知识点5核酸的性质
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4.5核酸的性质
核酸的性质
一、解离性质
多聚核苷酸有两类可解离的基团:磷酸和碱基能发生两性解离。
磷酸是中等强度的酸,碱基的碱性较弱,因此,核酸等电点在较低的pH范围内。
DNA等电点4—4.5
RNA 等电点2—2.5
RNA链中,核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链,促进磷酸酯羟基氢原子的解离。
二、水解性质
1、碱水解
室温,0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解,得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。
在相同条件下,DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在,促进了磷酸酯键的水解。DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。
DNA稳定,遗传信息。
RNA是DNA的信使,完成任务后降解。
2、酶水解
生物体内存在多种核酸水解酶
RNA水解酶RNase
DNA水解酶DNase
核酸外一切酶
核酸内切酶最重要的:限制性核酸内切酶
三、光吸收性
碱基具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收,λmax=260nm
1、鉴定纯度
纯DNA的A260/A280应为1.8(1.65-1.85),若大于1.8,表示污染了RNA。
纯RNA的A260/A280应为2.0。
若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则A260/A280比值明显降低。
2、含量计算
1 ABS值相当于:50ug/mL双螺旋DNA
或:40ug/mL单螺旋DNA(或RNA)
或:20ug/mL核苷酸
3、增色效应与减色效应
增色效应:在DNA的变性过程中,摩尔吸光系数增大
减色效应:在DNA的复性过程中,摩尔吸光系数减小。
四、沉降特性(DNA)
不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),起密度和沉降速率不同,用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来,这一方法常用于质粒DNA的纯化。
相对沉降常数
线型双螺旋分子 1.00
松驰双链闭环 1.14
切刻双链环 1.14
单链环 1.14
线型单链 1.30
正超或负超螺旋双链环状 1.41
坍缩 3.0
五、变性、复性及杂交
变性、复性是核酸的重要的物化性质,相对蛋白质来说,核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。
1、变性
(1)变性:
核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链,不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。
DNA的变性是爆发式的,变性作用发生在一个很窄的温度范围内。
热变性
因素酸碱变性(pH小于4或大于11,碱基间氢键全部断裂)
变性剂(尿素、盐酸胍、甲醛)
变性后:粘度降低、浮力密度升高、260nm光吸收值增加、二级结构改变,部分失活
(2)熔解温度(Tm)或称熔点:
DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在70—85℃之间。
浓度50ug/mL时,双链DNA A260=1.00,完全变性(单链)A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时,即1.185时,对应的温度即为Tm。
(3)影响DNA的Tm值的因素
①DNA均一性均一性高,熔解过程发生在很小的温度范围内。
②G-C含量与Tm值成正比,G-C含量高,则Tm越高,测定Tm,可推知G-C含量。
G-C%=(Tm-69.3)×2.44
③介质中离子强度
其它条件不变,离子强度高,Tm高。
2、复性
变性DNA在适当(一般低于Tm20—25℃)条件下,两条链重新缔合成双螺旋结构。
变性DNA在缓慢冷却时(快速冷却可防止复性),可以复性。DNA片段越大,复性越慢;DNA浓度越大,复性越快。
复性速度可用Co·t衡量。
Co为变性DNA原始浓度mol·L-1,t为时间,以秒表示。
3、杂交(DNA—DNA、DNA—RNA)
将不同来源的DNA混合加热,变性后,慢慢冷却使它复性。若这些异源DNA之间,在某些区域有相同的序列,则复性时会形成杂交分子。
4、分子杂交
⑴、Southern Blotting
Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析,确定特异性DNA序列的大小和定位。
可用DNA或RNA探针。
⑵、Northern Blotting
研究对象是mRNA
检测可与探针DNA同源杂交的mRNA分子的存在,因而可以研究细胞内特定mRNA的产生,
即特定基因的表达。
mRNA易形成局部二级结构,因此,总RNA或mRNA需在变性条件下电泳,乙二醛、甲醛可防止RNA形成二级结构。
⑶、Western Blotting
是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。
2. 练习
知识点练习题
3. 测验
知识点测验题
4. 案例
知识点案例
5. 资源下载
课程讲义资源(Word文档)、教学课件资源(PPT)、视频录像资源(视频录像)。6. 扩展学习
扩展资料