第十节 基因工程药物制造实例

三、质量控制标准和要求 • 1、半成品检定 效价测定、蛋白质含量测定、活性测定、比活性 测定、纯度测定、相对分子量测定、核酸含量测 定、鼠IgG含量测定、等电点测定、无菌试验、热 源质试验等。 （1）、效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基 本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校 准为国际单位。
三、质量控制标准和要求
• 取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按 人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天， 若动物全部存活，说明成品合格。
三、质量控制标准和要求
二、基因工程干扰素的制备
• 用100毫升含8摩尔每升尿素、20毫摩尔每升磷酸 缓冲液（pH7.0）、0.5毫摩尔每升二巯基苏糖醇 的溶液，室温搅拌抽提2小时，然后用15000转每 分离心，30分，取上清夜，用20毫摩尔每升磷酸 缓冲液（pH7.0）稀释至尿素浓度为0.5毫摩尔每 升，加二巯基苏糖醇至0.1毫摩尔每升，4℃搅拌， 15小时，15000转每分，离心30分除去不溶物。上 清夜经截流量为10000相对分子量的中空纤维超滤 器浓缩，将浓缩的人干扰素α2b溶液经过 Sephadex D50 分离，
三、质量控制标准和要求
• （12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试 验和热源质试验。 • 2、成品检定 外观、活性、水分、无菌试验、安全毒性、热源 质。 （1）、物理性状，冻干品白色或微黄色疏松体， 加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。 （2）、鉴别试验，应用ELISA或中和试验检定。 （3）、水分测定，用卡氏法，应低于3%。
二、基因工程干扰素的制备 • 同时每隔不同时间取2毫升发酵液，10000转每分 离心除去上清夜，称量菌体重量。 2、产物的提取和纯化
发酵完毕后，冷却，进行4000转每分离心，离心 30分，得湿菌体1000克左右。取100克湿菌体重 新悬浮于500毫升20毫摩尔每升磷酸缓冲液中 （pH7.0），于冰浴条件下进行超声波破碎，然 后4000转每分，离心30分，取沉淀部分，
第十节 基因工程药物制造实例
• 干扰素（interferon IFN）是人体细胞分泌的一 种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免 疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。 根据其结构可分为α、β、γ、ω等4个类型。α 干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型， 其区别在于个别氨基酸的差异上，早期干扰素是 用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵， 不能满足需要，现在可利用基因工程技术并在大 肠杆菌中发酵、表达来进行生产。
•
三、质量控制标准和要求
• （2）、蛋白质含量测定，福林-酚法，以中国药 品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。 • （3）、比活性，效价的国际单位与蛋白质含量的 毫克数之比。 （4）、纯度，电泳纯度用非还原型SDS-PAGE 法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度 应在95%以上。
三、质量控制标准和要求
二、基因工程干扰素的制备 • 作为发酵罐种子，用15升发酵罐进行发酵，发酵 培养基的装量为10升，发酵培养基由1%蛋白胨、 0.5%酵母提取物、0.01%氯化铵、0.05%氯化钠、 0.6%磷酸氢二钠、0.001%氯化钙、0.3%磷酸二 氢钾0.01%硫酸镁、0.4%葡萄糖、50毫克每毫升 氨苄青霉素、少量防泡剂组成，pH6.8。转速500 转每分，通气量为1：1溶氧为50%。30℃发酵8 小时，然后在42℃诱导2-3小时完成发酵。
• （5）、相对分子量测定，还原型SDS-PAGE，
加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋 白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分 子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与 理论值比较，误差不得高于10%。 • （6）、残余外源性DNA含量测定，用放射性核 素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性 DNA应低于100pg。
三、质量控制标准和要求
• （4）、无菌试验，同半成品。 （5）、热源质试验，同半成品检定。 （6）、干扰素效价测定，同半成品检定，效价不 应低于标示量。 （7）、安全试验，取体重为350-400克豚鼠3只， 每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用 最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏 死、总体重不下降，说明成品合格。
三、质量控制标准和要求
• （7）、残余血清IgG含量测定，在应用抗体亲和 层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。 （8）、残余抗生素活性测定，半成品中不应有抗 生素活性存在。 （9）、紫外光谱扫描，检查半成品的光谱吸收值， 最大吸收值应在280纳米加减2纳米。 （10）、肽图测定， 用CNBr裂解法，测定结果 应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。 （11）、等电点测定，等电聚焦电泳。
一、基因工程菌的组建 • 目的基因的获得：将生产干扰素的白细胞的mRNA 分级分离，然后将不同部分的mRNA注入蟾蜍的卵 母细胞，并测定合成干扰素的抗病毒活性，结果 发现12SmRNA的活性最高，因此用这部分mRNA合成 cDNA。将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗 性基因的质粒pBR322中，转化大肠杆菌K12，的几 千个重组子克隆，每个克隆都用粗提的干扰素的 mRNA去进行杂交，把得到的杂交阳性克隆中的重 组质粒DNA放到一个无细胞蛋白合成体系中进行翻 译，
二、基因工程干扰素的制备
• 层析柱2厘米*100厘米，先用20毫摩尔每升磷酸缓 冲液（pH7.0）平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分 离，收集人干扰素α2b部分，经SDS-PAGE检查。 将Sephadex D50柱分离的人干扰素α2b组分，再 经DE-52柱（2厘米*50厘米）纯化人干扰素α2b组 分，上柱后用含0.05、0.1、0.15摩尔每升氯化钠 的20毫摩尔每升磷酸缓冲液（pH7.0）分别洗涤， 收集含人干扰素α2b的洗脱液。全过程蛋白回收 率为20-25%，产品不含杂蛋白，DNA及热源含量合 格。
一、基因工程菌的组建
• 对每一个翻译体系的产物进行抗病毒的干扰素活 性检测，经过多轮筛选获得了产生干扰素的cDNA， 最后将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体中， 转化大肠杆菌进行高效表达。
•
二、基因工程干扰素的制备 • 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 源自文库品检定 成品包装 • 1、发酵 人干扰素α2b基因工程菌为SW-IFNα-2b/E.coli DH5α, PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因，种子 培养基 含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯 化钠。 分别接种人干扰素α2b基因工程菌到4个装有250 毫升种子培养基的1000毫升摇瓶中，30℃培养10 小时，