有机荧光染料金属配合物金属离子纳米粒子

纳米粒子
• 某些纳米粒子也可做为核酸检测的荧光探针
• 与传统的有机染料荧光探针相比，半导体纳 米晶体探针的光强度高20倍，荧光寿命长， 光稳定性高100倍，谱线宽度只是有机染料 谱线宽度的1/3，因此大大提高了分析的灵 敏度和选择性。
金属离子
• 主要是基于某些稀土离子本身的发光特性 稀土离子的共振带正好与核酸受紫外光激 发时的三线态相重叠，能有效地发生从有 机配体到中心离子之间的能量转移。 • 该法具有光谱线宽窄、发光寿命长和能发 射特征荧光且与生物分子有很大亲和力等 特点。
核酸的荧光探针
吴思辉
03081020
基本原理
• 核酸本身在室温下有较弱的内源荧光，但荧 光量子产率低，不能直接测量，可用一些荧 光小分子物质作为生物探针，与核酸作用后 导致荧光强度的增强或减弱来进行测定。
常用的探针物质
• • • • 有机荧光染料 金属配合物 金属离子 纳米粒子
有机荧光染料
• 主要是基于嵌入核酸碱基对中，发生共振 能量转移而导致荧光强度的增强或减弱来 进行测定。 • 能量转移的形式是单重态－单重态转移， 由一个发荧光的给体将能量传给一受体， 这个受体可发射自己的特征荧光（荧光增 强），也可不发荧光（荧光猝灭）。
• 另外，有人将碱基衍生化，应用薄层色谱进 行分离。应用色谱法分辨率较高，但所需时 间长，一般需数小时，而且需制备特殊的柱 子。
• 近年来发现稀土离子Tb3+与核酸结合后，其 荧光强度可以增加数千倍以上，并且这种作 用是专一的，核酸中仅GMP可以明显地增强 荧光，但此法若仅用Tb3+灵敏度又不太高。
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e.g.
FOR EXAMPLE
• GMP在生物体内具有重要的生理功能。
• 研究表明，致癌物优先结合到核酸中鸟嘌 呤形成加合物。因而测定GMP具有重要的 意义。
• 常用的荧光方法是基于GMP和苯甲基乙二醛 在一定条件下反应进行测定。这种方法的选 择性较高，但必须在60℃下反应30分钟，在 如此高的温度下会影响生物样品的活性及荧 光强度的稳定性。
• 后来发现的稀土共发光效应就很好地解决了 这个问题。 例如பைடு நூலகம்d3+加入Tb-GMP体系明显地增强了该 体系的荧光强度。
• 实验表明，GMP的测量线性范围达到3x10-8 -3x10-5mol/L，比Tb-GMP体系宽一个数量级 • 此外，它的检测限达到3.9x I0-9 mol/l ，比后 者低一个数量级。 ???机理呢??? • Gd3+对Tb3+的荧光增强作用主要来自分子内 的能量传递，而由于络合物形成网状的结构， 因而更有利于它们之间的能量转移。
金属配合物
• 主要是基于配合物立体结构的发光性质，多 是过渡金属元素配合物。
• 测定中离子强度过高会影响DNA的构象，使 DNA表面的阴离子被屏蔽，降低核酸分子竞 争阳离子的能力。酸度过低会使核酸中磷酸 根质子化，而过高则会出现金属的难溶物。 另外有时蛋白质的存在会严重干扰测量，须 预先去除再进行测定。