核酸检测技术在血液筛查中的应用及分析

核酸检测技术在血液筛查中的应用及分析

发表时间：2016-06-23T11:09:03.740Z 来源：《航空军医》2016年第7期作者：易玲[导读] 由于通过血液可以传播乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病和梅毒等多种严重的传染病。

湖南省岳阳市中心血站 414000 【摘要】由于通过血液可以传播乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病和梅毒等多种严重的传染病。为了保障临床用血的安全，血液制品的质量，防止供受者血液及血液制品之间的交叉感染和采血及血液制品工作者的健康，必须防止上述疾病的感染者再次进入供血队伍，防止上述疾病病原体阳性血及成分血直接输注于病人或用于血液制品生产。为此必须用当前质量最好、最可靠的诊断试剂筛查供血员及其血样。血清学酶联免疫吸附法（ELISA）检测技术作为国家规定的血液筛查标准方法，但ELISA技术本身的固有缺陷却成为进一步提高临床用血安全的障碍，主要由病毒感染者存在较长的“窗口期”导致。而采用核酸检测技术（NAT）能够提高血液筛查的效率。本文就近年来国内外NAT在血液筛查中的应用情况进行总结分析。【关键词】核酸检测技术；血液；筛查；应用引言：核酸检测和技术能够直击艾滋病病毒的RNA结构，检测血液中是否存在病毒核酸，诊断有无病原体感染。采用PCR技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂和自行研究开发设计的复合引物，覆盖常见的HIV毒株，具有很高的灵敏度。使用二次扩增的套式PCR 扩增方法，提高检测的特异性，降低假阳性的概率。核酸检测将艾滋病病毒的检测窗口期缩短至11天，并且核酸检测这项技术目前可将乙肝、丙肝病毒的检测“窗口期”分别由原来的50天、72天缩短到25天、59天。下文针对核酸检测技术在血液筛查中的应用和检测原理进行分析，并进行探讨。

一、NAT用于血液筛查的意义及检测原理

输血相关传染病的预防和控制是采供血机构的永恒主题。根据我国现行法律法规要求，采供血机构对临床供血检测模式为：用两种不同厂家的ELI-SA检测试剂筛查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV及梅毒螺旋体抗体（抗-TP）。这种筛查模式有效降低了输血传染疾病的风险，特别是第三代酶免试剂的启用，而艾滋病检测已使用可同时检测P24抗原的第四代试剂盒。但由于ELISA检测的是抗原或抗体，“窗口期”、病毒变异以及低水平携带者等漏检问题相对突出。血清学检测HBsAg、抗-HCV和抗-HIV阴性不能排除HBV、HCV和HIV感染。研究报道表明，ELISA检测合格的献血者中，HCV-RNA阳性比率为0.01％～0.19％，HBV-DNA阳性比率为0.4％～0.92％；在HBV暴露率70％～90％的地区，献血者中有7％～19％为HBsAg阴性HBV感染者，而HBsAg阴性的HBV-DNA阳性血中有18％可导致输血后乙肝感染。 PCR技术原理为：按照模板DNA序列，在DNA聚合酶的催化下，用4种dNTP来合成与模板DNA完全相同的拷贝，从而在多种DNA分子混合物中特异扩增某一特定的DNA片段。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线，当荧光信号出现由本底进入指数增长阶段的拐点即达到荧光域值即为阳性，反之为阴。 TMA则是一种转录扩增的过程。它使用Money鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶和T7RNA多聚酶两种酶，在等温条件酶催化下复制出上亿的RNA序列拷贝。它包括3个主要步骤：首先是目标捕获，用洗涤剂破坏病毒包膜或衣壳，使RNA或DNA释放，从而捕获寡核苷酸结合于病毒核酸（至少2个保守区域）和内标分子（IC）上，然后结合于磁性微粒的互补序列。第二步为扩增，使用MMLV逆转录酶和T7RNA 聚合酶。逆转录酶用于产生一个具有目标序列的DNA拷贝（含有T7RNA聚合酶的一个启动子序列），然后以DNA拷贝为模板，通过T7RNA聚合酶催化生成多个RNA扩增子的拷贝。第三步检测，即利用标记有化学发光分子的检测探针。在探针试剂中有两种不同的吖啶酯（AE）分子，一种是标记在内标特异性探针的闪光发光分子Ortho-flroro-AE；另一种是标记在病毒特异性探针的辉光发光分子1-methyl-AE。

二、NAT血液筛查面临的问题及发展方向

目前血液筛查核酸试剂已完全商品化，其操作趋向于简便和自动化，其检出率因检测年份不同而有明显差异也说明了核酸检测试剂的质量亦在不断提高，因此选用合适的检测系统与检测模式成为血液NAT筛查应首先考虑的问题。

针对血液NAT检测成本昂贵，有人提出血液病毒筛查采用一遍ELISA结合一遍核酸检测的模式，但需要对现有的ELISA试剂灵敏度提出更高的要求，有待进一步验证；另外实施血液集中化检测有利于降低NAT检测对基础设施、检测环境、人员培训的投入以及检测费用高的要求。目前，有些国家或地区已实行集中化检测，可以充分利用资源，提高检测质量和检测效率，提高成本效益。随着近年来物流管理提高与网络技术的发展，我国实施血液集中化检测的基础条件正在改善，集中化检测模式有待通过逐步试行后加以推广。

结语：综上所述，检测灵敏度的设计需要与地方的发展情况相结合，而且对早期感染病毒的复制速度、发生几率以及成本进行充分的考虑。以现代社会中存在的比对研究而言，血液病毒筛选的血清学方法与核酸检测方法的结果是互补的，因此，应该结合两种方法一同使用，进而建立适合我国国情的血液传染病指标筛查的新模式，进而提高血液的安全性。新方法、新技术的应用要考虑检测成本、试剂与仪器设备的配套、人员技术的培训以及对现行法律修订的跟进等。但随着NAT筛查试剂质量的提高和成本的下降，以及我国血液筛查模式的转变、管理水平的提高和经费的落实，我们坚信，血液NAT筛查在我国将有着广阔的前景。参考文献：

[1]何亚琴，张建伟，杨爱龙，等．核酸检测技术在常州地区献血筛查中的应用［J］．中国输血杂志，2011，24（7）：560-562．

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[3]叶贤林，王良华，周一炎，等．全自动血液核酸筛查及阳性献血员追踪的研究［J］．中华检验医学杂志，2015，28（10）：1072－1074．