据山东烟台北方安德利果汁股份 有限公司的实际经验，酶的添加量超过 ５０μｌ／Ｌ 时，就 能明显地看到混浊的产生。
缓冲液：０．０２ｍｏｌ／Ｌ 醋酸钠缓冲溶液，ｐＨ５．８； 洗脱液：先用 １００ｍｌ ０．０２ｍｏｌ／Ｌ 醋酸钠缓冲溶液将不 吸附的蛋白质洗下来，再用 ５００ｍｌ ０～０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 溶 液（溶于 ０．０２ｍｏｌ／Ｌ 醋酸钠缓冲溶液，ｐＨ５．８）线性梯度洗 脱，最后用 １００ｍｌ １ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 溶液（溶于 ０．０２ｍｏｌ／Ｌ 醋酸 钠缓冲溶液，ｐ Ｈ ５ ． ８ ） 洗脱吸附较为牢固的蛋白质； 流速：２ ｍ ｌ ／ ｍ ｉｎ； 温度：４ ℃；
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｗｏ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ， ｏｎｅ ｉｓ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅ ａｐｐｌｅ ｆｒｕｉｔ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅰ）， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎｅ ｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｗｈｉｃｈ ａｄｄｅｄ ｉｎｔｏ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅱ）． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅰ ｉｓ ｓｍａｌｌ， ａｂｏｕｔ ２５ｋＤａ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅱｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ３１ｋＤａ． Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅱ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｓ ｌｏｗ， ｐｒｏｔｅｉｎ Ⅱｎｏｔ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｏｓｔ－ｈａｚｅ ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 中图分类号：ＴＳ２０１．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００６）１１－０２４４－０５
１．５．４ 染 色 、 脱 色 先加入染色液 １００ｍｌ，常温下摇床摇动染色 ｌｈ，弃
染色液，加入脱色液 １ ０ ０ ｍ ｌ ，摇动脱色 ｌ ｈ ，换脱色液 后再次脱色 ２ ｈ ，观察结果，用白光扫描仪，选择透射 模式进行凝胶扫描。 １．６ 氨基酸组成分析
将离子交换得到的蛋白Ⅱ采用 ＨＩＴＡＣＨＩ Ｌ－８８００ 型氨 基酸自动分析仪测定。样品用 ６ｍｏｌ／Ｌ 盐酸于 １１０℃水解 ２４ｈ，将水解液处理后蒸干（约 ４０℃），加入 ０．０２ｍｏｌ／Ｌ 盐 酸，此液上机测定氨基酸含量。
厂；分光光度计（Ｔ６） 北京普析通用仪器有限责任公 司；旋转蒸发器（Ｒ－２０１） 上海申顺生物科技有限公司； 磁力搅拌器（７８－２） 国华电器有限公司；电热套（９８－１－Ｂ） 天津市泰斯特仪器有限公司；恒温循环器（ＨＸ－１０５０） 北 京德天佑科技发展有限公司；电热恒温水浴锅（ＤＫ－Ｓ２４） 上海精密实验设备有限公司；自动部分收集器 上海沪 西分析仪器厂；恒流泵 上海沪西分析仪器厂；层析 柱（２．６ × ２０ｃｍ） 上海青浦沪西仪器厂；循环水式多用 真空泵（ＳＨＺ－Ｄ） 巩义市英峪予华仪器厂；真空冷冻干 燥机（ＬＧＪ－１８） 军事医学科学院实验仪器厂；精密ｐＨ计 （ｐＨＳ－３Ｃ型） 上海雷磁仪器厂；电子天平（ＢＰ２１１０型） 上 海天平仪器厂。 １．３ 浓缩苹果汁的制备
１ 材料与方法
１．１ 材料 小国光苹果 中国农业大学农贸市场；Ｄ Ｅ Ａ Ｅ －
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（１７－０７０９－０１，７５ｍｌ） Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ； 果胶酶 山东烟台北方安德利果汁股份有限公司，淀粉 酶 山东烟台北方安德利果汁股份有限公司。 １．２ 设备
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ Ａｐｐｌｅ Ｊｕｉｃｅ
ＬＩ Ｑｕａｎ－ｈｏｎｇ，ＬＩ Ｎａ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ）
饮料中关于蛋白质的研究已做了大量的研究，通常 是通过离心或硫酸铵沉淀来收集蛋白质，然后进行化学 分析、氨基酸分析、色谱分析或电泳［１］。Ｗａｔｅｒｓ 等人 用硫酸铵沉淀结合超滤的方法分离出了葡萄酒中不同分 子量的蛋白质，氨基酸组成分析发现这些蛋白都富含疏 水性氨基酸［２］。Ｂａｙｌｙ 和 Ｂｅｒｇ 用离子交换色谱分离出了 葡萄酒中的蛋白质，并得到四个单一组分［ ３ ］ 。
１．４ 浓缩苹果汁蛋白质的提纯 １．４．１ 硫酸铵沉淀
取一定体积的浓缩苹果汁稀释到 １１．５Ｂｒｉｘ，加入 ８０％ 的饱和硫酸铵，所加硫酸铵需用研钵磨成细粉状，缓 慢加入，为防止局部硫酸铵浓度过高引起蛋白质变性， 可用磁力搅拌器搅拌使硫酸铵完全溶解，静置过夜后高 速冷冻离心（１２０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），所得沉淀于去离子水 中透析。 １．４．２ 透析
本实验以市售成熟小国光为原料，按照山东烟台安 德利果汁股份有限公司的生产工艺制得不加酶和加酶酶 解的两种浓缩苹果汁。在实验过程中，均将浓缩果汁 稀释到 １１．５Ｂｒｉｘ。
苹果中的蛋白质种类很多，但是所有的蛋白质并不 能完全存在于苹果汁中［ ８ ］ ，在巴氏杀菌、酶解、超滤
和吸附过程中会将多种蛋白除去。图 ２ 是不加酶苹果汁 的蛋白质的离子交换洗脱曲线，可以看出在 Ｎ ａ Ｃ ｌ 浓度 为 ０．２ｍｏｌ／Ｌ 下有唯一的蛋白峰。而图 ３ 中酶解后的蛋白 质离子交换洗脱图上除了在 ０．２ｍｏｌ／Ｌ 的 ＮａＣｌ 浓度下有一 小峰（蛋白Ⅰ），在 ＮａＣｌ 浓度为 ０．３～０．４ｍｏｌ／Ｌ 之间还有一 大峰（ 蛋白Ⅱ） 。分别将这两个峰收集后透析冻干。 ２．３ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
１．５．２ 聚丙烯酰胺凝胶的灌制 按照电泳模具说明书组装好模具，配制 １５％ 的分离
胶，待聚合后再配制 ５ ％ 的浓缩胶，插好梳子，约半 小时后凝胶形成，从制胶模具上取下，放入电泳槽。
１．５．３ 电泳 取离子交换纯化得到的苹果汁蛋白和酶（果胶酶和蛋
白酶按 １：１ 的比例混合），上样，样品溶液先与 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 上样缓冲液混合，沸水加热 ５ ｍ ｉ ｎ 。样品和标准相对分 子量蛋白的上样量均为 ２０μｌ，电泳时间 ３ｈ 左右。电泳 条件：８０Ｖ １５ｍｉｎ；后 １００Ｖ 待溴酚蓝走到胶下端停止。
每管收集 ４ ｍ ｌ。 紫外吸收法跟踪检测蛋白含量，在紫外分光光度计 上直接读取 ２８０ｎｍ 的吸光度值 Ａ ２８０，根据洗脱曲线分别 收集各洗脱峰，将收集到的蛋白于去离子水中充分透 析，用 １ ％ Ａ ｇ Ｎ Ｏ ３ 检查透析效果，将收集的样品浓缩 后冷冻干燥。 １．５ 十二烷基硫酸钠 － 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
色谱条件：离子交换柱 ２．６ × １５０ｍｍ；流速 ０．２２５ｍｌ／
246 2006, Vol. 27, No. 11
食品科学
※工艺技术
ｍｉｎ 、流动相柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液、进样量 ５０μｌ。
２ 结果与分析
２．１ 离子交换缓冲液和 ｐＨ 值的选择 本实验分别采用了磷酸氢二钠 － 磷酸二氢钠缓冲液
１．５．１ ＳＤＳ－ 聚丙烯酰胺凝胶的配制 丙烯酰胺贮存液 以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去
离子水配制含有 ２９％（Ｗ／Ｖ）丙烯酰胺和 １％（Ｗ／Ｖ） Ｎ，Ｎ－ 亚 甲双丙烯酰胺的贮存液置棕色瓶中；
十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ） 用去离子水配成１０％ （Ｗ／ Ｖ） 贮存液保存于室温；
分离胶缓冲液 １．５ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ８．８； 浓缩胶缓冲液 １ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ６．８； 过硫酸铵溶液 １０％（现配现用）； Ｔｒｉｓ－甘氨酸电泳缓冲液 ２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、２５０ｍｍｏｌ／ Ｌ 甘氨酸（ｐＨ８．３）、０．１％ ＳＤＳ； 样品处理液 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ６．８）、１００ｍｍｏｌ／ Ｌ ＤＴＴ（或 ５％ 巯基乙醇）、２％ ＳＤＳ、０．１％ 溴酚蓝、１０％ 甘油； 脱色液 ４０％ 乙醇、１０％ 冰醋酸水溶液； 染色液 １０００ｍｌ 脱色液中加入 ０．２５ｇ 考马斯亮蓝 Ｒ２５０。
目前国内外对苹果汁蛋白质的研究很少，主要是因
为苹果汁中蛋白质含量很少［ ５ ～７ ］ 。本实验为了研究蛋白 质与后混浊的关系，采用山东烟台北方安德利果汁股份 有限公司的生产工艺，酶的添加量为 ５０μｌ／Ｌ，使果汁 易于产生混浊。利用硫酸铵沉淀和离子交换柱层析相结 合的方法提纯果汁蛋白，减少了分离步骤，同时最大 程度的保留了目的蛋白。考虑到酶是整个生产工艺中唯 一的外源蛋白，因此本实验分别研究了不加酶和加酶的 果汁中蛋白质的变化，以确定酶在苹果汁中的作用。
高速冷冻离心机（ＧＬ－２０Ｇ－Ⅱ） 上海安亭科学仪器
收稿日期：２００６－０８－１７ 基金项目：国家 ８６３ 项目（２００２ＡＡ２４５０９１） 作者简介：李全宏（ １ ９ ６ ６ － ） ，男，副教授，研究方向为农产品加工与贮藏。
※工艺技术
食品科学
2006, Vol. 27, No. 11 245
（０．０２ｍｏｌ／Ｌ）和醋酸－醋酸钠缓冲液（０．０２ｍｏｌ／Ｌ）。发现无论 在何种 ｐＨ 下，磷酸氢二钠 － 磷酸二氢钠缓冲液均不能将 蛋白质分开，醋酸 － 醋酸钠缓冲液则有较好的分离效果。
在用离子交换树脂进行生物大分子分离时，ｐ Ｈ 值 是很重要的因素。对于蛋白质两性电解质而言，在不
同 ｐ Ｈ 值时，所带电荷不同，其在离子交换树脂上的吸 附程度也不同。图 １ 是不同 ｐ Ｈ 值的洗脱曲线。可以看 到，ｐＨ４．０ 无法将蛋白分开，ｐＨ５．４ 和 ｐＨ６．２ 能将蛋白 分开，但是蛋白峰的形状不好，根据 ｐ Ｈ 值升高时洗脱 峰型的变化趋势，选择最适 ｐ Ｈ 值为 ５ ． ８ 。 ２．２ 色谱纯化结果分析
244 ห้องสมุดไป่ตู้006, Vol. 27, No. 11
食品科学
※工艺技术
浓缩苹果汁中蛋白质的提纯与性质研究
李全宏，李 娜 （中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 １０００８３）
摘 要：采用离子交换和 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 分离纯化浓缩苹果汁中蛋白质，并对其进行性质分析。结果表明存在于浓缩 苹果汁中的蛋白质组分有两种，一种是苹果本身的蛋白（蛋白Ⅰ），另一种是果汁加工中的外源酶蛋白（蛋白Ⅱ）。蛋 白Ⅰ分子量很小，为 ２ ５ ｋ Ｄ ａ，疏水性氨基酸含量高，易和酚类物质结合产生后混浊。蛋白Ⅱ分子量均大于 ３ １ ｋ Ｄ ａ， 氨基酸组成分析发现其脯氨酸含量极少，认为其不直接参与后混浊的形成。 关键词：苹果汁；蛋白质；分离；纯化
当前生产中酶解工艺主要是应用于浊度的减轻，果 汁的酶解主要是加入果胶酶和淀粉酶，生产上的添加量 均为 ２ ５μｌ ／ Ｌ ，反应温度 ４ ５ ℃，酶解 ２ ｈ ，目的是为了 分解果胶和淀粉，减轻果汁的浊度，但酶的加入，也 使果汁中的蛋白质含量增加，也有可能是造成后混浊的 因素之一。同时液化酶的加入使细胞壁的糖蛋白溶解到 果汁中，形成混浊［４］。根据山东烟台北方安德利果汁股份 有限公司的实际经验，酶的添加量超过 ５０μｌ／Ｌ 时，就 能明显地看到混浊的产生。