乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量

乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
12级临本二班吕梦月许力飞
王雅琦王明华马翔张宇王帅
实验目的：乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
实验原理：
分离：加蛋白质抑制剂：竞争性或非竞争性抑制蛋白酶活性；防止蛋白酶分解；除核酸：利用核酸和蛋白质在链霉素磷酸酶中溶解度不同除去核酸；去盐：超滤液筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过度介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤液膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。

等电点测定法的原理：在等电点时蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子静电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互作用之间的作用减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

提纯：醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。

它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。

它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。

太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。

鉴定：乙醇脱氢酶可将乙醇分解生成乙醛
定量：S D S-P A G E即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：1. 在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。

2. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS (阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。

此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3. 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。

实验试剂与器材：
器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、
管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，、.交联葡聚糖
G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6 、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。

甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。

乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。

、保存液：液体石蜡、定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。

实验步骤：
分离：1.细胞破碎：将10g肝组织用剪刀剪碎，放入研钵中,加入0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液4ml研磨成糊状，再加2ml0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液,搅匀，然后将所得的物质过滤，取滤液。

2. 添加蛋白质抑制剂：在盛有研磨液的试管中加入5ml磷酰胺素，震荡40度水浴中保温30min。

3.除核酸：逐滴加入1%~2%的链霉素硫酸盐，直至沉淀不再产生。

进行过滤除去沉淀。

4.盐析：逐滴加入硫酸铵溶液直至蛋白质不再沉淀。

进行过滤取其沉淀部分，并加入适量磷酸盐缓冲液直至蛋白形成6ml糊状物。

5.去盐：将上述溶液放入超滤装置中，使蛋白质和小分子物质分离开，将大分子物质分离开并加入一定量磷酸盐缓冲液直至糊状物形成6ml。

6.等电点沉淀法：在上述溶液中加入一定量0.02mol/L盐酸边加入边搅拌，一边用PH剂测量使其PH值调至5.4，然后倒置离心机中6000r/min离心15分钟，倒掉上清液，再在此溶液中加入6ml去离子水，震荡使下部的沉淀重新溶解，并以0.1mol/mL 的氢氧化钠将其PH值调至8.6.重复进行两次。

提纯：醋酸纤维膜电泳：1电泳槽与薄膜的制备（1）醋酸纤维素薄膜的湿润与选择：用钝头镊子取一片薄膜，在薄膜无光泽面上，距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。

小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。

若漂浮于液面的薄膜在15s—30s内迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜湿润缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应舍去，以免影响电泳结果，将选好的薄膜用竹夹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。

（2）电泳槽的准备：根据电泳槽的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。

在两个电极槽中，各倒等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。

当滤纸条全部浸润后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。

2、点样用钝头镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液，无光泽面向上平放在点样板上，点样时用点样器沾少许经分离的肝脏研磨液，再将点样器轻轻印在点样区内，样品线长度一般为1.5cm，宽度一般不超过3mm.使经分离的肝脏研磨液完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线，用同样的方法对标准乙醇脱氢酶溶液进行点样。

3、电泳用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。

如图1-2-9所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，如一电泳槽同时安放几张薄膜，则薄膜之间应隔几毫米，盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。

用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。

在室温下电泳，打开电源开关，调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA（8块薄膜则为4.8mA）。

通电10min—15min 后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50min—60min。

电泳后调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源或自然风干。

4、染色与漂洗用钝头镊子取出电泳后的薄膜，无光泽面向上，放在含有0.5％氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。

取出后用自来水冲去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培养皿中，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。

取出后放在滤纸上，用电吹风的冷风将薄膜吹干。

凝胶层析法：1.凝胶准备称取5g交联葡聚糖G-25,倾入锥形瓶中,加蒸馏水约60ml溶胀,搅动后静置.待凝胶沉积后,用倾注法除去浮于表面的细粒,重复3次.将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜,以达平衡.2.装柱取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支,垂直装好.加入缓冲液,打开出口,将气泡赶出,关闭出口.然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高,将
平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内,再打开出口,使液体流出,继续不断地
加入交联葡聚糖G-25悬浮液,柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止.床面上覆盖3ml缓冲液,关闭出口,在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸,使层析柱稳定5～10min后,接储液瓶,打开
出口,用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡,最后关闭出口.3..上样,洗脱打开平衡好的层析柱出口,使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口.吸混合物样品0.5ml左右,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品,切勿搅动床面.然后打开出口,使样品进入床内,直
至床面重新露出.同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小,而样品又完全进入床内),当少量洗脱液将流入床面时,加入多量的洗脱液,但注意切勿搅动床面凝胶,连接储液瓶进行洗脱.4.分部收集根据电泳方法进行的结果可得乙醇脱氢酶为第N条带，用自动部分收集器,以5滴/min,5min/管的速度进行收集.并且观察柱上的色带,待第N
柱液体流下时,再继续收集两管透明的洗脱液作为空白,关闭出口.即可收集到提纯后的乙醇脱氢酶。

再进行醋酸纤维膜电泳进行一遍看看是否纯净，若不纯净则重复进行凝胶交换柱层析法进行提纯。

鉴定：将提纯后的乙醇脱氢酶中放入一定量酒精，并加入氧化亚铜并加热，观察是否有砖红色沉淀。

定量：1. 安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。

可根据具体不同型号要求进行操作。

主要注意事项：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。

2. 配胶：根据待测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶和浓缩胶浓度，按下表配制：
3. 制备凝胶板：①分离胶制备：按表配制12%分离胶。

由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液。

混匀后用注射器抽取3.2~3.5ml凝胶液，加至长、短玻璃板间的缝隙内(立即清洗注射器及针头)。

再用滴管取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入约3~4mm高，以进行水封。

30~60min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。

倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。

②浓缩胶的制备：按表配制3%浓缩胶(待分离胶聚合后再加AP/TEMED)，混匀后用注射器加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。

轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。

约30min后凝胶聚合。

待凝胶凝固后，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将Tris-Gly电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。

4.样品处理及加样蛋白质标样及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/ml，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用(处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合)。

一般加样体积为10~15 l。

如样品较稀可适量增加加样体积。

用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部(双手操作，避免伤及凝胶)，待所有样品槽内都加完样品后即可开始电泳。

5. 电泳将直流稳压电泳仪开关打开，将电流调至10~20mA (稳流)开始电泳。

待蓝色染料(溴
酚蓝)迁移至距凝胶底部约1cm时关闭电源。

6. 染色及脱色取出玻璃板，先用注射器取水从两侧小心冲洗使之松动，再用取胶板轻轻将短玻璃板撬开移去(必要时同时用水冲洗)，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。

将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。

7. 相对分子量计算用直尺分别量取各蛋白质条带中心以及溴酚蓝条带中心距分离胶顶端的距离，按下式计算：相对迁移率 = 样品迁移距离(cm) / 染料迁移距离(cm)
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。

实验结果：
由此次实验可推理的，将乙醇脱氢酶提纯纯净，则可得其可乙醇进行脱氢生成醛，且可得此物质的相对分子质量为141000.
实验讨论：
1. 并非所有蛋白质都能用此法测定其分子量。

已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的，包括电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。

例如组蛋白F1本身带有大量正电荷，尽管结合有正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响：其分子量是21,000，但用本法测定的结果却是35,000。

因此有必要至少用两种方法来测定未知样品的分子量，以便互相验证。

2. 有许多蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如 -胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下解离成亚基或单条肽链。

因此，对于这一类蛋白质，本法测定的只是其亚基或单条肽链的分子量。

为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，以便与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。

3.此次实验为推理实验，则不知是否纯正，所以要进行检测，而检测的方法是醋酸纤维蛋白膜进行检测即可知道含有几种蛋白质，用标准液进行对比就可知道乙醇脱氢酶的排列顺序是什么，则就知道在凝胶交换柱层析法的分离顺序，如若分离不彻底即要反复进行。

就可分离出较纯正的乙醇脱氢酶。

然后进行检测其活性和相对分子质量。

注意事项：
1进行研磨操作时，研钵应放在不易滑动的物体上，研杵应保持垂直。

研钵中盛放固体的量不得超过其容积的1／3。

洗涤研钵时，应先用水冲洗，耐酸腐蚀的研钵可用稀盐酸洗涤。

研钵上附着难洗涤的物质时，可向其中放入少量食盐，研磨后再进行洗涤。

2.加入链霉素磷酸盐时要适量，不要大量一次加入。

3.装柱后要检查柱床是否均匀,若有气泡或分层的界面时,需要重新装柱.4.流速不可太快,否则分子小的物质来不及扩散,随分子大的物质一起被洗脱下来,达不到分离目的.
附：本次实验思路
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
原料选取：饥饿24小时后的肝脏
↓
分离：细胞破碎（捣碎）→添加蛋白质抑制剂（丝氨酸蛋白质抑制剂）→除核酸（沉淀法1％-2％的链霉素硫酸盐）→盐析（硫酸铵）→去盐（超滤）→等电点沉淀法（PI=5.4-5.8）↓
提纯：检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净看乙醇脱氢酶的带的顺序、凝胶交换柱层析法提纯、检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净再进行提纯
↓
鉴定：加入乙醇分解鉴定
↓
定量：SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量
实验清单
实验试剂与器材：器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐
缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，、.交联葡聚糖
G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6 、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。

甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。

乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。

、保存液：液体石蜡、定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。