凝胶色谱法的原理和方法血红蛋白的提取和分离
高二生物同步课件：5-3 血红蛋白的提取和分离(人教版选修I 44张)
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2．缓冲溶液
(1)作用
在一定范围内，抵制外界的 酸和碱 对溶液pH的影响，维持 pH 基本不变 (2)配制 由1～2种 缓冲剂 溶解于水中配制而成，通过 调节缓冲剂 的比例 就可以得到在不同pH范围内使用的缓冲液。 。
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思维导图：
深度剖析
本题考查凝胶色谱法原理。根据分子筛效应可知，相
对分子质量较大的蛋白质分子通过的路程较短，移动速度较快；
相对分子质量较小的蛋白质分子通过的路程较长，移动速度较慢。
因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量
最小的分子最后流出，故选B。 答案 B
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(3)作用
电泳利用了待分离样品中各种分子 带电性质
实现样品中 各种分子的分离 。 (4)方法
的差异及分子本身
的 大小 、 形状 的不同，使带电分子产生不同的 迁移速度 ，从而
常用的电泳方法有 琼脂糖凝胶电泳 和 聚丙烯酰胺凝胶电泳 。
测定蛋白质分子量时通常使用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 。
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层 —— 白色薄层固体；第 3层：血红蛋白的水溶液 —— 红色透明液体；
第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。
②将液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片 刻后，分出下层的红色透明液体。
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③目的：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步 对血红蛋白的纯化。
凝胶色谱法的原理和方法血红蛋白的提取和分离
凝胶色谱法的原理和方法血红蛋白的提取和分离凝胶色谱法是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，例如蛋白质、多肽和核酸等。
色谱是将混合物中的目标分子按照其不同的性质在固定相与流动相之间的相互作用上进行分离的方法。
凝胶色谱法又叫柱色谱法，它是利用固定相为凝胶的柱状体进行分离的。
1.分子筛层析：分子筛层析是一种以分子的尺寸为基础进行分离的方法。
这种方法利用孔径具有限制性能的固定相，将溶液中的分子按照其分子量大小进行分离。
分子筛层析对于相对分子量较小的分子的分离效果较高。
2.凝胶亲和层析：凝胶亲和层析是以分子之间的亲和性或特异性相互作用为基础进行分离的方法。
固定相表面上特异性结合一定类型的分子，从而实现目标分子的选择性吸附和分离。
凝胶亲和层析可以根据不同的结合模式进一步分类，例如亲和吸附、离子交换和金属络合等。
血红蛋白的提取和分离：血红蛋白是存在于红细胞中的一种蛋白质，其具有生物学功能，例如运输氧气和二氧化碳。
提取和分离血红蛋白可以用于研究血红蛋白的结构、功能和生理活性等。
血红蛋白的提取过程：1.血样准备：采集一定量的血液样本，一般采用静脉血样。
将血液收集到抗凝剂中，如EDTA管或肝素管，以防止凝血。
2.血细胞分离：离心血液样本，使红细胞和血浆分离。
血浆通常是上清液，可以留取备用。
3.溶解红细胞：将红细胞沉淀用一种溶解剂加以溶解，如生理盐水或磷酸盐缓冲液。
4.血红蛋白的提取：将溶解后的红细胞溶液进行离心，以去除不溶性物质。
离心后的上清液中含有血红蛋白。
血红蛋白的分离过程：1.凝胶色谱柱的准备：准备凝胶色谱柱，如分子筛柱或亲和层析柱，根据需要选择合适的柱子。
预先处理柱子，使其达到平衡状态。
2.样品加载：将提取得到的血红蛋白样品加载到凝胶色谱柱上。
样品与固定相之间进行相互作用，目标分子被吸附到柱子上。
3.洗脱：通过改变流动相的性质或条件，洗脱血红蛋白。
这可以通过调整溶剂的浓度、温度或pH值等方式实现。
4.分馏：通过洗脱的过程，将血红蛋白从其他杂质物质中分离出来。
血红蛋白的提取和分离
⾎红蛋⽩的提取和分离⾎红蛋⽩的提取与分离蛋⽩质的分离和提取的原理是什么？根据蛋⽩质各种特性的差异，如分⼦的形状和⼤⼩、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分⼦的亲和⼒等等，可以⽤来分离不同蛋⽩质。
【基础知识】㈠凝胶⾊谱法（分配⾊谱法）：1、概念：根据被分离蛋⽩质的，利⽤具有⽹状结构的凝胶的分⼦筛选作⽤，来分离蛋⽩质的有效⽅法。
2、原理：当不同的蛋⽩质通过凝胶时，相对的蛋⽩质容易进⼊凝胶内部的通道，路程，移动速度，⽽的蛋⽩质⽆法进⼊凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速，相对分⼦质量不同的蛋⽩质因此得以分离。
3、具体过程：A. 的蛋⽩质由于作⽤进⼊凝胶颗粒内部⽽被滞留；的蛋⽩质被排阻在凝胶颗粒外⾯，在了⾥之间迅速通过。
B.（1）混合物上柱；（2）洗脱开始，的蛋⽩质扩散进⼊凝胶颗粒内；的蛋⽩质被排阻于凝胶颗粒之外；（3）的蛋⽩质被滞留；的蛋⽩质被向下移动。
（4）不同的蛋⽩质分⼦完全分开；（5）的蛋⽩质⾏程较短，已从中洗脱出来，的蛋⽩质还在⾏进中。
㈡缓冲溶液：1、概念：在⼀定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH 发⽣明显变化的作⽤叫做缓冲作⽤，具有缓冲作⽤的溶液叫做缓冲溶液。
2、作⽤：能够抵制的对溶液的的影响，维持PH 基本不变。
3、缓冲溶液的配制通常由种缓冲剂溶解于⽔中配制⽽成。
调节缓冲剂的就可以制得使⽤的缓冲液㈢电泳：1、概念：指发⽣迁移的过程。
颗（2）（3）（4）（5） A2、原理：许多重要的⽣物⼤分⼦，如等都具有在下，这些基团会带上。
在电场的作⽤下，这些带电分⼦会向着与其移动。
电泳利⽤了待分离样品中各种分⼦以及分⼦本⾝、的不同使带电分⼦产⽣不同的，从⽽实现样品中各种分⼦的分离。
3、分类：电泳电泳。
测定（蛋⽩质相对分⼦质量）通常⽤⼗⼆烷基硫酸钠（SDS ）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋⽩质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分⼦的⼤⼩等因素。
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加⼊。
血红蛋白的提取与分离(上课用)
蒸馏水
(2)血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
(3)、分离血红蛋白溶液：
将搅拌好混合液转移到离心管内， 以2000r/min的速度离心10 min ，试 管中的溶液分为4层:
3、高温灭菌和酒精灭菌分别对蛋白
质有何种影响，作用结果是什么被破 坏？ 变性、变性、空间结构
羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
4.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA， 便于进行DNA的提取；哺乳动物的成熟 的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富，便于提取血红蛋白。
(4)透析(粗分离)：
利用透析袋透析
取( 1 )ml的血红蛋白溶液装入 透析袋 （ ）中，将透析袋放入 盛有300ml的物质的量浓度为 20mmol/L（磷酸缓冲液 ）中， pH为（ ），透析12小 7.0 时.
目的是（ 除去样品中分子量较小的杂质 ） 或用于更换样品中的（ 缓冲液 ）。 说明：透析袋是一种半透膜，能使小 分子自由进出，而大分 子不能通过。
四川省南部中学
马彦平
2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代 人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传 信息
蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。 主要是对蛋白质功能的研究
本课题学习目标
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液
④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的 凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液 体残留，蛋白质分离不彻底。 c.剪尼龙网小圆片覆盖在( 橡皮塞的凹面）上，用 （ 100目 ）的尼龙纱将橡皮塞（ 上部 ）包好， 插到玻璃管一端。 出口部位），连接 d、色谱柱下端用移液头部做（ 一细的（ 尼龙管 ）， 并用螺旋夹控制尼龙管的 （ 打开与关闭 ），另一端 放入收集（ 色谱流出液 ） 的收集器内
高中生物选修一血红蛋白的提取和分离(2)
第5．3 血红蛋白的提取和分离【学习目标】凝胶色谱法的原理和方法样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填【基础知识预习】1．凝胶色谱法凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2．缓冲溶液缓冲溶液的作用是。
缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3．电泳电泳是指。
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各分子以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。
4．蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。
【教学过程】【课题背景】：新华网首尔１２月２９日电（记者干玉兰）韩国浦项工业大学科学家２９日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的“ＴＲＩＭ５”蛋白质核心部分的结构。
浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了“ＴＲＩＭ５”蛋白质内核心部分“Ｂ３０．２／ＳＰＲＹ”的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。
研究成果发表在最新一期《分子细胞》杂志上。
2００４年英国《自然》杂志曾刊登论文说，“ＴＲＩＭ５”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。
此后，世界各地的很多科学家开始研究“ＴＲＩＭ５”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。
【凝胶色谱法的原理和方法】血红蛋白的提取和分离
【课题】：课题6 血红蛋白的提取和分离【备课人】：【备课时间】：【上课时间】：【课型】：复习【课时数】：1课时【复习目标】本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。
【复习重点与难点】复习重点：凝胶色谱法的原理和方法。
复习难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
【知识回顾】：一、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
（4）作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。
2．缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
3．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
二、实验步骤1．样品处理①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的提取和分离
血红蛋白的提取和分离1．蛋白质的分离方法(1)原理：蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
(2)分离方法：①凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②电泳法：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2．实例——血红蛋白的提取和分离(1)样品处理与粗分离(2)纯化与纯度鉴定血红蛋白提取与分离中历次“除杂质”或“分离”的原理(1)凝胶色谱法：相对分子质量较大的分子先流出，分子质量较小的后流出，依此可对血红蛋白进行分离和纯化。
(2)透析法：利用透析袋只允许小分子透出的原理，去除小分子杂质，透析可实现对血红蛋白的“粗分离”。
(3)电泳法：利用分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
即不清楚血红蛋白释放时蒸馏水和甲苯的作用红细胞中依次加入蒸馏水和甲苯的作用：加入蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破；甲苯溶解细胞膜，从而使血红蛋白释放出来。
【练一练】血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。
请根据血红蛋白的提取和分离过程回答以下问题：(1)将上述实验流程补充完整：A为____________，B为_____________。
(2)洗涤红细胞的目的是去除____________；红细胞洗涤干净的标志是__________________。
释放血红蛋白的过程中起作用的试剂是__________________。
(3)在B过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是_____________________________________________。
在蛋白质分离过程中，如果红色区带___________________________，说明色谱柱制作成功。
血红蛋白的提取和分离习题带答案
课题3 血红蛋白的提取和分离【学习目标】1、简述蛋白质提取和分离的基本原理2、理解蛋白质提取与分离的实验操作过程【重点与难点】重点：蛋白质提取和分离的基本原理难点：蛋白质提取与分离的实验操作（凝胶色谱操作）过程【知识链接】1.血红蛋白存在于何种细胞？其特性和作用分别是什么？2.为何不选用鸡血做实验材料？3.分离不同种类蛋白质的依据是什么？【自主学习内容一】基础知识（记忆）1．凝胶色谱法：凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时的速度不同，相对分子质量较小的蛋白质由于能够路程较，移动速度；而相对分子质量较大的的蛋白质，只能在移动，路程，移动速度。
2．缓冲液缓冲液通常是由1～2种缓冲剂（如NaHCO3、（NH4）2SO4）溶解于水中配制而成；其作用是。
3．电泳：电泳是指电泳利用了待分离样品中各分子以及，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是和。
在测定蛋白质分子量时通常使用，其中SDS的作用是，。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它以及等因素。
【自主学习内容二】实验操作（凝胶色谱法）1.蛋白质的提取和分离一般分四步：、、和。
2.样品处理（1）红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是采集的血样要及时通过采用的方法使红液分层，用胶头吸管吸出上层透明的黄色，将下层红细胞倒入烧杯，再加入，缓慢搅拌低速离心，如此重复三次，直到，表明红细胞忆洗涤干净。
注意：离心转速及离心时间不能过长，否则，达不到分离效果。
（2）血红蛋白的释放：原理是当外界溶液浓度低于细胞内液浓度时，细胞，红细胞由于没有的保护，而，释放出血红蛋白；使用的试剂是。
（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。
第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明的液体，这是，第4层是红细胞破碎物沉淀物（其他杂质，呈色）。
血红蛋白的提取和分离
血红蛋白的提取和分离学生班级学习目标：1.理解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
2.了解缓冲液的组成及其作用。
重点：凝胶色谱法的原理和方法。
难点：电泳法分离大分子的原理。
教学方法：启发式教学教学工具：多媒体课件教学课时：1课时教学过程基础知识蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的、所带电荷的___________、、吸附性质和对其他分子的亲和力等等来分离不同种类的蛋白质。
（一）凝胶色谱法1.概念：也称，是根据被分离的蛋白质，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离蛋白质的有效方法。
2.大多数凝胶是由化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体。
3.原理：4.具体过程：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
（二）缓冲溶液1.概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2.作用：能够抵制对溶液的pH的影响，维持pH 。
3.缓冲溶液的配制：通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。
调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。
4.在整个实验过程中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？思考：说出人体血液中缓冲液？（三）电泳1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
2.原理：电泳利用了待分离样品中各种分子带电的差异以及分子本身的，形状的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
3.分类：。
（1）琼脂糖凝胶电泳：在电场的作用下，（2）聚丙稀酰胺凝胶电泳：是由和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在的作用下聚合交联成的具有的凝胶。
（3）蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带以及__________等。
（4）为了对迁移率的影响可以在凝胶中加入。
血红蛋白的提取和分离上课用介绍
混合液
高速离心
滤纸
10min
过
分离过程
滤
烧杯
离心
管
试管中溶液层次
记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分 层顺序自上而下是： 有机溶剂-----脂类? 物质-----血红蛋白溶液 ------红细胞破碎物沉淀
甲苯层 （无色透明 ） 白色薄层固体 红色透明液体
杂质沉淀层 （暗红色）
返回
二、实验操作
3次洗涤后的结果
返回
二、实验操作
2、血红蛋白的释放
阅读思考： 1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？
目的分析： ①蒸馏水的作用是___使__红__细__胞__大__量__吸__水__胀__裂_________。 ②加入甲苯的作用是___溶__解__红__细__胞__的__细__胞__膜_________。 ③充分搅拌的目的是____加__速__红__细__胞__的__破__裂__________。
本课题学习目标
简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解 凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基 本原理。
1、主要概念： ①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④ 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
2.主要原理： ①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳 法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点： 凝胶色谱法的原理和方法
血红蛋白
两个 α －肽链 两个 β 一肽链 四个亚铁红素基团
二、实验操作
1、红细胞的洗涤
阅读思考：洗涤的目的是什么？（ P69：操作提示 ） 洗涤过程：
3g柠檬酸钠
吸出血浆 5倍体积生理盐水
血液 100mL
《血红蛋白的提取和分离》 讲义
《血红蛋白的提取和分离》讲义一、血红蛋白的简介血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
它存在于红细胞中，使血液呈现红色。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，其功能主要是将氧气从肺部输送到身体的各个组织，并将二氧化碳从组织带回肺部排出。
了解血红蛋白的结构和功能对于我们进行其提取和分离的研究具有重要意义。
二、血红蛋白提取和分离的原理1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当不同相对分子质量的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
这样，相对分子质量不同的蛋白质就得以分离。
2、电泳法电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
在一定的 pH 下，蛋白质分子会带上电荷，由于不同蛋白质分子所带电荷的性质和数量不同，以及分子大小不同，在电场中的迁移速度也就不同，从而实现蛋白质的分离。
三、血红蛋白提取和分离的实验材料和用具1、实验材料新鲜的血液（通常选用哺乳动物的血液，如猪、牛等）2、实验用具（1）色谱柱：用于凝胶色谱法分离血红蛋白。
（2）电泳装置：包括电泳槽、电源等，用于电泳分离。
（3）离心机：用于离心分离血细胞和血浆。
（4）透析袋：用于去除小分子杂质。
四、血红蛋白提取和分离的实验步骤1、样品处理（1）采集新鲜血液，加入柠檬酸钠防止血液凝固。
（2）低速短时间离心，将血液分为血浆和血细胞两部分。
（3）向血细胞中加入蒸馏水，使红细胞吸水涨破，释放出血红蛋白。
2、粗分离（1）将混合液高速长时间离心，除去细胞膜等杂质，得到血红蛋白溶液。
（2）将血红蛋白溶液装入透析袋中，放入磷酸缓冲液中透析，以除去小分子杂质。
3、纯化（1）凝胶色谱操作装填凝胶色谱柱：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，避免出现气泡。
血红蛋白的提取和分离自制
端时，用试管搜集流出液，每（ 5ml ） 搜集一试管连续搜集
血红蛋白的提取和分离自制
第57页
开始进行层析
血红蛋白的提取和分离自制
第58页
搜集得到纯化后蛋白
血红蛋白的提取和分离自制
第59页
试验录像
血红蛋白的提取和分离自制
血红蛋白的提取和分离自制
第17页
原理: 当不一样蛋白质经过凝胶时
相对分子质量较小 轻易进入
凝胶内部通道
相对分子质量较大
无法进入凝胶 内部通道
只能在凝胶外部移动
旅程较长 移动速度较慢
旅程较短 移动速度较快
相对分子质量不一样蛋白质所以得以分离。
血红蛋白的提取和分离自制
第18页
血红蛋白的提取和分离自制
SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物,
SDS所带负电荷量大大超出了蛋白质分子原有
电荷量。因而掩盖了不一样种蛋白质间电荷
差异, 使电泳迁移率完全取决于
(
分子大小
)。
血红蛋白的提取和分离自制
第28页
电泳检测PCR结果
血红蛋白的提取和分离自制
琼脂糖凝胶电泳
第29页
课堂小结:
血红蛋白的提取和分离自制
第43页
4.透析：装入透析袋并置 于磷酸缓冲液中（PH为7.0） 透析。
血红蛋白的提取和分离自制
第44页
血红蛋白的提取和分离自制
第45页
利用透析袋透析
血红蛋白的提取和分离自制
第46页
血红蛋白的提取和分离自制
第47页
二、凝胶色谱纯化
血红蛋白的提取和分离自制
高一生物血红蛋白的提取和分离介绍
高一生物血红蛋白的提取和分离介绍高一主要学习的内容是细胞，学生需要知道和掌握这些的知识，下面是店铺给大家带来的有关于血红蛋白的提取和分离知识点的介绍，希望能够帮助到大家。
高一生物血红蛋白的提取和分离知识点该知识点包括凝胶色谱法、缓冲溶液、电泳、实验操作及操作提示等几个要点知识。
1. 凝胶色谱法：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
凝胶实际上是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质比较容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2. 缓冲溶液：缓冲溶液的作用是能够抵制外界的酸和碱对溶液pH 的影响，维持pH基本不变。
缓冲溶液通常由1-2种缓冲溶剂溶解于水中配制而成的。
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是7.35～7.45，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3.电泳：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物大分子，如蛋白质、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率取决于蛋白质所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
4. 实验操作及操作提示：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
血红蛋白的提取和分离
本课题学习要点和难点
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
3、课题要点：凝胶色谱法旳原理和措施 4、课题难点：
①样品旳预处理 ②色谱柱填料旳处理和色谱柱旳装填。
2023年4月14日宣告人类基因组序列图完毕，这标志着进入了后基因组和蛋 白质组时代
2、你装填旳凝胶色谱柱是否有气泡产生？你旳色谱 柱装填得成功吗？你是怎样判断旳？
因为凝胶是一种半透明旳介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与 凝胶柱垂直旳日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。另外，还能够 加入大分子旳有色物质，例如蓝色葡聚糖—2023或红色葡聚糖， 观察色带移动旳情况。假如色带均匀、狭窄、平整，阐明凝胶色 谱柱旳性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
血红蛋白的提取和分 离
本课题学习目的
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④ 它们在血红蛋白旳提取中分别起到什么作用。
2. 主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质旳原理
②电泳法分离样品旳原理
③缓冲溶液旳构成和作用机理
④洗脱：小心加入pH=7.0 旳20mmol/l旳磷酸缓冲液到合 适高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤搜集：待红色旳蛋白质接近色谱柱底端时，用试管搜集流 出液，每5ml搜集一试管，连续搜集。（在分离过程中，假如 红色区带均匀一致旳移动，阐明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确旳加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。
装配好旳凝胶柱
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【课题】：课题6 血红蛋白的提取和分离【备课人】：
【备课时间】：【上课时间】：
【课型】：复习【课时数】：1课时
【复习目标】
本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。
【复习重点与难点】
复习重点：凝胶色谱法的原理和方法。
复习难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
【知识回顾】：
一、实验原理
蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．凝胶色谱法（分配色谱法）：
（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
（4）作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。
2．缓冲溶液
（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
3．凝胶电泳法：
（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
二、实验步骤
1．样品处理
①红细胞的洗涤
洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
②血红蛋白的释放
在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。
加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
2．粗分离
①分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。
第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
②透析
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。
透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
3．纯化
调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝↓胶面平齐，关闭出口。
加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。
加样后，∣打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，
↓关闭出口。
调节缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度
↓
洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
↓
收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。
4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）
三、注意事项
1.电泳技术
电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
2. 红细胞的洗涤
如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。
此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。
此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。
如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。
如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀？
如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的
不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。
6．G-75
“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。
7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密
8．加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。
其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。
这使血
红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
10．如何检测血红蛋白的分离是否成功
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
【典例解析】
用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（）
A路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快
【习题巩固】
一．选择题
1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。
A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度
2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。
A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度
3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。
A相同 B相反 C相对 D相向
4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。
A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白
5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。
A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞
6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。
A. NaCl
B.甲苯
C.蒸馏水
D.柠檬酸钠
7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（）
A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物
二．非选择题
1．电泳利用了待分离样品中各种分子以及、的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
2．你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
课题6 例题D BBBACDC
1答案：带电性质的差异；分子本身的大小；形状的不同
2答案：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步。
包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；在经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。