鲎试剂

鲎试剂
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• 鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含 有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够 准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和(1,3)-β-葡聚糖. • 普通鲎试剂 灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素限量的样品。 高灵敏度鲎试剂 灵敏度0.06～0.015 EU/ml，适用于内毒素限量较低的样品 细菌内毒素检查。 特异性鲎试剂 灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂 产生干扰的样品。 定量法鲎试剂 最低检测限0.03～0.005 EU/ml，适用于需要对内毒素进行定 量测定的样品。
光度测定法：检査法
• 结果判断:若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍 数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。 若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规 定。 • 本检査法中，“管” 的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中 的孔。
单位
• IU=International Unit 称为”国际单位”是经由国际协商规定出的 标准单位。是表示效价、活性的一种单位，多用来做维生素、内 毒素、抗生素、激素等的单位。 • EU=Endotoxin Unit 称为“内毒素单位”是将标准鲎试剂的最低促 凝胶活性值定为内毒素单位1Eu。是专指内毒素的活性单位。 • 以重量单位(ng)表示内毒素是不科学的，因为相同重量的内毒素， 对于菌种来源不同，其生物活性也不同（相差很大），就像相同 重量的不同种类燃料产生的热量也不同。 • 1IU=1EU
凝胶法:凝胶限度试验
• 按表制备溶液A 、B、C 和D。使用稀释倍数不超过M V D并且已经 排除干扰的供试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试 验项下操作。 • 结果判断：保温6 0分钟± 2 分钟后观察结果。若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照 溶液B 的平行管均为阳性，阳性对照溶液C 的平行管均为阳性， 试验有效。
动态浊度法: 检测反应混合物的浊度到达某一预先设 定的吸光度所需要的反应时间，或是检 测浊度增加速度的方法。
光度测定法：显色基质法
• 利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出 的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。 终点显色法：依据反应混合物中内毒素浓度 和其在孵育终止时释放出的有色团 的量之间存在着量化关系来测定内毒 素含量的方法。 动态显色法：是检测反应混合物的色度到达某 一预先设定的吸光度所需要的反应时 间，或是检测色度增长速度的方法。
光度测定法：检査法
• 按“光度测定法的干扰试验” 中的操作步骤进行检测。 • 使用系列溶液C 生成的标准曲线来计算溶液A 的每一个平行管的 内毒素浓度。 • 试验必须符合以下三个条件方为有效： (1 )系列溶液C 的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求； (2 )用溶液B 中的内毒素浓度减去溶液A 中的内毒素浓度后，计算 出的内毒素的回收率要在50%〜200%的范围内； (3) 阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大 于标准曲线最低点的反应时间。
内毒素限值：
• 内毒素限值的建立 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般 按以下公式确定：L=K/M
• 式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； • K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg· h)表示，注射剂K=5E U/(kg· h)， 放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg· h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg· h)。
凝胶法:凝胶半定量试验
光度测定法
浊度法
• 光度测定法
显色基质法
• 光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般37C±1X： • 供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间 等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
光度测定法：浊度法
• 利用检测鲎试剂与内毒素反应过程过程中的浊度变化而测定内毒 素含量的方法。 终点浊度法：依据反映混合物中的内毒素浓度和其在 孵育终止时的浊度（吸光度和透光率） 之间存在着量化关系来测定内毒素含量 的方法
凝胶法:凝胶半定量试验
• 本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中 内毒素的含量。按表3 制备溶液A 、B、C 和D。按鲎 试剂灵敏度复核试验项下操作。 结果判断：若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供 试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，系列溶 液C的反应终点浓度的几何平均值在0 .5〜2ƛ， 试验有效。系列溶液A 中每一系列的终点稀释倍 数乘以ƛ，为每个系列的反应终点浓度。如果检 验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试 品进行半定量试验的初始稀释倍数，即得到 每一系列内毒素浓度c。
• M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg· h)、mg (kg· h)或U/ (kg· h)表示，人均体重按 60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
最大有效稀释倍数（MVD）
• 最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数数 （1 —MVD)，在不超过此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。 •MVD=cL/ƛ
鲎试剂法
• 鲎试剂法是基于内毒素激活的一系列酶促反应，因此其专一性强 且 灵敏高. 它克服了家兔法由于个体差异而造成的假阳性现象. • 但是，由于是酶促反应对酶促反应有影响的因素对鲎试剂法的反应 结果会有影响，如反应温度过高或反应时间过长都有可能产生假阳 或假阴的实验结果。 • 采用动态法进行检测,需要特定的仪器及温控条件，干扰大,检测结果 不稳定。 • 热原主要是吸附在一些器壁上。平常实验只有不用有热原的接触到 试剂或者水就不会污染的. • 在无菌环境操作也不能保证周围无热原。内毒素只有当细菌死亡溶 解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来. • 空气中热原是会有的，但是是极微量的.
凝胶法:对鲎试剂灵敏度复核
凝胶法:对鲎试剂灵敏度复核
凝胶法:干扰实验
• 只有当溶液A 和阴性对照溶液D 的 所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C 的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要 求时，试验方为有效。当系列溶液B 的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要 求时，认为供试品在该浓度下无干扰 作用。其他情况则认为供试品在该浓 度下存在干扰作用。若供试品溶液在 小于M V D的稀释倍数下对试验有干扰， 应将供试品溶液进行不超过M V D 的进 一步稀释，再重复干扰试验。
凝胶法:凝胶限度试验
• 若溶液A 的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若溶液A 的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A 的两 个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时 溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符 合规定，否则判定供试品不符合规定。 • 若供试品的稀释倍数小于M V D而溶液A 出现不符合规定时，需将供试品稀释至 M V D 重新实验，再对结果进行判断。
光度测定法：干扰实验
• 干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为ƛm) ， 作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4 制备溶液A 、B、C 和D。 • 按所得线性回归方程分别计算出供试 品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的 内毒素含量Ct 和Cs，再按下式计算该 试验条件下的回收率(R） R = (Ca-Ct )/ƛmX100% • 当内毒素的回收率在50%〜200% ，则认 为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰 作用。
光度测定法：标准曲线的可靠性试
• 为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及 供试品溶液的干扰试验。
• 当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时， 需进行标准曲线。 • 用标准内毒素制成溶液，制成至少3 个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数 不得大于10) ，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤 的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3 支平行管。同时要求做2 支阴性对 照，当阴性对照的吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时 间大于标准曲线最低点的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。 • 根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r ) 的绝对值应大于或等于0.980， 试验方为有效。否则须重新试验。
凝胶法:干扰实验
• 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过 滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方 法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加 了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。 • 当进行新药的内毒素检査试验前，或无内毒素检查项的品种建立 内毒素检查法时，须进行干扰试验。 • 当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任 何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
• 式中L为供试品的细菌内毒素限值； • C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示 时，C的单位需为mg/ml或U /ml。
• 如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效浓度C=ƛ / L。 • ƛ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上 最低的内毒素浓度。
鲎试剂法
• 利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判 断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
鲎试剂按实验方法可分
• 凝胶法（定性或半定量测定） • 光度测定法：浊度法
显色基质法
实验原理图
凝胶法
• 通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素 的方法。 • 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓 度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。 • 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果 的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。