免疫沉淀试验PPT讲稿
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免疫沉淀试验PPT课件
淀现象。
.
3
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合，快速但不可见 免疫复合物。
.
4
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验
免疫扩散试验
絮状沉淀试验
免疫电泳技术
免疫浊度测定
.
5
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
第六章 免疫沉淀试验
.
1
教学目的
掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验 原理
熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
.
2
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation
reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退
.
46
电泳载体： 琼脂 琼脂糖凝胶
常用浓度：0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性，常温易凝 固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。
.
47
蛋白质的两性解离性质：
--NH2 + H2O
--NH3+ + OH-
--COOH
--COO- +H+
.
75
.
57
（三）免疫电泳
原理：区带电泳＋双向扩散
1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼
不可见的若干区带
2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，
加入相应抗血清进行双向扩散
《免疫共沉淀》课件
明确实验目的和预期结果，设计合理 的实验方案。
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
免疫共沉淀原理及注意事项-PPT精品文档
Leabharlann 10% glycerol（甘油）,
0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20
2.1免疫沉淀中抗体的选择
注意的问题：2.2抗体
使用对照抗体：（阴性和阳性） 阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A， 用膜蛋白B）
未检测到目得蛋白或蛋白很少
注意的问题：1.裂解液
细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞 内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用 非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞
的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解
液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer
可能原因 上操作并防止冻融 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓 度 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保 存防止变质或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位 6.裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液 处理方法 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰
proteinA/G-琼脂糖珠复合物
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异
性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。
ProteinA/G的作用及具体原理
“捕获”抗体，形成复合物，
抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads ProteinA/G-garose beads 非共价健结合 共价结合
0.2 mM PMSF, 0.2%Tween 20
2.1免疫沉淀中抗体的选择
注意的问题：2.2抗体
使用对照抗体：（阴性和阳性） 阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG 兔多克隆抗体：正常兔IgG 阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A， 用膜蛋白B）
未检测到目得蛋白或蛋白很少
注意的问题：1.裂解液
细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞 内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用 非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞
的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解
液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer
可能原因 上操作并防止冻融 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓 度 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保 存防止变质或干燥 5.Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位 6.裂解液严谨度太高： 改用低严谨度裂解液 处理方法 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰
proteinA/G-琼脂糖珠复合物
Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异
性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。 目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上。
ProteinA/G的作用及具体原理
“捕获”抗体，形成复合物，
抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads ProteinA/G-garose beads 非共价健结合 共价结合
【高质量】免疫共沉淀-研究生实验课PPT文档
合的物质。做 preclear 的IgG 是不针对特异性抗原的。
琼脂糖珠的选择
SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。 加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l，4℃ 转鼓过夜(10min) ；
将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min
将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。
； 没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的信号太弱
Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；
T对A某P 些tag体不外能生用吸化于反取分应析的上钙蛋调清白信原号液料通的到路纯。新化制E备P也管是很中重要，的每辅助管依据加。1μg 对照兔IgG，同时加入Protein
每种细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。
做 preclear 的AIgGa是ga不r针o对se特，异性4抗℃原转的。鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min；
仔细检查抗体的说明书。
preclear及其作用 一旦细胞被匀浆化，各个departments就不存在了，每个蛋白都会与其他所有蛋白有接触的机会，所以，发生一些unexpected修饰（或
此时，磁珠是最佳的选择。
A然ff而in由ity于Ta其gs中相包含似钙调的蛋成白和分蛋白(如A的无相互关作用IgdoGm)ain,，用天然一会抗结合相钙信应号来相关源蛋白的，I从g而G干与扰或蛋掩白盖靶裂蛋白解与液钙信和号蛋白之间的相
互作用，有一定的应用局限。
琼脂糖珠的选择
SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。 加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l，4℃ 转鼓过夜(10min) ；
将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min
将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。
； 没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的信号太弱
Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；
T对A某P 些tag体不外能生用吸化于反取分应析的上钙蛋调清白信原号液料通的到路纯。新化制E备P也管是很中重要，的每辅助管依据加。1μg 对照兔IgG，同时加入Protein
每种细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。
做 preclear 的AIgGa是ga不r针o对se特，异性4抗℃原转的。鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min；
仔细检查抗体的说明书。
preclear及其作用 一旦细胞被匀浆化，各个departments就不存在了，每个蛋白都会与其他所有蛋白有接触的机会，所以，发生一些unexpected修饰（或
此时，磁珠是最佳的选择。
A然ff而in由ity于Ta其gs中相包含似钙调的蛋成白和分蛋白(如A的无相互关作用IgdoGm)ain,，用天然一会抗结合相钙信应号来相关源蛋白的，I从g而G干与扰或蛋掩白盖靶裂蛋白解与液钙信和号蛋白之间的相
互作用，有一定的应用局限。
沉淀反应(免疫学检验课件)
第十三章
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。
免疫沉淀实验课件
第39题 解析：参考答案：C [解析] “天下虽安，忘战必危”体现的是矛盾双方在一定条件下可以相互转化的辩证法思想， 因此要居安思危。“贾人旱则资舟，水则资车，以待乏也”意思是商人旱天购买舟船， 涝天购买车辆，等待货有所缺。与题干中的意思相似，体现未雨绸缪、居安思危的逆 向思维。本题答案选C。
第40题 解析：参考答案：D [解析] 植物蛋白的消化、吸收要比动物蛋白差。动物蛋白和人类的营养结构比较吻合，其蛋 白质的种类和结构更加接近人体的蛋白结构和数量，而且一般都含有人体必需的8种氨 基酸。故本题选D。
实验一 免疫沉淀类反应
1
l 免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在 溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗 体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。
2
对流免疫电泳
环状沉淀反应
沉
电
淀 反
琼脂扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
泳
＋
技 术
应
絮状沉淀反应
火箭免疫电泳
3
一、双向免疫扩散试验
实验原理
l 指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散， 彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线。
12
13
试剂和器材
l 抗原：人全血清 l 抗体：兔抗人全血清 l 1％琼脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥缓冲液
配制 l 电泳槽、电泳仪、 l 载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器
14
实验步骤
l 制板 取已经融化的1%琼脂约4ml，加到 水平放置的载玻片上，使成厚度约为 1.5mm的琼脂板，待冷凝。
l 打孔 打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm。
1
7
l 倍比稀释抗体 （见下表） l 加样 用微量加样器分别取抗原、抗体10ul加入各
第40题 解析：参考答案：D [解析] 植物蛋白的消化、吸收要比动物蛋白差。动物蛋白和人类的营养结构比较吻合，其蛋 白质的种类和结构更加接近人体的蛋白结构和数量，而且一般都含有人体必需的8种氨 基酸。故本题选D。
实验一 免疫沉淀类反应
1
l 免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在 溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗 体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。
2
对流免疫电泳
环状沉淀反应
沉
电
淀 反
琼脂扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
泳
＋
技 术
应
絮状沉淀反应
火箭免疫电泳
3
一、双向免疫扩散试验
实验原理
l 指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散， 彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线。
12
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试剂和器材
l 抗原：人全血清 l 抗体：兔抗人全血清 l 1％琼脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥缓冲液
配制 l 电泳槽、电泳仪、 l 载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器
14
实验步骤
l 制板 取已经融化的1%琼脂约4ml，加到 水平放置的载玻片上，使成厚度约为 1.5mm的琼脂板，待冷凝。
l 打孔 打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm。
1
7
l 倍比稀释抗体 （见下表） l 加样 用微量加样器分别取抗原、抗体10ul加入各
免疫共沉淀(Immunoprecipitation,+IP)ppt课件
乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少， DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实 验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效 沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍.
Байду номын сангаас
异丙醇： 优点：所需容积小且速度快，适用于浓度低， 而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选 择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、 tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下 长时间放置。
缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在 DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的 乙醇漂洗DNA沉淀数次。
（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量
裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖
珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中
4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连；
（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000
免疫共沉淀技术的应用
肿瘤 酶与病毒 信号传导 寄生虫
免疫共沉淀技术的优点与局限性
优点：
与蛋白质亲和层析一样，检测的产物 是蛋 白质的粗提物；
抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的 浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效 应；
蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在； 复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用 可以在天然状态下进行，可以避免人为影响， 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复 合体.
rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；
将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液
Байду номын сангаас
异丙醇： 优点：所需容积小且速度快，适用于浓度低， 而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选 择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、 tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下 长时间放置。
缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在 DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的 乙醇漂洗DNA沉淀数次。
（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量
裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖
珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中
4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连；
（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000
免疫共沉淀技术的应用
肿瘤 酶与病毒 信号传导 寄生虫
免疫共沉淀技术的优点与局限性
优点：
与蛋白质亲和层析一样，检测的产物 是蛋 白质的粗提物；
抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的 浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效 应；
蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在； 复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用 可以在天然状态下进行，可以避免人为影响， 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复 合体.
rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；
将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液
临床免疫学检验课件第6章沉淀反应2
加入抗血清
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
•基本原理：电泳技术+沉淀反应 •优点：加快沉淀反应的速度；
提高灵敏度。 •应用： 主要用于细微成分的分析。
•电泳原理：带电质点在电场中向带有异相电荷的 电极移动。
•在常规血清蛋白电泳，一般选择可使所有蛋白质 分子均带负电荷的碱性缓冲液。
•电场中的作用力（碱性条件下） 电泳力：蛋白质由阴极向阳极移动。 电渗力：水分子向阴极移动。 若电泳力>电渗力, 向阳极移动(大多数Ag) 电渗力>电泳力, 向阴极移动（Ａb）。
• 对待检蛋白质样品定量测定的条件： 1、具有单价特异性抗血清 2、已知含量标准品（绘制标准曲线用） 3、待检含量>1.25ug/ml。（敏感度稍低）
• 单扩试验的应用范围： 常用于IgＧ、IgＡ、IgM、C3、C4等测定， 简易的抗原定量技术。
• 双环现象
抗原性相同、扩 散率不同的两个 组分：α重链病 人血清中的α重 链与正常IgA
抗体相遇，在界面处形 •临床意义：
成清晰的乳白色沉淀环。 鉴定血迹、
《免疫共沉淀》课件
机制。
研究疾病机制： 免疫共沉淀技术 可以用于研究疾 病机制，了解疾 病相关的蛋白质 相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、 离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作 台等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
实验设备：离心机、显微镜、电泳 仪等
实验人员：具备相关实验技能和操 作经验的人员
关键因素：抗体浓 度、孵育时间、洗 涤次数、复溶缓冲 液
注意事项：避免非 特异性结合、防止 蛋白降解、确保实 验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白 洗涤次数：一般需要洗涤3-5次 检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测 检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、 手套、口罩等 个人防护用品
实验过程中， 避免直接接触 实验材料，使 用一次性手套
和镊子
实验结束后， 及时清理实验 台面，避免污
染环境
实验过程中， 如出现异常情 况，立即停止 实验，并报告 实验室负责人
实验结束后， 对实验材料进 行妥善处理， 避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目 标蛋白选择特异性 抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白 目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设 实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用 实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常 见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。 注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。 注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。 在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗 脱条件以减少非特 异性结合
研究疾病机制： 免疫共沉淀技术 可以用于研究疾 病机制，了解疾 病相关的蛋白质 相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、 离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作 台等
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实验设备：离心机、显微镜、电泳 仪等
实验人员：具备相关实验技能和操 作经验的人员
关键因素：抗体浓 度、孵育时间、洗 涤次数、复溶缓冲 液
注意事项：避免非 特异性结合、防止 蛋白降解、确保实 验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白 洗涤次数：一般需要洗涤3-5次 检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测 检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、 手套、口罩等 个人防护用品
实验过程中， 避免直接接触 实验材料，使 用一次性手套
和镊子
实验结束后， 及时清理实验 台面，避免污
染环境
实验过程中， 如出现异常情 况，立即停止 实验，并报告 实验室负责人
实验结束后， 对实验材料进 行妥善处理， 避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目 标蛋白选择特异性 抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白 目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设 实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用 实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常 见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。 注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。 注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。 在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗 脱条件以减少非特 异性结合
沉淀反应(免疫学检验课件)
一、单向琼脂扩散试验 （平板法）
抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形 成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。
本法稳定、简便、无需仪器设备。重复性和线性 均可信，但灵敏度稍差、耗时长、影响因素多。
单向免疫扩散试验
二、双向琼脂扩散试验 （平板法）
将抗原抗体分别加在琼脂糖凝胶不同的对应孔 中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白 色沉淀线。沉淀线的位置、形状以及对比关系，可 进行定性分析，如抗原或抗体的存在与否、相对含 量估计、相对分子量分析和性质分析。
方法评价：简便快速，只能定性。
二、絮状沉淀试验
原理：抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质 存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状 沉淀。由此可作为最适比测定的基本方法。
技术要点：
抗原稀释法
抗体稀释法
方阵滴定法
方法评价：简单、不需特殊设备，敏感度较低， 受抗原抗体比例影响非常明显。常用于滴定抗原 抗体反应的最适比例。
沉淀反应
前言
• 沉淀反应（precipitation )
•
可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合，在适
当条件下而出现的沉淀现象。
•
沉淀反应分类
1.液相内沉淀试验 环状沉淀反应、絮状沉淀反应、 免疫比浊度分析。
2.凝胶内沉淀试验 单向琼脂扩散试验、双向琼脂 扩散试验。
3.凝胶免疫电泳技术 对流电泳技术、免疫电泳技 术、火箭电泳技术、免疫固定电泳技术。
三、免疫比浊度分析
根据抗原抗体在体内快速结合的原理
透射免疫比浊法
（turbidimetric immunoassay）
散射免疫比浊法
（nephelometry immunoassay）
免疫共沉淀ppt课件
3. 思索抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原， 过多那么就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂 太少那么不能溶解抗原，过多那么抗原被稀释。
Co-IP任务表示图
Co-immunoprecipitation
Y Y
binding
wash
elution
利用western blot 确定捕获蛋白
6. sds-page, western blotting或质谱仪分析。
实验本卷须知
〔1〕细胞裂解采用温暖的裂解条件，不能破坏细胞内存在的一切蛋 白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂〔np40或triton x-100)。 每种细胞的裂解条件是不一样的，经过阅历确定。不能用高浓度的变 性剂〔0.2 sds)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
优点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然形状；
2. 蛋白的相互作用是在自然形状下进展的， 可以防止人为的影响；
3. 可以分别得到天然形状的相互作用蛋白复 合物。
缺陷
1. 能够检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－ 蛋白质相互作用
2. 两种蛋白质的结合能够不是直接结合，而 能够有第三者在中间起桥梁作用；
3. 如用western blot检验，必需在实验前预 测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗 体，假设预测就是抗体的性质。抗体不同和抗原结 合才干也不同，免染能结合未必能用在IP反响。建议仔 细检查抗体的阐明书。特别是多抗的特异性是问题。
2. 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必需加蛋 白酶抑制剂，低温下进展实验。
经过质谱确定捕获的蛋白
实验步骤
1. 收获细胞，参与适量细胞裂解缓冲液〔含蛋白酶抑制剂〕， 冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°c， 最大转速离心30 min 后取上清；
Co-IP任务表示图
Co-immunoprecipitation
Y Y
binding
wash
elution
利用western blot 确定捕获蛋白
6. sds-page, western blotting或质谱仪分析。
实验本卷须知
〔1〕细胞裂解采用温暖的裂解条件，不能破坏细胞内存在的一切蛋 白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂〔np40或triton x-100)。 每种细胞的裂解条件是不一样的，经过阅历确定。不能用高浓度的变 性剂〔0.2 sds)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
优点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然形状；
2. 蛋白的相互作用是在自然形状下进展的， 可以防止人为的影响；
3. 可以分别得到天然形状的相互作用蛋白复 合物。
缺陷
1. 能够检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－ 蛋白质相互作用
2. 两种蛋白质的结合能够不是直接结合，而 能够有第三者在中间起桥梁作用；
3. 如用western blot检验，必需在实验前预 测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗 体，假设预测就是抗体的性质。抗体不同和抗原结 合才干也不同，免染能结合未必能用在IP反响。建议仔 细检查抗体的阐明书。特别是多抗的特异性是问题。
2. 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必需加蛋 白酶抑制剂，低温下进展实验。
经过质谱确定捕获的蛋白
实验步骤
1. 收获细胞，参与适量细胞裂解缓冲液〔含蛋白酶抑制剂〕， 冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°c， 最大转速离心30 min 后取上清；
《染色质免疫沉淀》课件
染色质免疫沉淀的操作相对复杂，需要合适 的抗体选择和前期的校验步骤，而且成本较 高。
结论
染色质免疫沉淀是一种重要的分子生物学实验技术，通过研究蛋白质与DNA 的相互作用，有助于我们深入了解基因表达调控和疾病相关基因的发现。
它可以帮助我们理解基因表达调控、染色质 结构和功能等重要生物学过程。
工作原理
1 抗体-抗原相互作用原理
染色质免疫沉淀利用抗体特异性地结合目标蛋白质，从而将其与DNA结合的蛋白质-DNA 复合物进行沉淀分离。2 抗体选 Nhomakorabea和特异性检测
选择合适的抗体非常重要，以确保免疫沉淀的特异性和准确性。
实验步骤
1
细胞取材和交联
首先，需要获取待研究的细胞样本，并使用交联剂将细胞DNA与蛋白质交联在一起。
2
细胞裂解和染色质片段化
接下来，将细胞裂解，使染色质得以释放，并通过酶切等方法将染色质分成小片段。
3
蛋白质-DNA复合物的免疫沉淀
然后，使用特定的抗体将目标蛋白质与DNA复合物免疫沉淀下来。
4
DNA析出和PCR扩增
《染色质免疫沉淀》PPT 课件
染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种重要的分子 生物学实验技术，用于研究基因表达调控和疾病相关基因的发现。
介绍
1 什么是染色质免疫沉淀？
染色质免疫沉淀是一种实验技术，用于研究 蛋白质与DNA之间的相互作用。
2 染色质免疫沉淀的作用是什么？
最后，通过去除蛋白质并进行DNA析出，可以获得与目标蛋白质相结合的DNA片段，并进行 进一步的PCR扩增等分析。
应用
1 用于研究基因表达调控、染色质结构和功能等
免疫共沉淀原理及注意事项ppt课件
（2 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以 避免人为的影响
（3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物
二 CO-IP特征
局限性
（1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用
（2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三 者在中间起桥梁作用；
（3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最 后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结 果。
用膜蛋白B）
未检测到目得蛋白或蛋白很少
可能原因
处理方法
❖ 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰 上操作并防止冻融
❖ 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓 度
❖ 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体
❖ 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保 存防止变质或干燥
标难曲线只对同
一块凝胶上的样品 的分子量测定才具 有可靠性。
WB结果分析
ECL 试剂 ++
一抗 一抗
二抗 (辣根酶标记的羊抗兔IgG) 一抗(兔抗Actin)
曝光后的蛋白条带
含有转印蛋白的PVDF膜
转印膜上蛋白检测示意图
X光片曝光显影
ECL
CO-IP与质谱分析流程
三 实验的关键
❖ 1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 ❖ 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制
三 实验流程
提取细胞总蛋白
↓
↓
离心，上清电泳(抗原抗体)
准备PA珠子，PBS洗3遍
↓
PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景)
（3 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物
二 CO-IP特征
局限性
（1 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用
（2 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三 者在中间起桥梁作用；
（3 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最 后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结 果。
用膜蛋白B）
未检测到目得蛋白或蛋白很少
可能原因
处理方法
❖ 1.样品被蛋白酶降解： 添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰 上操作并防止冻融
❖ 2.抗体浓度太低：调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓 度
❖ 3.抗抗体亲合力太低： 选用适合于IP和/或IB的相应抗体
❖ 4.IP抗体未与agarose珠子结合： 选用适合于IP的相应珠子，正确保 存防止变质或干燥
标难曲线只对同
一块凝胶上的样品 的分子量测定才具 有可靠性。
WB结果分析
ECL 试剂 ++
一抗 一抗
二抗 (辣根酶标记的羊抗兔IgG) 一抗(兔抗Actin)
曝光后的蛋白条带
含有转印蛋白的PVDF膜
转印膜上蛋白检测示意图
X光片曝光显影
ECL
CO-IP与质谱分析流程
三 实验的关键
❖ 1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 ❖ 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制
三 实验流程
提取细胞总蛋白
↓
↓
离心，上清电泳(抗原抗体)
准备PA珠子，PBS洗3遍
↓
PA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景)
免疫沉淀反应ppt课件(共11张PPT)
免疫电泳试验
第1页，共11页。
实验原理
免疫电泳是一种将区带电泳和双向免疫扩散 相结合的免疫化学分析技术。
第2页，共11页。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板上进 行电泳，使其中的各种成分因 电泳迁移率的不同而被分离成 肉眼不可见的区带。
停止电泳后，在与电泳方向平 行的槽内加入相应抗血清，使 抗原和抗体呈双向扩散，已分 离的各抗原与相应抗体在琼脂 中扩散而相遇，在二者比例合 适处形成肉眼可见的沉淀弧。
双扩散 取出电泳后的琼脂板，挑出中间槽内的琼脂，取 100μι兔抗人全血清充满槽内，注意勿外溢。将琼脂板 放于湿盒内，水平置于37℃水浴箱中进行双扩散，24h 后观察结果。
第8页，共11页。
实验结果
观察沉淀弧的位置和条数，并画出沉淀弧。
第9页，共11页。
本卷须知
抗原与抗体浓度比例应适当，否则会使某些成分不出现沉淀线。 当蛋白质抗原浓度高于20g/L，应用缓冲液稀释后再进行电泳 和扩散。
第3页，共11页。
实验原理
根 进 及据行其沉 比 性淀 较 质弧 ， 。的 可数 分量 析、 、位 鉴置 定和 样形 品状 中与 所已 含知的标抗准原抗成原分 停在先加一6加制打浇0当 双0打扩停在打6将观抗停 在6粗双先一一0抗打打6加6先555巴 巴巴 巴 巴止二将样般样板孔板蛋扩孔散止二孔琼察原止二略扩将般般原孔孔样将mmm比比 比比比ooo电 者 抗 稳 挖 时 白散 挖 过 电 者 挖 脂 沉 与 电者 分 散 抗 稳 稳 与 及 挖 抗用用将用lll妥妥 妥妥妥///泳比原定槽要质 槽程泳比槽板淀抗泳 比析原定定抗开槽原LLL微微洁取取微缓缓 缓缓缓ppp后例样端时求抗 时中后例时放弧体后 例纯样端端体槽时样量量净出出量HHH冲冲 冲冲冲，合品电要厚原 要需，合要于的浓， 合化品电电浓，要品888进进玻电电进液液 液液液...在适在压求度浓 求要在适求湿位度在 适抗在压压度挑求在样样片泳泳样为为 为为为与处琼外均度 外在与处外盒置比与 处原琼比去外琼111器器置后后器电电 电电电000电形脂壁匀高 壁不电形壁内和例电 形或脂例孔壁脂000吸吸于的的吸泳泳 泳泳泳VVV泳成平整，于 整同泳成整，条应泳 成抗平应内整平取取水琼琼取， ， ，缓 缓缓 缓 缓方肉板齐无齐时方肉齐水数适方肉体板适的齐板2平脂脂111电电电0冲冲 冲冲冲000向眼上，气，间向眼，平，当向 眼的上当琼，上g台板板泳泳泳μμμ液液 液液液/Llll平可进防泡防进平可防置并，平 可纯进，脂防进稀稀稀面，，111，，， ，，，hhh行见行止。止行行见止于画否行 见度行否，止行释释释上挑挑，，，应将将 将将将的的电琼琼结的的琼出则的 的。电则槽琼电3的的的，出出即即即用加加 加加加7槽沉泳脂脂果槽沉脂沉会槽 沉泳会内脂泳℃正正正用中中可可可缓样样 样样样内淀，破破观内淀破淀使内 淀，使琼破，水常常常移间间终终终冲后后 后后后加弧使裂裂察加弧裂弧某加 弧使某脂裂使浴人人人液槽槽止止止液的的 的的的入。其。。，入。。。些入 。其些暂。其箱全全全管内内电电电稀琼琼 琼琼琼相中做相成相 中成不中中血血血吸的的泳泳泳释脂脂 脂脂脂应的好应分应 的分挑的进清清清取琼琼。 。 。后板板 板板板抗各记抗不抗 各不出各行于于于脂脂4再置置 置置置-血种录血出血 种出。种双4小小小，，进于于 于于于.清成。清现清 成现成扩孔孔孔取取行电电 电电电，分，沉， 分沉分散中中中11电泳泳 泳泳泳00使因使淀使 因淀因，。。。00泳槽槽 槽槽槽μμ抗电抗线抗 电线电2和ιι上上 上上上4兔兔原泳原。原 泳。泳h扩，， ，，，抗抗后和迁和和 迁迁散样样 样样样人人观抗移抗抗 移移。品品 品品品全全察体率体体 率率孔孔 孔孔孔血血结呈的呈呈 的的靠靠 靠靠靠清清果双不双双 不不近近 近近近充充。向同向向 同同阴阴 阴阴阴满满扩而扩扩 而而极极 极极极槽槽散被散散 被被端端 端端端内内，分，， 分分，， ，，，，，已离已已 离离用用 用用用注注分成分分 成成缓缓 缓缓缓意意离肉离离 肉肉冲冲 冲冲冲勿勿的眼的的 眼眼液液 液液液外外各不各各 不不浸 浸浸 浸 浸溢溢抗 可 抗 抗可 可湿湿 湿湿湿。。原见原原 见见的的 的的的与的与与 的的双双 双双双相区相相 区区层层 层层层应带应应 带带纱纱 纱纱纱抗。抗抗 。。布布 布布布体体体搭搭 搭搭搭在在在桥桥 桥桥桥琼琼琼电电 电电电脂脂脂泳泳 泳泳泳中中中。。 。。。扩扩扩散散散而而而相相相遇遇遇，，，
第1页，共11页。
实验原理
免疫电泳是一种将区带电泳和双向免疫扩散 相结合的免疫化学分析技术。
第2页，共11页。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板上进 行电泳，使其中的各种成分因 电泳迁移率的不同而被分离成 肉眼不可见的区带。
停止电泳后，在与电泳方向平 行的槽内加入相应抗血清，使 抗原和抗体呈双向扩散，已分 离的各抗原与相应抗体在琼脂 中扩散而相遇，在二者比例合 适处形成肉眼可见的沉淀弧。
双扩散 取出电泳后的琼脂板，挑出中间槽内的琼脂，取 100μι兔抗人全血清充满槽内，注意勿外溢。将琼脂板 放于湿盒内，水平置于37℃水浴箱中进行双扩散，24h 后观察结果。
第8页，共11页。
实验结果
观察沉淀弧的位置和条数，并画出沉淀弧。
第9页，共11页。
本卷须知
抗原与抗体浓度比例应适当，否则会使某些成分不出现沉淀线。 当蛋白质抗原浓度高于20g/L，应用缓冲液稀释后再进行电泳 和扩散。
第3页，共11页。
实验原理
根 进 及据行其沉 比 性淀 较 质弧 ， 。的 可数 分量 析、 、位 鉴置 定和 样形 品状 中与 所已 含知的标抗准原抗成原分 停在先加一6加制打浇0当 双0打扩停在打6将观抗停 在6粗双先一一0抗打打6加6先555巴 巴巴 巴 巴止二将样般样板孔板蛋扩孔散止二孔琼察原止二略扩将般般原孔孔样将mmm比比 比比比ooo电 者 抗 稳 挖 时 白散 挖 过 电 者 挖 脂 沉 与 电者 分 散 抗 稳 稳 与 及 挖 抗用用将用lll妥妥 妥妥妥///泳比原定槽要质 槽程泳比槽板淀抗泳 比析原定定抗开槽原LLL微微洁取取微缓缓 缓缓缓ppp后例样端时求抗 时中后例时放弧体后 例纯样端端体槽时样量量净出出量HHH冲冲 冲冲冲，合品电要厚原 要需，合要于的浓， 合化品电电浓，要品888进进玻电电进液液 液液液...在适在压求度浓 求要在适求湿位度在 适抗在压压度挑求在样样片泳泳样为为 为为为与处琼外均度 外在与处外盒置比与 处原琼比去外琼111器器置后后器电电 电电电000电形脂壁匀高 壁不电形壁内和例电 形或脂例孔壁脂000吸吸于的的吸泳泳 泳泳泳VVV泳成平整，于 整同泳成整，条应泳 成抗平应内整平取取水琼琼取， ， ，缓 缓缓 缓 缓方肉板齐无齐时方肉齐水数适方肉体板适的齐板2平脂脂111电电电0冲冲 冲冲冲000向眼上，气，间向眼，平，当向 眼的上当琼，上g台板板泳泳泳μμμ液液 液液液/Llll平可进防泡防进平可防置并，平 可纯进，脂防进稀稀稀面，，111，，， ，，，hhh行见行止。止行行见止于画否行 见度行否，止行释释释上挑挑，，，应将将 将将将的的电琼琼结的的琼出则的 的。电则槽琼电3的的的，出出即即即用加加 加加加7槽沉泳脂脂果槽沉脂沉会槽 沉泳会内脂泳℃正正正用中中可可可缓样样 样样样内淀，破破观内淀破淀使内 淀，使琼破，水常常常移间间终终终冲后后 后后后加弧使裂裂察加弧裂弧某加 弧使某脂裂使浴人人人液槽槽止止止液的的 的的的入。其。。，入。。。些入 。其些暂。其箱全全全管内内电电电稀琼琼 琼琼琼相中做相成相 中成不中中血血血吸的的泳泳泳释脂脂 脂脂脂应的好应分应 的分挑的进清清清取琼琼。 。 。后板板 板板板抗各记抗不抗 各不出各行于于于脂脂4再置置 置置置-血种录血出血 种出。种双4小小小，，进于于 于于于.清成。清现清 成现成扩孔孔孔取取行电电 电电电，分，沉， 分沉分散中中中11电泳泳 泳泳泳00使因使淀使 因淀因，。。。00泳槽槽 槽槽槽μμ抗电抗线抗 电线电2和ιι上上 上上上4兔兔原泳原。原 泳。泳h扩，， ，，，抗抗后和迁和和 迁迁散样样 样样样人人观抗移抗抗 移移。品品 品品品全全察体率体体 率率孔孔 孔孔孔血血结呈的呈呈 的的靠靠 靠靠靠清清果双不双双 不不近近 近近近充充。向同向向 同同阴阴 阴阴阴满满扩而扩扩 而而极极 极极极槽槽散被散散 被被端端 端端端内内，分，， 分分，， ，，，，，已离已已 离离用用 用用用注注分成分分 成成缓缓 缓缓缓意意离肉离离 肉肉冲冲 冲冲冲勿勿的眼的的 眼眼液液 液液液外外各不各各 不不浸 浸浸 浸 浸溢溢抗 可 抗 抗可 可湿湿 湿湿湿。。原见原原 见见的的 的的的与的与与 的的双双 双双双相区相相 区区层层 层层层应带应应 带带纱纱 纱纱纱抗。抗抗 。。布布 布布布体体体搭搭 搭搭搭在在在桥桥 桥桥桥琼琼琼电电 电电电脂脂脂泳泳 泳泳泳中中中。。 。。。扩扩扩散散散而而而相相相遇遇遇，，，
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I
检测器A
I0
θ
当复合物＜3×106dal，
I≈Iθ;θ＜90°，散射光的
量代表IC的量。
Iθ 检测器B
散射比浊试验
补充：免疫浊度测定影响因素
（1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量 （2）抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
强，并使用R型抗体 （3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5 （4）增浊剂
反应介质：凝胶 凝胶的特点： 1、固相的液体 2、多孔的网状结构 3、Ag-Ab复合物网络在凝胶
中
一、单向免疫扩散试验
定量试验
原理：抗体与待测的抗 原,在两者比例合适的 部位结合形成沉淀环。 环的大小与抗原的浓 度成正相关。
技术要点：
1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散 5.绘制标准曲线
一、单向免疫扩散试验
二、双向免疫扩散试验
技术要点： 1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散
二、双向免疫扩散试验
1.判断抗原或抗体的存在 2.分析抗原或抗体相
以及估计相对含量
对分子量
二、双向免疫扩散试验
3.分析抗原的性质
二、双向免疫扩散试验
4.滴定抗体的效价 5.鉴定抗原或抗体 纯度
应用
1.AFP检测的最早方法
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合，快速但不可见 免疫复合物。
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定
免疫扩散试验 免疫电泳技术
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
• 仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清 • 已知含量的标准品 • 待测品含量在1.25g/ml以上
一、单向免疫扩散试验
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病理血清
应用
IgG、IgA、IgM、C3、C4、 转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白
等多种血浆蛋白的检测
伪浊度形成的原因
1.抗血清中有非特异性的交叉反应性杂 抗体成分
2.增浊剂浓度和反应时间掌握不当 3.样品本身的浊度处理不当 4.试剂污染变质 5.比色杯不够清洁
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中 扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体 相遇并且浓度比例适当的位置形成 肉眼可见的沉淀线或沉淀环。
电场的作用下带电颗粒向着其电性相 反的电极移动，称为电泳。
电泳迁移率：
定义：同一电场条件下，各种带电粒子在 单位时间内移动的距离。M=cm2/VS
影响泳动的速度的因素: 本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度 溶液pH值 溶液离子强度 电渗
电渗： 电场中液体相对于固体的运动
①载体的性质 ②缓冲液的离子强度 ③电泳时的电压
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀 环
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16-24h；T2为24-48h；T3为48h 以上,可见T3为直线，T1为反抛物线
t1 为 16-24h ； t2 为 24-48h ； t3 为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛 物线
待检蛋白质抗原须具备的条件
电渗方向与样品运动方向一致： 样品迁移率加快
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退
电泳载体： 琼脂 琼脂糖凝胶
2.血清中含量较高的酶类、细 菌病毒感染后血清中产生的抗 体的检测
三、免疫电泳技术
三、免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点：
1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。
3.增加了分辨率。
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
•电泳（electrophoresis） ：在外加
（1）抗原抗体的比例
海德堡曲线
在抗体过量的反应体系中,抗原量的递 增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合 适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的 免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个 抛物曲线。
（2）抗体的质量
•抗体的特异性 •抗体的效价(>1:20) •抗体的亲和力 •R型和H型抗体（R型）
（3）抗原抗体反应的环境 最适PH为：6.5-8.5 离子强度大，IC形成快 离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液 （4）增浊剂 PEG(6000—8000) 浓度4%吐温-20
优 点：
• 稳定性好、简便快速，易于自动化 • 敏感度高 • 精确度高 • 无放射性核素污染
分 类：
1.根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法 终点比浊法 2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
透射比浊试验和散射比浊试验光路
IC
透射比浊试验
各管抗原倍比稀释
Ag
加入抗血清
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体
稀释度
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640
对照
第二节 液体免疫沉淀试验
第二节 液体免疫沉淀试验
一、絮状免疫沉淀试验 絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应 抗体混合，在电解质存在的条件下， 抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状 沉淀物。
一、絮状免疫沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
絮 状 沉 淀 示意图
免疫沉淀试验课件
教学目的
• 掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验
原理
• 熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、
沉淀反应的应用
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉 淀现象。
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二、免疫浊度测定
原理： 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，
二者比例合适时，在增浊剂中它们 快速形成一定大小的抗原抗体复合 物，使反应液体出现浊度。