七项呼吸道病毒实验操作步骤-鉴定

7项呼吸道病毒试剂盒操作流程

1、取样：（此步骤大多由临床医生完成。）

用特制的鼻咽拭子从病人的鼻咽部取样或者使用鼻腔灌洗液，将鼻咽拭子放入储存管中（含有缓冲液）。使用鼻咽拭子取样时，拭子进入鼻部后，应水平向鼻腔

伸入。伸入的深度约为耳垂到鼻尖的二分之一处，取样前可事先大致测量一下。

二岁一下的儿童，伸入深度约为拭子绒毛长度的二倍。拭子伸入至指定深度后，

缓缓贴壁旋转2-3周，约停留10秒钟，取出拭子。取样后一小时内向取样管中

加入生理盐水，样本最好在24小时内进行操作。

2、样本准备步骤：（此步骤除离心以外，建议都在二级生物安全柜内操作）

①将样本充分震荡混匀约10-15秒。

②在3000rpm转速下离心10分钟。

③弃上清。

④在沉淀中加 5 mL PBS缓冲液（请使用普通PBS，不要使用试剂盒内配套的浓缩洗液），充分震荡混匀约10-15秒。

⑤在3000rpm转速下离心10分钟。

⑥吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。

⑦重复步骤4到6，直至黏液层被完全去除。

注意：一定要将黏液去除干净，否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。以看不见粘液为准。一般重复两到三次即可，若肉眼不可粘液，洗一次即可。

⑧在沉淀中加0.5到1 mL的PBS缓冲液。视沉淀的量而定，若无可见沉淀则加入

0.2mL.

⑨用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。这个悬浊液可用

于直接样本测试。

3、直接样本测试步骤：

在操作前请将试剂盒内40×的高浓缩洗液稀释40倍后使用。

①在8孔板上的每孔内滴加25 μL的细胞悬浊液。（若在之前步骤清洗沉淀中可明显见大块沉淀，则滴加15μL细胞悬浊液即可。

②样本完全风干。风干时若操作实验室温度较低，建议置于25o C烘箱，可以使风干更短时间内完成。

③在20o C到25o C，用预冷的100%丙酮固定细胞约10分钟。注意：丙酮是易挥发、可燃性物质，使用时请远离明火。丙酮可重复使用，可用

④从丙酮中取出载玻片并风干。

⑤在固定并风干的细胞上滴加对应的七种DFA染色试剂，使其完全覆盖细胞。

⑥在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内也要滴加七种DFA染色试剂。抗原对照板包含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞，只能一次性使用。

⑦在阴性对照孔内滴加正常鼠丙种球蛋白试剂，使其完全覆盖细胞。（此步骤仅限筛查试剂）备注：以上步骤①~⑦建议在二级生物安全柜中完成。

⑧将载玻片放于35o C到37o C的恒温箱内孵育15分钟，为保持其湿润最好放置于带盖的盒子内。（可置于培养皿内，或用盖子将玻片盖住均可）

⑨用事先稀释好1倍的洗液（试剂盒内40×洗液稀释）漂洗染色细胞。为了更有

效地洗涤，请将玻片在洗液中反复浸蘸4次左右。（洗液颜色变深即可更换，一

般洗10块板左右）

⑩使用新的1倍洗液再洗一次。请用少量的洗液冲洗玻片。

?用去离子水再洗一遍。

4、观察实验结果与判断

滴加1到2滴固定液，以盖盖玻片时不产生气泡为益。并加盖盖玻片（20X50 mm），要注意避免产生气泡。在200倍放大荧光显微镜下观察结果。

试剂盒中染色液包含FITC荧光物标记的特异性抗体，阳性的样本会结合特

异性抗体，结果观察需要在荧光显微镜下观察。荧光需要蓝光激发，荧光激发

波长约480nm左右。FITC在蓝光激发下发绿色荧光，反射光波长为520nm左右。因此，阳性感染细胞应发绿色荧光。

阳性结果判断：在样本孔中低倍视野下若有2个或以上由细胞发出果绿色荧光，即为该孔所对应的病毒阳性。

实验后，已使用的鼻咽拭子、储存管、玻片等按照国家有关医疗废弃物处理规定进行处

理，无需特别处理措施。可重复使用的试剂（丙酮、试剂盒自带的漂洗液等）在达到使用次数限制以后按照规定进行处理。