蛋白质凝胶电泳银染色法的改进
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［６］， 甲醛能与蛋白质分子的许多不同的 功能基团相
结合， 或遮蔽某些基团， 或暴露某些基团， 可能戊二 醛的作用也基于同样的机理， 使蛋白质某些能与［Ａ ｇ （Ｎ Ｈ ）３］＋ 结 合 的 基 团 更 多 暴 露 ， 起 一 种 媒 介 放 大 作 用， 从而提高染色灵敏度。对于戊二醛的浓度， Ｏ ａｋｌｅｙ［２］等人使用的是 １０％ ， 在本方法的试验条件下 戊二醛的最低使用浓度为 ５％ 。在此基础上增加浓 度对灵敏度并无明显提高， 当浓度降至 ２．５％ 时灵敏 度下降。使用后的戊二醛可再次使用， 在避光冷藏 条件 下 ， 可 保 存 ２～３ 天 ， 若 颜 色 明 显 变 黄 ， 则 不 能 再使用。
含量为 ０．５ｎｇ 时， 主带（Ａ ）清晰可辨， Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染色 法在其含量为 ５０ｎｇ 时， 主带隐约可见， ５０ｎｇ 以下含 量（５ｎｇ、０．５ｎｇ）无条带 出现； 对糜蛋 白 酶 （Ｍ Ｗ ２４Ｋ Ｄ ）， 银 染 色 法 在 其 含 量 为 ５０ｎｇ 时 ， 主 带 （Ｃ ）清 晰 可 辨 ， Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染色法在其含量为 ５００ｎｇ 时， 未 见主带 出 现 ， 由 此 可 见 ， 无 论 是 对 Ｂ ＳＡ ， 还 是 糜 蛋 白 酶 ， 银 染色法比 Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染色法至少灵敏 １００ 倍。
１．２．２ Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染 色 电 泳 结 束 后 凝 胶 片 置 ０．２５％ Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染 液 （溶 解 １．２５ｇ Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 于 ４５４ｍ ｌ５０％ 甲 醇 及 ４６ｍ ｌ 冰 醋 酸 中）４ｈ 以 上 或 过 夜 ， 再用脱色液 （含 １０％ 冰醋酸， ２５％ 甲醇的水溶液）浸 泡至背景色褪色完全为止。银染色： 电泳结束后， 在 直径 １３ｃｍ 培养皿中按以下步骤在摇床上进行操作 （每块凝胶需最低试剂量为 ２０ｍ ｌ）。固定： 将凝胶置固 定液 （含冰醋酸 １０％ ， 甲醇 ４０％ 的水溶液） 中浸泡 １０ｍ ｉｎ。 漂 洗 ： 将 固 定 的 凝 胶 片 置 重 蒸 馏 水 中 洗 ５ｍ ｉｎ。 增 敏 ： 将 凝 胶 片 置 ５％ 的 戊 二 醛 水 溶 液 中 ７ｍ ｉｎ。漂洗： 重蒸馏水洗 ３ 次， 每次 ３ｍ ｉｎ。银染： 将凝 胶片转入染 液（２０％ 硝 酸 银 ２００μ１； 浓 氨 水 ２００μｌ； ４％ 氢 氧 化 钠 ｌｍ ｌ； ２０％ 乙 醇 １８．６ｍ ｌ， 新 鲜 配 制 ）中 １０ｍ ｉｎ。漂洗： ２０％ 乙醇洗两次， 每次 ３ｍ ｉｎ。显影： 将
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ＪｉａｎｇｘｉＪ．Ｍ ｅｄ Ｌａｂ Ｓｃｉ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６，Ｖ ｏｌ２４，Ｎ ｏ１
凝胶片置于显影剂（２０％ 乙醇 ２０ｍ ｌ， ３７％ 甲醛 ２０μｌ， 饱 和 柠 檬 酸 ５μｌ） 中 显 色 至 满 意 为 止 （约 需 ３～ ６ｍ ｉｎ）， 再转入重蒸馏水中终止显色， 换水两次。
对于固定时间， 我们实验显示， １０ｍ ｉｎ 已足够， 在此基础上增加时间对结果无影响， 但如缩短时 间， 染色背景会加深。
Ｂ ＳＡ 虽为电泳单点纯， 但用高灵敏度的银染色 法检测， 在 ５００ｎｇ 量时， 可见 １０ 多条杂蛋白带， 提示 “单点纯”仅是一个相对的概念， 在纯度要求较高 时， 还需进一步纯化。
参考文献 ［１］Ｓｗ ｉｔｚｅｒＲ Ｃ ，Ｍ ｅｒｒｉｌＣ Ｒ ，ａｎｄ Ｓｈｉｆｒｉｎ Ｓ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎ ｆｏｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ ｉｄｅ ｇｅｌｓ ［Ｊ］． Ａ ｎａｌ Ｂ ｉｏｃｈｅｍ ，１９７９，９８：２３１～２３７． ［２］Ｏ ａｋｌｅｙ Ｂ Ｒ ，Ｋ ｉｒｓｃｈ Ｄ Ｒ ， Ｍ ｏｒｒｉｓ Ｒ Ｎ ．Ａ ｓｉｍ ｐｌｉｆｉｅｄ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ ｉｄｅ ｇｅｌｓ ［Ｊ］．Ａ ｎａｌ Ｂ ｉｏｃｈｅｍ ， １９８０，１０５：３６１～３６３． ［３］Ｍ ｅｒｒｉｌ Ｃ Ｒ ，Ｄ ｕｎａｕ Ｍ Ｌ，Ｇ ｏｌｄｍ ａｎ Ｄ ． Ａ ｒａｐｉｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ （下转第 ５４ 页）
重耐药菌株不 断上升， 往往导致治疗失败Βιβλιοθήκη Baidu 为了解 红霉素的耐药状况， 主要耐药基因， 为流行病学提 供有价值的资料而开展此项工作 。
参考文献 ［１］ Ｐｅｒｆｏｒｍ ａｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒａｎｔｉｍ ｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ： Ｎ ｉｎｔｈ
ｉｎｆｏｒｍ ａｔｉｏｎａｌ［Ｓ］．Ｓｕｐｐｌｅｍ ｅｎｔ．Ｍ １００－Ｓ９，１９９９，１９（１）：５５９～５６１． ［２］ Ａ ｍ ｉｎｏｖ Ｒ Ｉ， Ｇ ａｒｒｉｇｕｅｓ－Ｊｅａｎｊｅａｎ Ｎ ， Ｍ ａｃｋｉｅ Ｒ Ｉ． Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ
１ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 丙烯酰胺（Ａ ｃｒ） 北京化学试剂公司产品。 １．１．２ 甲叉双丙烯酰胺（Ｂ ｉｓ） ＦＬＵ Ｋ Ａ ｃｏｍ ｐａｎｙ。 １．１．３ 十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ ＳＤ Ｓ） ＩＮ Ｄ Ｏ Ｎ Ｅ ＳＩＡ Ｃ Ｈ Ｅ Ｍ ＩＣ Ａ ＬＳ ｃｏｍ ｐａｎｙ。 １．１．４ 牛血清白蛋白（Ｂ ＳＡ ） 上海长阳生化制药厂 （电泳单点纯）。 １．１．５ 糜蛋白酶 上海化学试剂采购供应站（国产 分装）。 １．１．６ 戊二醛 Ｅ ．Ｍ ．Ｋ 进口分装（上海化学试剂站 分装厂）。 １．１．７ 硝酸银 成都化学试剂厂（Ｇ Ｒ ）。 １．１．８ 考 马 斯 亮 兰 Ｃ ｏｏｍ ａｓｓｉｅ Ｂ ｒｉｌｌａｎｔ Ｂ ｌｕｅ Ｒ －２５０
从实验结果可以看出， 两种蛋白质在相同含量 时， 两种染色法均显示糜蛋白酶的灵敏度明显低于 Ｂ ＳＡ ， 我们认为可能有两种 原因： 第一 ， 两种染色法 对糜蛋白酶的灵敏度本身就低于 Ｂ ＳＡ 的灵敏度。第 二， 糜蛋白酶本身不纯或在样品处理时被降解， 因 为染色时可见一着色较深的小分子条带。
本法适用于凝胶厚度为 ０．７５ｍ ｍ ， 温度为室温 ２５℃左右。我们的实验显示， 如果由于其它原因引 起着色过浅， 可重复增敏以后的步骤， 同样可得到 比较满意的结果。
２ 结果 ２．１ Ｂ ＳＡ 和糜蛋白酶经过 ＳＤ Ｓ－ＰＡ Ｇ Ｅ 后， 两种染 色 法 结 果 见 图（左 边 为 Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染 色 ， 右 边 为 银 染色）
图上方数字为每种蛋白质的含量 （ｎｇ）， Ｂ ＳＡ 和
附图 两种染色法结果比较
糜蛋白的染色谱带经单独电泳染色确定。 ２．２ 由图可见： 对 Ｂ ＳＡ （Ｍ Ｗ ６７Ｋ Ｄ ）， 银染色法在其
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附表 肠球菌含 ｅｒｍ Ｂ 耐药基因分布表
名称
菌株数
红霉素耐药
表型
ｅｒｍＢ
屎肠球菌
６
＋
粪肠球菌
３
Ｒ
＋
鸡肠球菌
１
＋
因以 ｅｒｍ Ｂ 为主。大环内酯类抗生素是一类结构相 关的抗生素在核体水平上抑制细菌蛋白质的合成， 它常用于儿童肠球菌感染的治疗， 但由于肠球菌多
ＪｉａｎｇｘｉＪ．Ｍ ｅｄ Ｌａｂ Ｓｃｉ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６，Ｖ ｏｌ２４，Ｎ ｏ１
Ｂ ＳＡ 的一条杂蛋白带（图中标记 Ｂ ）的着色比糜 蛋白酶的主带（图中标记 Ｃ ）明显浅， 当 １０ 倍稀释后， Ｂ 的着色反比 Ｃ 的深， 提示银染色法对不同的蛋白 质具有不同的灵敏度。
由于杂蛋白的存在， 本法对 Ｂ ＳＡ 和糜蛋白酶的 检测限应分别在 ０．５ｎｇ 和 ５０ｎｇ 以下， 从附表中几种
江西医学检验 ２００６ 年 ２ 月 第 ２４ 卷 第 １ 期
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蛋白质凝胶电泳银染色法的改进
牛 敏 １ 陈汉芳 １ 颜英俊 ２ 尹一兵 ２
中图分类号 Ｒ４４６．１１＋２，Ｑ５０３
文献标识码 Ａ
文章编号 １００８－ ００２３（２００６）０１－ ００５５－ ０３
·实验研究·
［摘要］ 目的 探索一种快速、灵敏的蛋白质凝胶电泳银染色方法。 方法 对蛋白质凝胶电泳银染色 过程中的多种因素进行了实验探索， 在此基础上探索出一种改良的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色 法。 结果 改进方法灵敏度为 Ｃ ｏｏｍ ａｓｓｉｅ Ｂ ｒｉｌｌｉａｎｔＢ ｌｕｅ Ｒ －２５０ 法的 １００ 倍以上， 对 牛 血 清 白 蛋 白 的 检 测 限在 ０．５ｎｇ 以下， 整个染色过程不超过 ６０ｍ ｉｎ， 染色重复性好。 结论 改进后的方法比以前使用的方法简 便 、快 速 、灵 敏 、成 本 相 对 低 廉 。
作 者 单 位 ： ６１７０６７ １、四 川 攀 枝 花 市 中 心 医 院 ； ２、重 庆 医 科 大学检验系 作 者 简 介 ： 牛 敏 ， １９６５ 年 生 ， 男 ， 汉 ， 主 管 检 验 师 ， 毕 业 于 重 庆 医科大学医学检验系。
（Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０）： 进口分装。 １．２ 方法 １．２．１ 电泳 １．２．１．１ 电泳仪 Ｂ ｉｏ－Ｒ ａｄ ｍ ｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ Ⅱ垂直板电
附表 几种方法染色时间和对 Ｂ ＳＡ 的检测限
ＯＡＫＬＥＹ 张宗玉等 蔡晓丹等 本室方法
染 色 时 间 （分）
＞７７
≥９３
＞６００
＜６０
对 ＢＳＡ 的检测限（ｎｇ） ≤１．２５
≤２
≤１
＜０．５
方法的比较可以看出， 本法具有较高的灵敏度和快 速的特点。
３ 讨论 戊二醛的作用机理现在不甚清楚， 据文献资料
泳系统。 １．２．１．２ 试剂配制及样品处理 ①样品缓冲液： 重
蒸 馏 水 ３．８ｍ ｌ； ０．５ｍ ｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｈ Ｃ Ｉ（ｐＨ ６．８）１．０ｍ ｌ；丙 三 醇 ０．８ｍ ｌ； １０％ （Ｗ ／Ｖ ）ＳＤ Ｓ １．６ｍ ｌ； ２－ 巯 基 乙 醇 ０．４ｍ ｌ； １％ （Ｗ ／Ｖ ）溴酚蓝 ０．４ｍ ｌ。②电 极缓冲液（ｐＨ ８．３）： Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ ３ｇ／Ｌ； 甘氨酸 １４．４ｇ／Ｌ； ＳＤ Ｓ １ｇ／Ｌ。③样品处理： 牛 血清白蛋白 （Ｂ ＳＡ ） 和糜蛋白酶的定量用 Ｃ ｏｏｍ ａｓｓｉｅ Ｂ ｒｉｌｌｉａｎｔＢ ｌｕｅ Ｇ －２５０ 染料法， 然后用样品缓冲液定 量梯度稀释， 隔水煮沸三分钟。④制胶： 分离胶浓度 为 １２．５％ ， 浓缩胶浓 度为 ４％ ， 凝胶 厚 度 为 ０．７５ｍ ｍ 。 ⑤电泳条件： 恒压 ２００ 伏， 电泳时间约 ４５ｍ ｉｎ。
银染色的影响因素很多， 应注意染色器皿的洁 净， 试剂纯净有效， 染色过程中不可用手触摸凝胶 片， 不能让凝胶片干燥， 否则会产生非特异性着色； 背景的控制还需注意以下三点： 第一， 固定时间， 固 定液的作用除了将凝胶中的蛋白质变性固定外， 还 具有洗脱 ＳＤ Ｓ 巯基乙醇以及其它离子的作用， 在我 们的实验中， 固定时间不能低于 １０ｍ ｉｎ， 增加固定时 间对呈色无影响； 第二， 增敏后的漂洗应充分， 否则 因戊二醛的洗脱不完全而致背景加深； 第三， 使用 的乙醇应高纯度， 储存过久能产生具有还原性的乙 醛， 而使背景色加深。
［关键词］ ＳＤ Ｓ－ＰＡ Ｇ Ｅ ； 银染色； 蛋白质
银染色法仍是当今蛋白质凝胶电泳最敏感的 测定方法之一， 自 １９７９ 年 Ｓｗ ｉｔｚｅｒ［１］等报道了高灵敏 度的蛋白质凝胶电泳银染色法以来， 由于其染色机 理至今仍未阐明， 方法仍在不断完善发展中。我们 参考了国内外有关银染色法资料， 发现以前许多方 法存在费时、背景色不易控制， 有时需褪色处理［１～８］， 染色条件要求高， 试剂用量大等问题。我们结合前 人的经验， 对染色过程中的多种因素作了进一步的 探索研究， 建立了一种在本实验条件下灵敏、快速、 简便的改良染色法， 为科研及临床常规工作进行样 本（脑 脊 液 、尿 液 、羊 水 等 ）的 微 量 蛋 白 质 测 定 分 析 提 供了又一简便实用方法。
ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ： ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆｐｒｉｍ ｅｒｓ ｆｏｒ ｄｅ－ ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍ ａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ａ ｐｐ１ Ｅ ｎｖｉｒｏｎ Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１，６７：２２～３２．
结合， 或遮蔽某些基团， 或暴露某些基团， 可能戊二 醛的作用也基于同样的机理， 使蛋白质某些能与［Ａ ｇ （Ｎ Ｈ ）３］＋ 结 合 的 基 团 更 多 暴 露 ， 起 一 种 媒 介 放 大 作 用， 从而提高染色灵敏度。对于戊二醛的浓度， Ｏ ａｋｌｅｙ［２］等人使用的是 １０％ ， 在本方法的试验条件下 戊二醛的最低使用浓度为 ５％ 。在此基础上增加浓 度对灵敏度并无明显提高， 当浓度降至 ２．５％ 时灵敏 度下降。使用后的戊二醛可再次使用， 在避光冷藏 条件 下 ， 可 保 存 ２～３ 天 ， 若 颜 色 明 显 变 黄 ， 则 不 能 再使用。
含量为 ０．５ｎｇ 时， 主带（Ａ ）清晰可辨， Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染色 法在其含量为 ５０ｎｇ 时， 主带隐约可见， ５０ｎｇ 以下含 量（５ｎｇ、０．５ｎｇ）无条带 出现； 对糜蛋 白 酶 （Ｍ Ｗ ２４Ｋ Ｄ ）， 银 染 色 法 在 其 含 量 为 ５０ｎｇ 时 ， 主 带 （Ｃ ）清 晰 可 辨 ， Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染色法在其含量为 ５００ｎｇ 时， 未 见主带 出 现 ， 由 此 可 见 ， 无 论 是 对 Ｂ ＳＡ ， 还 是 糜 蛋 白 酶 ， 银 染色法比 Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染色法至少灵敏 １００ 倍。
１．２．２ Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染 色 电 泳 结 束 后 凝 胶 片 置 ０．２５％ Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染 液 （溶 解 １．２５ｇ Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 于 ４５４ｍ ｌ５０％ 甲 醇 及 ４６ｍ ｌ 冰 醋 酸 中）４ｈ 以 上 或 过 夜 ， 再用脱色液 （含 １０％ 冰醋酸， ２５％ 甲醇的水溶液）浸 泡至背景色褪色完全为止。银染色： 电泳结束后， 在 直径 １３ｃｍ 培养皿中按以下步骤在摇床上进行操作 （每块凝胶需最低试剂量为 ２０ｍ ｌ）。固定： 将凝胶置固 定液 （含冰醋酸 １０％ ， 甲醇 ４０％ 的水溶液） 中浸泡 １０ｍ ｉｎ。 漂 洗 ： 将 固 定 的 凝 胶 片 置 重 蒸 馏 水 中 洗 ５ｍ ｉｎ。 增 敏 ： 将 凝 胶 片 置 ５％ 的 戊 二 醛 水 溶 液 中 ７ｍ ｉｎ。漂洗： 重蒸馏水洗 ３ 次， 每次 ３ｍ ｉｎ。银染： 将凝 胶片转入染 液（２０％ 硝 酸 银 ２００μ１； 浓 氨 水 ２００μｌ； ４％ 氢 氧 化 钠 ｌｍ ｌ； ２０％ 乙 醇 １８．６ｍ ｌ， 新 鲜 配 制 ）中 １０ｍ ｉｎ。漂洗： ２０％ 乙醇洗两次， 每次 ３ｍ ｉｎ。显影： 将
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凝胶片置于显影剂（２０％ 乙醇 ２０ｍ ｌ， ３７％ 甲醛 ２０μｌ， 饱 和 柠 檬 酸 ５μｌ） 中 显 色 至 满 意 为 止 （约 需 ３～ ６ｍ ｉｎ）， 再转入重蒸馏水中终止显色， 换水两次。
对于固定时间， 我们实验显示， １０ｍ ｉｎ 已足够， 在此基础上增加时间对结果无影响， 但如缩短时 间， 染色背景会加深。
Ｂ ＳＡ 虽为电泳单点纯， 但用高灵敏度的银染色 法检测， 在 ５００ｎｇ 量时， 可见 １０ 多条杂蛋白带， 提示 “单点纯”仅是一个相对的概念， 在纯度要求较高 时， 还需进一步纯化。
参考文献 ［１］Ｓｗ ｉｔｚｅｒＲ Ｃ ，Ｍ ｅｒｒｉｌＣ Ｒ ，ａｎｄ Ｓｈｉｆｒｉｎ Ｓ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎ ｆｏｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ ｉｄｅ ｇｅｌｓ ［Ｊ］． Ａ ｎａｌ Ｂ ｉｏｃｈｅｍ ，１９７９，９８：２３１～２３７． ［２］Ｏ ａｋｌｅｙ Ｂ Ｒ ，Ｋ ｉｒｓｃｈ Ｄ Ｒ ， Ｍ ｏｒｒｉｓ Ｒ Ｎ ．Ａ ｓｉｍ ｐｌｉｆｉｅｄ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ ｉｄｅ ｇｅｌｓ ［Ｊ］．Ａ ｎａｌ Ｂ ｉｏｃｈｅｍ ， １９８０，１０５：３６１～３６３． ［３］Ｍ ｅｒｒｉｌ Ｃ Ｒ ，Ｄ ｕｎａｕ Ｍ Ｌ，Ｇ ｏｌｄｍ ａｎ Ｄ ． Ａ ｒａｐｉｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ （下转第 ５４ 页）
重耐药菌株不 断上升， 往往导致治疗失败Βιβλιοθήκη Baidu 为了解 红霉素的耐药状况， 主要耐药基因， 为流行病学提 供有价值的资料而开展此项工作 。
参考文献 ［１］ Ｐｅｒｆｏｒｍ ａｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒａｎｔｉｍ ｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ： Ｎ ｉｎｔｈ
ｉｎｆｏｒｍ ａｔｉｏｎａｌ［Ｓ］．Ｓｕｐｐｌｅｍ ｅｎｔ．Ｍ １００－Ｓ９，１９９９，１９（１）：５５９～５６１． ［２］ Ａ ｍ ｉｎｏｖ Ｒ Ｉ， Ｇ ａｒｒｉｇｕｅｓ－Ｊｅａｎｊｅａｎ Ｎ ， Ｍ ａｃｋｉｅ Ｒ Ｉ． Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ
１ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 丙烯酰胺（Ａ ｃｒ） 北京化学试剂公司产品。 １．１．２ 甲叉双丙烯酰胺（Ｂ ｉｓ） ＦＬＵ Ｋ Ａ ｃｏｍ ｐａｎｙ。 １．１．３ 十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ ＳＤ Ｓ） ＩＮ Ｄ Ｏ Ｎ Ｅ ＳＩＡ Ｃ Ｈ Ｅ Ｍ ＩＣ Ａ ＬＳ ｃｏｍ ｐａｎｙ。 １．１．４ 牛血清白蛋白（Ｂ ＳＡ ） 上海长阳生化制药厂 （电泳单点纯）。 １．１．５ 糜蛋白酶 上海化学试剂采购供应站（国产 分装）。 １．１．６ 戊二醛 Ｅ ．Ｍ ．Ｋ 进口分装（上海化学试剂站 分装厂）。 １．１．７ 硝酸银 成都化学试剂厂（Ｇ Ｒ ）。 １．１．８ 考 马 斯 亮 兰 Ｃ ｏｏｍ ａｓｓｉｅ Ｂ ｒｉｌｌａｎｔ Ｂ ｌｕｅ Ｒ －２５０
从实验结果可以看出， 两种蛋白质在相同含量 时， 两种染色法均显示糜蛋白酶的灵敏度明显低于 Ｂ ＳＡ ， 我们认为可能有两种 原因： 第一 ， 两种染色法 对糜蛋白酶的灵敏度本身就低于 Ｂ ＳＡ 的灵敏度。第 二， 糜蛋白酶本身不纯或在样品处理时被降解， 因 为染色时可见一着色较深的小分子条带。
本法适用于凝胶厚度为 ０．７５ｍ ｍ ， 温度为室温 ２５℃左右。我们的实验显示， 如果由于其它原因引 起着色过浅， 可重复增敏以后的步骤， 同样可得到 比较满意的结果。
２ 结果 ２．１ Ｂ ＳＡ 和糜蛋白酶经过 ＳＤ Ｓ－ＰＡ Ｇ Ｅ 后， 两种染 色 法 结 果 见 图（左 边 为 Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０ 染 色 ， 右 边 为 银 染色）
图上方数字为每种蛋白质的含量 （ｎｇ）， Ｂ ＳＡ 和
附图 两种染色法结果比较
糜蛋白的染色谱带经单独电泳染色确定。 ２．２ 由图可见： 对 Ｂ ＳＡ （Ｍ Ｗ ６７Ｋ Ｄ ）， 银染色法在其
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附表 肠球菌含 ｅｒｍ Ｂ 耐药基因分布表
名称
菌株数
红霉素耐药
表型
ｅｒｍＢ
屎肠球菌
６
＋
粪肠球菌
３
Ｒ
＋
鸡肠球菌
１
＋
因以 ｅｒｍ Ｂ 为主。大环内酯类抗生素是一类结构相 关的抗生素在核体水平上抑制细菌蛋白质的合成， 它常用于儿童肠球菌感染的治疗， 但由于肠球菌多
ＪｉａｎｇｘｉＪ．Ｍ ｅｄ Ｌａｂ Ｓｃｉ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６，Ｖ ｏｌ２４，Ｎ ｏ１
Ｂ ＳＡ 的一条杂蛋白带（图中标记 Ｂ ）的着色比糜 蛋白酶的主带（图中标记 Ｃ ）明显浅， 当 １０ 倍稀释后， Ｂ 的着色反比 Ｃ 的深， 提示银染色法对不同的蛋白 质具有不同的灵敏度。
由于杂蛋白的存在， 本法对 Ｂ ＳＡ 和糜蛋白酶的 检测限应分别在 ０．５ｎｇ 和 ５０ｎｇ 以下， 从附表中几种
江西医学检验 ２００６ 年 ２ 月 第 ２４ 卷 第 １ 期
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蛋白质凝胶电泳银染色法的改进
牛 敏 １ 陈汉芳 １ 颜英俊 ２ 尹一兵 ２
中图分类号 Ｒ４４６．１１＋２，Ｑ５０３
文献标识码 Ａ
文章编号 １００８－ ００２３（２００６）０１－ ００５５－ ０３
·实验研究·
［摘要］ 目的 探索一种快速、灵敏的蛋白质凝胶电泳银染色方法。 方法 对蛋白质凝胶电泳银染色 过程中的多种因素进行了实验探索， 在此基础上探索出一种改良的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色 法。 结果 改进方法灵敏度为 Ｃ ｏｏｍ ａｓｓｉｅ Ｂ ｒｉｌｌｉａｎｔＢ ｌｕｅ Ｒ －２５０ 法的 １００ 倍以上， 对 牛 血 清 白 蛋 白 的 检 测 限在 ０．５ｎｇ 以下， 整个染色过程不超过 ６０ｍ ｉｎ， 染色重复性好。 结论 改进后的方法比以前使用的方法简 便 、快 速 、灵 敏 、成 本 相 对 低 廉 。
作 者 单 位 ： ６１７０６７ １、四 川 攀 枝 花 市 中 心 医 院 ； ２、重 庆 医 科 大学检验系 作 者 简 介 ： 牛 敏 ， １９６５ 年 生 ， 男 ， 汉 ， 主 管 检 验 师 ， 毕 业 于 重 庆 医科大学医学检验系。
（Ｃ Ｂ Ｂ Ｒ －２５０）： 进口分装。 １．２ 方法 １．２．１ 电泳 １．２．１．１ 电泳仪 Ｂ ｉｏ－Ｒ ａｄ ｍ ｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ Ⅱ垂直板电
附表 几种方法染色时间和对 Ｂ ＳＡ 的检测限
ＯＡＫＬＥＹ 张宗玉等 蔡晓丹等 本室方法
染 色 时 间 （分）
＞７７
≥９３
＞６００
＜６０
对 ＢＳＡ 的检测限（ｎｇ） ≤１．２５
≤２
≤１
＜０．５
方法的比较可以看出， 本法具有较高的灵敏度和快 速的特点。
３ 讨论 戊二醛的作用机理现在不甚清楚， 据文献资料
泳系统。 １．２．１．２ 试剂配制及样品处理 ①样品缓冲液： 重
蒸 馏 水 ３．８ｍ ｌ； ０．５ｍ ｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－Ｈ Ｃ Ｉ（ｐＨ ６．８）１．０ｍ ｌ；丙 三 醇 ０．８ｍ ｌ； １０％ （Ｗ ／Ｖ ）ＳＤ Ｓ １．６ｍ ｌ； ２－ 巯 基 乙 醇 ０．４ｍ ｌ； １％ （Ｗ ／Ｖ ）溴酚蓝 ０．４ｍ ｌ。②电 极缓冲液（ｐＨ ８．３）： Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ ３ｇ／Ｌ； 甘氨酸 １４．４ｇ／Ｌ； ＳＤ Ｓ １ｇ／Ｌ。③样品处理： 牛 血清白蛋白 （Ｂ ＳＡ ） 和糜蛋白酶的定量用 Ｃ ｏｏｍ ａｓｓｉｅ Ｂ ｒｉｌｌｉａｎｔＢ ｌｕｅ Ｇ －２５０ 染料法， 然后用样品缓冲液定 量梯度稀释， 隔水煮沸三分钟。④制胶： 分离胶浓度 为 １２．５％ ， 浓缩胶浓 度为 ４％ ， 凝胶 厚 度 为 ０．７５ｍ ｍ 。 ⑤电泳条件： 恒压 ２００ 伏， 电泳时间约 ４５ｍ ｉｎ。
银染色的影响因素很多， 应注意染色器皿的洁 净， 试剂纯净有效， 染色过程中不可用手触摸凝胶 片， 不能让凝胶片干燥， 否则会产生非特异性着色； 背景的控制还需注意以下三点： 第一， 固定时间， 固 定液的作用除了将凝胶中的蛋白质变性固定外， 还 具有洗脱 ＳＤ Ｓ 巯基乙醇以及其它离子的作用， 在我 们的实验中， 固定时间不能低于 １０ｍ ｉｎ， 增加固定时 间对呈色无影响； 第二， 增敏后的漂洗应充分， 否则 因戊二醛的洗脱不完全而致背景加深； 第三， 使用 的乙醇应高纯度， 储存过久能产生具有还原性的乙 醛， 而使背景色加深。
［关键词］ ＳＤ Ｓ－ＰＡ Ｇ Ｅ ； 银染色； 蛋白质
银染色法仍是当今蛋白质凝胶电泳最敏感的 测定方法之一， 自 １９７９ 年 Ｓｗ ｉｔｚｅｒ［１］等报道了高灵敏 度的蛋白质凝胶电泳银染色法以来， 由于其染色机 理至今仍未阐明， 方法仍在不断完善发展中。我们 参考了国内外有关银染色法资料， 发现以前许多方 法存在费时、背景色不易控制， 有时需褪色处理［１～８］， 染色条件要求高， 试剂用量大等问题。我们结合前 人的经验， 对染色过程中的多种因素作了进一步的 探索研究， 建立了一种在本实验条件下灵敏、快速、 简便的改良染色法， 为科研及临床常规工作进行样 本（脑 脊 液 、尿 液 、羊 水 等 ）的 微 量 蛋 白 质 测 定 分 析 提 供了又一简便实用方法。
ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ： ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆｐｒｉｍ ｅｒｓ ｆｏｒ ｄｅ－ ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍ ａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ａ ｐｐ１ Ｅ ｎｖｉｒｏｎ Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１，６７：２２～３２．