Flexar-Chromera液相色谱培训教材
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第一部分：液相色谱基本工作原理及基本知识 液相色谱工作原理：是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附 等作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作 用力而达到相互分离，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方 法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相中有一相是固定的, 叫作固定相 (Stationary Phase), 即色谱柱；有一相是流动的, 称为流动相 (Mobile Phase), 流动相 又叫洗脱剂或溶剂。 液相色谱仪实际照片如下：
8|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
第二部分：液相色谱仪标准化操作流程 SOP
1 开机及准备系统
开机自检
详见1.1
准备溶剂
详见1.2
执行泵灌注
详见1.3
冲洗进样器
详见1.4
设定流动相平衡色谱柱
详见1.5
放入样品盘
详见1.6
2 实验 打开计算机，运行Chromera软件，在手动控制manual control界面下，设定试验所用的
0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
Minutes
0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
z 首先要检查所有的管子是否在液面下，必须确保所有的管子全部插到溶剂瓶的底 部；
z 洗针液（Needle Wash）的配制：50%甲醇：50%水（该比例仅适用于反相实验, 正相试验用流动相）。注意：洗针液中不能含有缓冲盐，否则会破坏进样器的管路
*特别提示: z 所有溶剂和溶液在使用前必须用0.45μm的滤膜过滤，并超声脱气； z 纯溶剂超声脱气2分钟即可，有机相与水相的混合溶剂需超声脱气5分钟； z 用洁净的玻璃容器盛放溶液和流动相，避免污染； z 玻璃容器必须使用超纯水清洗；
Minutes
根据标样的色谱峰面积 绘制标准曲线
5,000
4,000
响应值 ( 峰面积 )
3,000 2,000
1,000
0 0
样品的峰面积
5,000
根据样品的峰面积 4,000 计算浓度 响应值 3,000 ( 峰面积 )
2,000
样品的浓度
1,000
0
50
100
150
200
250
0
样品浓度
图 1‐8 外标法定量过程
2.4 部分：检测系统 经过分离的组分要选择合适的检测器，才能得到检测。
液相常用检测器
紫外检测器 示差检测器
UV
RI
测量参数
吸光度（AU）折光指数 （RIU）
池体积/ul
1～10
3～10
类型
选择性
通用性
线性范围
105
104
最小检出浓度/(g/ml) 10-10
10-7
最小检出量
1ng
1ug
噪声
10-4
50
100
150
200
250
样品浓度
4 液相色谱样品的制备
液相样品制备的基本原则：a 溶样溶剂一定是初始比例的流动相(对等度试验而言，就是流 动相 )，否则会有溶剂效应或由于样品在流动相中溶解度不同而析出固体堵塞色谱柱。当 然经过实验考察和证明，其他溶剂也可代替。b 采用以下一种或几种处理方式去除样品中 的不溶物和色谱干扰物：① 高速离心(大于 10,000 rpm) 10 分钟后，取上清液 ②过滤、超 滤 ③ 选择性沉淀 ④ 衍生反应 ⑤ 液‐液萃取 ⑥ 固相提取(Solid Phase Extract, SPE ) ⑦ 其它
溶剂管理系统
自动进样器
紫外检测器 柱温箱
泵
2|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
图 1‐1 常见配置 Flexar LC 高效液相色谱仪外观
色谱柱 (固定相)
数据系统
溶剂 (流动相)
泵
进样器
检测器
图 1‐2 高效液相色谱仪系统示意图
废液
图 1‐3 样品组分分离示意图 3|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
关闭计算机及显示器电源。
9|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
1.1 开机 (Powering On)
1. 打开Flexar LC各个模块的电源开关至 ON (1) 的位置，仪器开始进行自检。 2. 仪器将进行大约2分钟的自检过程，待仪器自我测试完毕后，每个模块状态栏上出现绿色
的对勾，表示开机测试正常。
1. 液相色谱在各个行业的应用
在医药行业:药物中有效成分的含量、相关物质分析、药代分析、药物中间体的分析等； 在环境保护工作中:可用来监测土壤, 大气和水的质量； 在食品工业中：可用于各种营养成分、非法添加剂、兽药、农药等的监控分析； 在农业上可用来监测农作物中残留的农药； 在石化上可用于各种添加剂、高聚物分子量等测定； 生命科学上用于氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等的分析； 在公安用于鉴别药物中毒或毒品类型.
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PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材 Flexar LC‐Chromera
美国珀金埃尔默仪器（上海）有限公司
1|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
内容
第一部分：液相色谱基本工作原理及基本知识 第二部分：液相色谱仪标准化操作流程 SOP 第三部分：液相色谱软件（Chromera）操作 第四部分：液相常见问题
2. 液相色谱的各个组成部分
由以下五大系统组成：高压色谱泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测记录系统。 组分能否分开，关键在于色谱柱；色谱泵以恒定流速驱动流动相进入色谱柱从而保证了色 谱分离的过程，所以色谱柱和色谱泵是液相色谱仪的核心。
图 1‐4 Flexar LC 色谱泵结构示意图
2.1部分：色谱泵 专利的设计—溶剂自动补偿 Flexar系列泵是目前世界上唯一能自动 进行溶剂压缩性补偿的传输泵，能自动记录 并计量在混合过程中由于溶剂体积收缩而出 现的任何量的变化。当溶剂压缩性改变时， 系统将立即发生作用并自动予以调整。专利 的设计使得每次泵冲程中的任何溶剂混合都 能进行自动溶剂补偿，因此，Flexar 系列泵 混合流动相和人工预混合所得出的分析结果 基本一致。 独特的设计 双柱塞正压吸入式恒流泵，使吸液过程在正 压下进行，从而避免负压吸入空气的可能 性，泵内不易产生气泡。 最优的耐压性能 全流速范围0~10mL/min，均可耐压至 6100psi。
抽液阀
泵灌注启动按键
图2‐2 Flexar LC 泵灌注图 4. 选择要灌注的流路（例如：流路B）, 按下相应的泵灌注启动按键，此时色谱泵将以
5mL/min的速度排液，然后将针筒向外拉（若管路中没有明显的大段气泡，可以不拉针 筒，液体会自行过来的），抽出约15~20mL溶剂并完全抽出溶剂管子内的气泡。再次按 下该灌注启动按键，色谱泵停止排液。 5. 重复上述步骤，对所有要使用的流动相溶剂进行，完成后关闭排液阀门。 注意：关闭排液阀门时切不可用力过大，会影响该部件的使用寿命。以色谱泵工作时，该阀门不漏 液为准。
10 | 页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
1.3 执行泵灌注 (Purge Pump)
何时进行泵灌注？ 当停泵4个小时以上的时候，或更换流动相的时候，或色谱泵运行时压力脉动大于100psi的时候
操作步骤： 1. 首先检查确认流动相溶剂的管子在正确的位置，检测器(Detector)废液管及定量环 （Sample Loop）的废液管置于合适的废液容器中。 2. 摇动溶剂瓶内的过滤器(Solvent Filter)，防止气泡附着在过滤器表面。 3. 将空的针筒插入排液阀（Prime/Vent value）中(如图2-2所示)，打开排液阀(以逆时针 的方向将排液阀旋转3 圈)。
1mg 10-3 不可以 敏感
2%/C
3 色谱常用定量方法
3.1 校正因子的概念
校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。
可用下式表示：
mi = fi ⋅ Ai
Mi– I 组分的量；fi– I 组分的校正因子；Ai–I 组分的峰面积 定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性 质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大 误差。故引入校正因子。
出现绿色的对勾表示该模块开机测试正常
图2‐1 Flexar LC 开机状态
1.2 准备溶剂 (Preparing Solvent Reservoirs)
z 必须用色谱纯有机溶剂(最好选择进口品牌)，水或缓冲盐溶液要用超纯水(电阻率大 于18.2MΩ， 总有机碳 TOC小于20ppb)；
z 水相流动相需要每隔48小时重新配制，特别是100% 含水流动相的使用时间不得 超过两天；
流动相条件、检测波长和其他参数，观察基线，待基线平稳，可准备进样，运行序列 sequence。具体软件操作，请参考第三部分液相色谱软件（Chromera）操作。
3 关机 实验结束后，返回手动控制manual control界面下，依次进行以下操作：
1. 清洗色谱柱约60分钟（详见附录一） 2. 冲洗进样器（详见1.4） 3. 降低流速至0，待系统压力回零后，退出Chromera软件，关闭液相各个模块电源。
4|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
2.2部分：进样器分手动进样器和自动进样器两种
图 1‐5 Flexar 自动进样器外观（左）及内部图
图 1‐6 六通阀工作示意图
图 1‐6 手动进样器六通阀横剖面图 5|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
手动进样器使用注意事项：手柄不能停留在 Load 和 Inject 中途！否则会暂时堵住了流路， 流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀。在 HPLC 系统中使用平头注射器针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不 引入空气；也防止了针头刺坏密封组件及定子。过滤样品溶液，防止微粒阻塞进样阀和减 少对进样阀的磨损。每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流 动相冲洗，在进样阀的 Load 和 Inject 位置反复冲洗；进样前，用无纤维纸擦净注射器针头 的外侧。
0.30
0.25
0.25
0.25
0.20
0.20
0.20
0.15
0.15
0.15
0.10
0.10
0.10
0.05
0.05
0.05
0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
Minutes
3.2 外标法（External Standard) 在相同分析条件下，通过比较标准物质与样品的色谱峰面积或峰高,获得定量结果的计算方 式.
a. 用已知的标准品配成不同浓度的标准样，测量各种浓度的峰高或峰面积，绘制响应 信号与百分含量的关系曲线；
7|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
表 1‐1 色谱柱直径与最佳流速关系
色谱柱直径 最佳流速
1.0mm
50uL/min
2.1mm
200uL/min
3.2mm
500uL/min
4.6mm
1.0mL/min
图 1‐7 BrownLee 色谱柱的实物图
注意：图中色谱柱方向的箭头，色谱柱不能反方向使用！
6|页
PerkinElmer 公司液相色谱现场培训教材
10-7
用于梯度洗脱
可以
不可以
对流量敏感性
不敏感
敏感
对温度敏感性
低
10-4C
荧光检测器 FL 荧光强度 （AU） 3～20 选择性
103 10-11
1pg 10-3 可以 不敏感 低
还有比较新的 蒸发光散射检测器ELSD
Page 38
电导检测器 CD 电导率 （uS/cm） 1～3 选择性 104 10-3
b. 测量样品的峰面积或峰高，在校正曲线上查出其对应的百分含量。外标法定量的具 体过程请参考图 1‐8。整个数据处理过程可以通过 PerkinElmer 的色谱工作站完 成。
c. 要求：进样量、色谱分析条件严格不变；
储存标样
工作标样
0
1
2
3
增加溶质的浓度
配置不同浓度的标液
4
上机测试标液
0.30
0.30
2.3 部分：色谱柱是液相色谱分离的核心，也是液相色谱系统中最常用的消耗品之一。在 使用色谱柱之前，一定要先仔细阅读色谱柱的说明书(不同的色谱柱，使用要求差距很 大)！不当的使用会严重缩短色谱柱的寿命！任何色谱柱都有液体流动方向，不能反用! 最 常用的 BrownLee C8、C18 反相色谱柱通常使用要求：流动相的 pH 范围：2.5~7.5；使用 温度：80℃以下；操作压力：小于 4000psi; 保存溶剂：100%甲醇。
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第二部分：液相色谱仪标准化操作流程 SOP
1 开机及准备系统
开机自检
详见1.1
准备溶剂
详见1.2
执行泵灌注
详见1.3
冲洗进样器
详见1.4
设定流动相平衡色谱柱
详见1.5
放入样品盘
详见1.6
2 实验 打开计算机，运行Chromera软件，在手动控制manual control界面下，设定试验所用的
0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
Minutes
0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
z 首先要检查所有的管子是否在液面下，必须确保所有的管子全部插到溶剂瓶的底 部；
z 洗针液（Needle Wash）的配制：50%甲醇：50%水（该比例仅适用于反相实验, 正相试验用流动相）。注意：洗针液中不能含有缓冲盐，否则会破坏进样器的管路
*特别提示: z 所有溶剂和溶液在使用前必须用0.45μm的滤膜过滤，并超声脱气； z 纯溶剂超声脱气2分钟即可，有机相与水相的混合溶剂需超声脱气5分钟； z 用洁净的玻璃容器盛放溶液和流动相，避免污染； z 玻璃容器必须使用超纯水清洗；
Minutes
根据标样的色谱峰面积 绘制标准曲线
5,000
4,000
响应值 ( 峰面积 )
3,000 2,000
1,000
0 0
样品的峰面积
5,000
根据样品的峰面积 4,000 计算浓度 响应值 3,000 ( 峰面积 )
2,000
样品的浓度
1,000
0
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100
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200
250
0
样品浓度
图 1‐8 外标法定量过程
2.4 部分：检测系统 经过分离的组分要选择合适的检测器，才能得到检测。
液相常用检测器
紫外检测器 示差检测器
UV
RI
测量参数
吸光度（AU）折光指数 （RIU）
池体积/ul
1～10
3～10
类型
选择性
通用性
线性范围
105
104
最小检出浓度/(g/ml) 10-10
10-7
最小检出量
1ng
1ug
噪声
10-4
50
100
150
200
250
样品浓度
4 液相色谱样品的制备
液相样品制备的基本原则：a 溶样溶剂一定是初始比例的流动相(对等度试验而言，就是流 动相 )，否则会有溶剂效应或由于样品在流动相中溶解度不同而析出固体堵塞色谱柱。当 然经过实验考察和证明，其他溶剂也可代替。b 采用以下一种或几种处理方式去除样品中 的不溶物和色谱干扰物：① 高速离心(大于 10,000 rpm) 10 分钟后，取上清液 ②过滤、超 滤 ③ 选择性沉淀 ④ 衍生反应 ⑤ 液‐液萃取 ⑥ 固相提取(Solid Phase Extract, SPE ) ⑦ 其它
溶剂管理系统
自动进样器
紫外检测器 柱温箱
泵
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图 1‐1 常见配置 Flexar LC 高效液相色谱仪外观
色谱柱 (固定相)
数据系统
溶剂 (流动相)
泵
进样器
检测器
图 1‐2 高效液相色谱仪系统示意图
废液
图 1‐3 样品组分分离示意图 3|页
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关闭计算机及显示器电源。
9|页
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1.1 开机 (Powering On)
1. 打开Flexar LC各个模块的电源开关至 ON (1) 的位置，仪器开始进行自检。 2. 仪器将进行大约2分钟的自检过程，待仪器自我测试完毕后，每个模块状态栏上出现绿色
的对勾，表示开机测试正常。
1. 液相色谱在各个行业的应用
在医药行业:药物中有效成分的含量、相关物质分析、药代分析、药物中间体的分析等； 在环境保护工作中:可用来监测土壤, 大气和水的质量； 在食品工业中：可用于各种营养成分、非法添加剂、兽药、农药等的监控分析； 在农业上可用来监测农作物中残留的农药； 在石化上可用于各种添加剂、高聚物分子量等测定； 生命科学上用于氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等的分析； 在公安用于鉴别药物中毒或毒品类型.
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美国珀金埃尔默仪器（上海）有限公司
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内容
第一部分：液相色谱基本工作原理及基本知识 第二部分：液相色谱仪标准化操作流程 SOP 第三部分：液相色谱软件（Chromera）操作 第四部分：液相常见问题
2. 液相色谱的各个组成部分
由以下五大系统组成：高压色谱泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测记录系统。 组分能否分开，关键在于色谱柱；色谱泵以恒定流速驱动流动相进入色谱柱从而保证了色 谱分离的过程，所以色谱柱和色谱泵是液相色谱仪的核心。
图 1‐4 Flexar LC 色谱泵结构示意图
2.1部分：色谱泵 专利的设计—溶剂自动补偿 Flexar系列泵是目前世界上唯一能自动 进行溶剂压缩性补偿的传输泵，能自动记录 并计量在混合过程中由于溶剂体积收缩而出 现的任何量的变化。当溶剂压缩性改变时， 系统将立即发生作用并自动予以调整。专利 的设计使得每次泵冲程中的任何溶剂混合都 能进行自动溶剂补偿，因此，Flexar 系列泵 混合流动相和人工预混合所得出的分析结果 基本一致。 独特的设计 双柱塞正压吸入式恒流泵，使吸液过程在正 压下进行，从而避免负压吸入空气的可能 性，泵内不易产生气泡。 最优的耐压性能 全流速范围0~10mL/min，均可耐压至 6100psi。
抽液阀
泵灌注启动按键
图2‐2 Flexar LC 泵灌注图 4. 选择要灌注的流路（例如：流路B）, 按下相应的泵灌注启动按键，此时色谱泵将以
5mL/min的速度排液，然后将针筒向外拉（若管路中没有明显的大段气泡，可以不拉针 筒，液体会自行过来的），抽出约15~20mL溶剂并完全抽出溶剂管子内的气泡。再次按 下该灌注启动按键，色谱泵停止排液。 5. 重复上述步骤，对所有要使用的流动相溶剂进行，完成后关闭排液阀门。 注意：关闭排液阀门时切不可用力过大，会影响该部件的使用寿命。以色谱泵工作时，该阀门不漏 液为准。
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1.3 执行泵灌注 (Purge Pump)
何时进行泵灌注？ 当停泵4个小时以上的时候，或更换流动相的时候，或色谱泵运行时压力脉动大于100psi的时候
操作步骤： 1. 首先检查确认流动相溶剂的管子在正确的位置，检测器(Detector)废液管及定量环 （Sample Loop）的废液管置于合适的废液容器中。 2. 摇动溶剂瓶内的过滤器(Solvent Filter)，防止气泡附着在过滤器表面。 3. 将空的针筒插入排液阀（Prime/Vent value）中(如图2-2所示)，打开排液阀(以逆时针 的方向将排液阀旋转3 圈)。
1mg 10-3 不可以 敏感
2%/C
3 色谱常用定量方法
3.1 校正因子的概念
校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。
可用下式表示：
mi = fi ⋅ Ai
Mi– I 组分的量；fi– I 组分的校正因子；Ai–I 组分的峰面积 定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性 质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大 误差。故引入校正因子。
出现绿色的对勾表示该模块开机测试正常
图2‐1 Flexar LC 开机状态
1.2 准备溶剂 (Preparing Solvent Reservoirs)
z 必须用色谱纯有机溶剂(最好选择进口品牌)，水或缓冲盐溶液要用超纯水(电阻率大 于18.2MΩ， 总有机碳 TOC小于20ppb)；
z 水相流动相需要每隔48小时重新配制，特别是100% 含水流动相的使用时间不得 超过两天；
流动相条件、检测波长和其他参数，观察基线，待基线平稳，可准备进样，运行序列 sequence。具体软件操作，请参考第三部分液相色谱软件（Chromera）操作。
3 关机 实验结束后，返回手动控制manual control界面下，依次进行以下操作：
1. 清洗色谱柱约60分钟（详见附录一） 2. 冲洗进样器（详见1.4） 3. 降低流速至0，待系统压力回零后，退出Chromera软件，关闭液相各个模块电源。
4|页
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2.2部分：进样器分手动进样器和自动进样器两种
图 1‐5 Flexar 自动进样器外观（左）及内部图
图 1‐6 六通阀工作示意图
图 1‐6 手动进样器六通阀横剖面图 5|页
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手动进样器使用注意事项：手柄不能停留在 Load 和 Inject 中途！否则会暂时堵住了流路， 流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀。在 HPLC 系统中使用平头注射器针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不 引入空气；也防止了针头刺坏密封组件及定子。过滤样品溶液，防止微粒阻塞进样阀和减 少对进样阀的磨损。每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流 动相冲洗，在进样阀的 Load 和 Inject 位置反复冲洗；进样前，用无纤维纸擦净注射器针头 的外侧。
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Minutes
3.2 外标法（External Standard) 在相同分析条件下，通过比较标准物质与样品的色谱峰面积或峰高,获得定量结果的计算方 式.
a. 用已知的标准品配成不同浓度的标准样，测量各种浓度的峰高或峰面积，绘制响应 信号与百分含量的关系曲线；
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表 1‐1 色谱柱直径与最佳流速关系
色谱柱直径 最佳流速
1.0mm
50uL/min
2.1mm
200uL/min
3.2mm
500uL/min
4.6mm
1.0mL/min
图 1‐7 BrownLee 色谱柱的实物图
注意：图中色谱柱方向的箭头，色谱柱不能反方向使用！
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10-7
用于梯度洗脱
可以
不可以
对流量敏感性
不敏感
敏感
对温度敏感性
低
10-4C
荧光检测器 FL 荧光强度 （AU） 3～20 选择性
103 10-11
1pg 10-3 可以 不敏感 低
还有比较新的 蒸发光散射检测器ELSD
Page 38
电导检测器 CD 电导率 （uS/cm） 1～3 选择性 104 10-3
b. 测量样品的峰面积或峰高，在校正曲线上查出其对应的百分含量。外标法定量的具 体过程请参考图 1‐8。整个数据处理过程可以通过 PerkinElmer 的色谱工作站完 成。
c. 要求：进样量、色谱分析条件严格不变；
储存标样
工作标样
0
1
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增加溶质的浓度
配置不同浓度的标液
4
上机测试标液
0.30
0.30
2.3 部分：色谱柱是液相色谱分离的核心，也是液相色谱系统中最常用的消耗品之一。在 使用色谱柱之前，一定要先仔细阅读色谱柱的说明书(不同的色谱柱，使用要求差距很 大)！不当的使用会严重缩短色谱柱的寿命！任何色谱柱都有液体流动方向，不能反用! 最 常用的 BrownLee C8、C18 反相色谱柱通常使用要求：流动相的 pH 范围：2.5~7.5；使用 温度：80℃以下；操作压力：小于 4000psi; 保存溶剂：100%甲醇。