抗体的制备与应用.ppt

不稳定、产量低、人体不能随意免疫 3、现代免疫学和分子生物学技术的推动 4、基因工程抗体的优点
基因工程抗体的优点：
易于获得稀有抗体; 人抗鼠抗体反应（Human anti－mouse
antibody reaciton, HAMAR）低; 小分子抗体：渗透力强、HAMAR低、亲和
制备流程：免疫原（佐剂）免疫动物，分离抗血清， 鉴定，保存。
多克隆抗体的制备流程
抗原 免疫
传统抗血清 （多克隆抗体）
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 細胞
31 2 4
多克隆抗体的优缺点
优点：
制备流程简便，操作技术要求低； 制备周期短，一个月左右就能获得目的抗体；
C区的功能
• 激活补体 Immune complex（IC） 激活补体经典途径
• 与细胞表面FcR结合 1）调理作用（opsonization)；
IgG 或IgM的Fc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬；
2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 （Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)
嵌合抗体
3、嵌和抗体的优缺点：
优点：
特异性强 亲和性高 具有全抗体的所有功能 半衰期长、疗效显著
缺点：
有10－50%发生HAMA 靶向性差
（二）人源化抗体（humanized antibody）
1、概念 指利用基因工程技术，在嵌合抗体基础上，针对嵌合抗体仍然具有 较高的HAMA反应的问题，进一步对抗体进行CDR及FR区域置换。 通过这种方式获得的抗体人源部分可达97%，又称为CDR移植抗体 （CDR grafting antibody）。
杂交瘤技术的原理
1.亲本细胞的选择
－小鼠骨髓瘤细胞：不产生Ig的重链和轻链； HGPRT-;TK-；与提供淋巴细胞的动物品系相 同。能永生化。
－免疫脾细胞：经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏。 不能永生化，但能分泌抗体。
2. 细胞融合
骨髓瘤细胞
PEG
杂交瘤细胞
脾细胞 融合后细胞的类型:
未融合的脾细胞 杂交瘤细胞 未融合的瘤细胞
基本原理：利用分子生物学技术分离纯化抗体基因或基因片段，在 最大限度保留其抗原结合活性，降低其异源性的原则指导下，按临 床或科研需要对抗体基因进行拼接组装，在转化适当的受体细胞表 达，制备具有不同大小和不同功能的抗体。
基因工程抗体产生的时代背景
1、单克隆抗体的毒副作用 2、人杂交瘤技术未获真正突破:融合率低、建株难、
4、杂交瘤细胞的筛选和克隆化
筛选： 免疫荧光 ELISA等
克隆化： 有限稀释法 单个细胞显微操作法 软琼脂培养法
5. 杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液 (30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、 复苏
MRU）
（一）Fab抗体
由V链的VH、CH1及完整的L链构成
优点：
分子小，HAMAR低 亲和性高 靶向性高于McAb
缺点：
仍然有一定的HAMAR发生 靶向性不如ScFv 稳定性差
（二）单链抗体（ScFv）
概念 是指通过特定的方法将抗体分子VH和VL连接在一起构成的只
通过同源蛋白三维结构模建技术预测抗体可变区三 维结构后，对鼠及人VH、VL表面容易引起较强 免疫反应的氨基酸进行比较分析，进行人源化分 子设计。
二、基因工程小分子抗体
小分子抗体
1．Fab 抗体片段 2．单链抗体（single chain Fv, ScFv） 3．单域抗体（single domain antibody） 4．分子识别单位（molecular recognization unit,
多价微型抗体
双链抗体（diabody） 微型抗体(minibody) 三链抗体(triabody)
新型抗体分子
新效能抗体 双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb） 胞内抗体（intrabody） 免疫黏连素（immunoadhesin） 催化抗体（catalytic antibody）
3) 介导I型超敏反应 IgE的Fc段与肥大细胞表面FcR结合受体桥联细胞活化
• 穿过胎盘和粘膜 IgG通过胎盘；sIgA穿过粘膜
主要内容
概述 多克隆抗体的制备与应用 单克隆抗体的制备与应用 基因工程抗体的制备与应用
概述
第一代抗体：多克隆抗体(polyclonal antibody， PcAb)
抗体为全Ig，相对分子量过大，难以穿透实体肿瘤 组织，达不到有效杀伤浓度。
单克隆抗体在医学上的应用
（一）用作诊断试剂
1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化 阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。 2.鉴定病原体，准确诊断传染病。 3.用于肿瘤的诊断和分型 4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态
第二代抗体：单克隆抗体(monoclonal antibody， McAb)
第三代抗体：基因工程抗体(genetic engineering antibody，GeAb)
姓名
国籍
获奖时间 主要研究成果
Behrin
德国/日本 1901
抗毒素
Ehrlich, Metchaikoff
德国/俄国
1908
效价高
使用一种抗原免疫动物，可以获得针对不同抗 原决定基的不同特异性的McAb。
杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖、传代，因此 产量高，可连续生产
缺点：
制备McAb成本昂贵，制备流程长，操作烦琐，技 术要求较高。
McAb为鼠源性，应用于人体将产生人抗鼠抗体 （Human anti-mouse antibody, HAMA）, 治疗中 可能引起过敏反应且疗效大大降低。
概念：通过小鼠杂交瘤细胞和单克隆抗体技术生产的 抗体。这种杂交瘤细胞既具有骨髓细胞能大量无限增 殖的特性，又具有B细胞合成和分泌抗体的能力。每 一个杂交瘤单克隆是用一个B细胞融合而产生的克隆， 因此，由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的 抗体，称为单克隆抗体。
制备流程：免疫—融合—筛选
单克隆抗体制备流程
3.杂交瘤细胞的筛选
采用筛选培养基：HAT培养基 H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶
只有融合成功的细胞（杂交瘤）才能在HAT 培养基上长期A合成途径
内源性途径（主要途径） 利用谷氨酰胺（Gln）或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原
酶的催化下合成DNA (氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，因此能有效阻
性高、靶向性高、组织非特结合少等。
基因工程抗体的分类
1、全抗体
（1）嵌和抗体（chimeric antibody） （2）人源化抗体（humanized antibody）
2、小分子抗体
（1）Fab （2）ScFv （3）单域抗体 （4）分子识别单位
3、其它抗体
T细胞决定基（T细胞表位）：T细胞决定基主 要位于抗原分子内部，必须由APC将抗原加工 处理为小分子多肽并与MHC分子结合，然后才 能被TCR所识别。
B细胞决定基（B细胞表位）：BCR能直接识别 未经APC加工的天然抗原，其识别的B细胞表 位主要位于抗原分子的表面，与BCR具有易接 近性。
Antibody Structure and Function
6. 单克隆抗体的生产 体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水 体外：无血清培养基悬浮培养等
7. 单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法
离子交换层析 A蛋白-Sepharose亲和层析
单克隆抗体（McAb）的优缺点
优点：
成分、结构均一，特异性强。一种McAb分子的 所有区域完全相同，只针对一种抗原决定基， 避免了交叉反应。
抗体的制备与应用
抗原决定基-抗原特异性的分子基础
抗原决定基（antigenic determinant) 指抗原分子中决定抗原特异性 的特殊化学基团。是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有 特异性的物质基础。也称为表位(epitope)。
抗原决定基的位置、数目和空间结构决定抗原特异性。
根据抗原决定基由TCR还是BCR识别分类
抗体形成
Porter, Edelman
英国/美国 1972
抗体单体的结构
Kohler, Mistein
利根川进
德国/阿根廷 1984
日本
1987
单克隆抗体
抗体多样性机制及遗 传学基础
第一节 多克隆抗体的制备与应用 （polyclonal antibody，PcAb)
概念：采用含有多种抗原决定基(B细胞表位)的抗原 免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗 原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上 是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。
缺点：
制备的抗体是针对多种抗原决定基的混合物，特异性 不高，易出现交叉反应；
抗体来源于动物，应用于人体会产生严重的过敏反应。
应用：主要用于免疫学检测，被动免疫治疗和紧急预防。 其缺点限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。
Cross reaction
A
抗A
Same epitope
B
抗B
第二节 单克隆抗体的制备与应用 (monoclonal antibody，McAb)
2、原理 首先利用计算机模建技术，模拟抗体立体结构。再根据同源性原理 从人抗体基因库中筛选人FR序列。通过分子模拟技术鉴别出与抗 原结合位点密切相关的鼠单抗FR上氨基酸残基，将这些残基与 CDR重组并一同移植到人FR上。