第四章-细胞破碎

甘露糖酶、
糖苷酶、
肽键内切酶、
壳多糖酶等
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外加酶法
有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加 入时需确定相应的次序。
对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作 用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入 葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生 质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破 裂，释出胞内产物。
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概述
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破 坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产 物成分释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌 型生化物质（产品）的基础。
为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了 解各种微生物细胞壁的组成和结构。
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1 细胞壁结构
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。
使细胞具有一定的形状和强 度。
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细菌细胞壁结构
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在 的肽键的数量和其交联的程度。
革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大 不同。
革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细 胞生产了很多细胞重组的产物。
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酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法， 但是也都有各自的缺点。
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1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)
酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细
胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破
坏细胞膜。
溶菌酶、
1）外加酶法
β-1，3-葡聚糖酶、
β-1，6-葡聚糖酶、
常用的溶酶 蛋白酶、
第四章 细胞破碎
1
概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行 破碎。
2
概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是 在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
主要 肽聚糖(40组成 90%)
多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)
革兰氏 阴性细菌
酵母菌
霉 真菌
10-13 nm
100-300nm
100250nm
多层
多层
多层
肽聚糖 (5-10%) 葡聚糖(30-
多聚糖
脂蛋白
40%)
(80-90%)
脂多糖(11-
甘露聚糖(30%) 脂类
22%)
蛋白质(6-8%) 蛋白质
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真菌的细胞壁
真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次 还含有较少量的蛋白质和脂类。
不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同， 其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚 糖构成，少数含纤维素。
与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的 强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此， 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。
温和 温和 适中 剧烈
ห้องสมุดไป่ตู้
昂贵 适中 便宜 便宜
血红细胞的破 坏
胆盐作用于大 肠杆菌 甲苯破碎酵母 细胞
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表 4.0-1. 细胞机械破碎法
方法
技术
原理
效果 成本
举例
机械法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中
研磨法
细胞被研磨物磨碎 适中 便宜
动物组织及动 物细胞
超声波法 匀浆法（孔型） 珠磨破碎法
通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。
不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。
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细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链；
相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围；
药物名称 胰岛素 人生长激素 α-干扰素
宿主 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌
用途 治疗糖尿病 治疗侏儒病
治疗毛状细胞白血病等
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酵母细胞壁的结构示意图
最里层是由葡聚糖的细纤维 组成，它构成了细胞壁的刚 性骨架，使细胞具有一定的 形状，
上面的是一层糖蛋白， 最外层是甘露聚糖，由1,6-
磷酸二酯键连接成网状。在 该层的内部，有甘露聚糖-酶 的复合物。 破碎酵母细胞壁的阻力主要 决定于壁结构交联的紧密程 度和它的厚度。
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红面包霉菌细胞壁具有同心圆层 状结构主要存在三种聚合物
最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混 合物，
第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
红面包霉菌细胞壁的结构示意图 10
细胞壁的组成和结构
微生 物
壁厚
革兰氏 阳性细菌
20-80 nm
层次
单层
因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性， 使植物细胞具有很高的机械强度。
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细胞破碎方法
表 4.1-1. 细胞化学破碎法
方法
技术
原理
效果 成本
举例
化学法
渗透冲击 酶消化法 增溶法 脂溶法 碱处理法
渗透压破坏细胞
温和 便宜
细胞壁被消化，使 细胞破碎
表面活性剂溶解细 胞壁
有机溶剂溶解细胞 壁并使之失稳
碱的皂化作用使细 胞壁融解
它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来 自于微纤丝。
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植物次生细胞壁
某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生 细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚 (4μm以上)，常有三层组成。 n 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增 加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则， 而且存在木质素的沉积。
磷脂
脂类(8.5-
蛋白质
13.5%)
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植物细胞壁的结构
对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生 壁两部分。
初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～ 3μm），富有弹性。
由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半 纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许 多这样的长链形成微纤丝。
用超声波的空穴作 适中 用使细胞破碎
须使细胞通过的小 剧烈 孔，使细胞受到剪 切力而破碎
细胞被玻璃珠或铁 剧烈 珠捣碎
昂贵 适中 便宜
细胞悬浮液小 规模处理
细胞悬浮液大 规模处理
细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理
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※ 2 CHEMICAL METHODS 化学方法
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n 表4.1-1介绍了主要的几种化学方法，有渗透冲击法， 表面活性剂增溶法、脂溶法。首先简单的介绍一下酶 消化法和碱处理法。