甲型肝炎病毒检测方法研究进展

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旅 行 医 学科 学 ２ ０ ０ ７年 ９月 第 ｌ 第 ３期 Ｓ ｉｎｅｏ Ｔａ ｅＭ ｅｉｉｅＳ ｏ ２ ０ ． ｏ． ３ ． ３卷 ｃｅｃ ｆ ｒｖ ｌ ｄｃ ． ｅ ． ０ ７Ｖ １１ ３ ｎ Ｎｏ
应扩增病毒核酸特异性片段、扩增产物的检测和 扩增产物的鉴定。这类方法中，需要改进和完善 的关键点表现在 ３ 个方面： 如何简便、快速 、有 １ ）
甲型 病毒 性肝 炎简 称 甲型肝 炎 ，是 由甲型 肝 炎病 毒 （ Ｖ）引起 的一种 肠道 传染 病 。呈全 世 ＨＡ 界 范 围的分布 ，我 国为高发 区之 一，其发 病 为各 型肝 炎 的首位 。１ ９ ～ ０ １年 间 《 病监 测 》中 ９ ３ ２０ 疾 全 国 乙类 传染病 疫 情动 态情 况简 介提 供 的数据 显
２２ Ｅ ＩＡ方 法 有 以 下 任 何 一 项 可 确 诊 为 ． ＬＳ
《ＤＡ细菌 分析 学手册 》第 八版 中有 关 贝类 Ｆ 样 品 中 甲肝 病毒 的检测 方法 ，是 国 内外 最早 的官 方 标准 方法 。这 一方法 并未将 病 毒与 贝类组 织分 离 后再进 行病 毒 富集 ，而是将 贝类 样 品匀浆后 ， 使用 有机 溶剂 直接提 取Ｒ ＮＡ。这样得 到 的提取 液 中大 多 为 贝类 组织 的Ｒ ＮＡ，病 毒Ｒ ＮＡ含 量极 低 。 而且 ， 一些 蛋 白和 类脂 类物质 可 能是Ｒ －Ｃ 抑 制 ＴＰ Ｒ 剂 。因此 ，这种 方法 的检测 灵 敏度仅 为 ２ ０ ００病 毒 颗 粒 ／克 贝 组 织 。 Ｍａｋ Ｓ ｂｙ 和 ｒＤ．ｏｅ Ｌ ｅ １Ｊｙ ｕ等 人报 道【：使 用 缓冲液 和Ｐ Ｇ ｅ． ｎａｋ ｓ １ Ｊ Ｅ 将 病 毒从 贝类 样 品中洗脱 并沉 降 下来 ，再从此 病 毒 悬 液 中提取Ｒ ＮＡ。 这种 方法 的优 点是 ： 病毒 与 贝 将 类 组织初 步 分离并 使病 毒得 到富集 ：一 方面 ，减 少 了贝类 中蛋 白和 脂肪 对 Ｒ －Ｃ 的干扰 ； ＴＰ Ｒ 另一 方 面 ，样 品总 体积 从 １５ 浓缩 至几 ｍ ７ｍＬ Ｌ， 富集
ｆｏ ｆ ｏ ， ｎ ｉ ｇ ｏ ｉ ｏ ｅ ａｉ ｓ ｂ ＬＩ Ａ ｎ ｅ ｅｃ ｉ ｒ ｕ ｒ ｍ ｏ ｄ ａ ｄ ｄ ａ ｎ ｓｓ ｆｈ ｐ ｔ ｉ ｙ Ｅ Ｓ ａ ｄ ｇ ｎ ｈ ｐ ｗｅ ｅ ｓ ｍｍ ａｉ ｅ ． ｔ Ａ ｒｚ ｄ
【 ｙ ｒ ｓ Ｈｅａｉｓ ｖｒｓＥ ｉｌｇ ； Ｌ Ｓ Ｇｅｅｃｉ； ｏ ｄ Ｋｅ ｄ】 ｗｏ ｐ ｔｉＡ ｕ； ｔ ｏ ｙ Ｅ ＩＡ； ｎ ｐ Ｆ ｏ ｔ ｉ ｏ ｈ
中图 分 类 号 ： １． Ｒ ５２６
文 献标 识 码 ： Ｂ
【 述 】 综
甲型肝 炎病毒检测方法研 究进 展
王 静 （ 连云港 出入境检 验检 疫局 ，连 云港 ２ ０ ４ ） ２ ０２
【 摘要 】 本文综述 了甲型肝炎病毒 的病原学 、食品 中甲肝病毒检测情况 、 Ｌ Ｓ Ｅ ＩＡ方法和基因芯 片检测 甲肝病毒研究进展 。 【 关键词 】 甲型肝 炎病毒 ；病 原学；Ｅ ＩＡ；基因芯片 ；食品 ＬＳ
特 异和 灵敏 度 高的特 点 ，能检 测到 １， ０个 拷 贝 ０－ － ４
的病毒 核酸 。整 个检 测过 程 可分 为 ５个阶段 ：从 样 品 中富集 病毒 、病 毒 Ｒ ＮＡ 的提 取 、Ｒ －Ｃ 反 ＴＰ Ｒ
【 者简介】 王静 （９ ３ ） 作 １８ 一 ，女，江苏连云港人 ，本科 ，主要 从事传染病监测 工作。
效地 从 各种食 品介质 中提 取和 富集 病 毒 ；２食 品 ）
中存 在 的 Ｒ － Ｃ ＴＰ Ｒ抑 制剂 随病 毒 Ｒ ＮＡ一起 被提取 出来 ，会大 大 降低反 应 的灵敏度 ，如 何减 少它 们
苏氨 酸缓 冲液 ，涡流 混匀 后再 提取 一次 。此 步骤
可 以增加 ＨＡ 回收 率 ，具体 数字 未见报 道 。运 Ｖ 用 此 方 法 富集 病 毒并使 用 硅 胶膜 法 提取 Ｒ ＮＡ， Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ法 结合 Ｓ ｕｈｒ杂交 法进 行检 测 ， ｏｔｅ 整个 方 法 的灵 敏 度 为 １个 Ｐ Ｕ 的 Ｈ Ｗ 克 牡蛎 。 Ｆ Ａ Ｒ ｂｅＬＡｔ ｒ等 人在 进 行 贝类 中病 毒检 测 时只 ｏｒｔ． ｍａ
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旅行医学科学 ２０ ０ ７年 ９月第 １ ３卷 第 ３期 Ｓ ｉｎ ｅ ｆ ｒｖ ｌ ｄｃ ｅ Ｓ ２ Ｑ ， ｏ． ３ ｃｅｃ Ｔ ａｅ Ｍｅｉｉ ． 鼬． ！ Ｖ ！１． ． ｏ ｎ ３
文 章 编 号 ：１０ ．１ ９（ ０ ７ ０ ．０ ．３ ０ ６７ ５ ２ ０ ） ３０ １ ０
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Ｈ ＶＡｇ Ａ － 滴度 ，Ｈ Ｖ感 染 性滴 度 。该 方法 适 用 于 Ａ 甲肝疫 苗 的检定 工作 。 ２３ 基 因芯 片检测 自 １９ － ９ ５年 第 一篇相 关文献 报 道 以来 ，基 因 芯片技 术 因其 信 息量大 、高 效 、 快速 、准确等优 点 ，在 许 多领 域得 到 了广泛 应用
示 ：中 国平 均每 年 ２ ４万人 罹 患 甲型肝 炎 ， 发病 率
高达 ２ ．／０ 万 。专家 估计 实 际情况 远 高于统 计 １ １ ４
数字 ，每 年病 毒性 肝炎 的患 者可 能为 ２０万 ，而 ４
甲型 肝炎 就 占一半 左右 ，达 １ ０万／ 。我 国人 群 ２ 年 甲肝 抗体 感染 率约 为 ８ ，由于 人对 甲肝 普遍 易 ０ 感 以及 甲肝病毒 在 人群 中 的连续传 播 ，经 常发 生 流行 是 甲肝 的显著特 征 。为 了做 好防 治工 作 ，准 确 、快速 检验 是关 键 。现 将 近几 年来 对 甲肝检 测
的进 展综述 如 下 ： １ 病 原学
甲型肝 炎病 毒 （ Ａ Ｈ Ｖ）是 一种 正链 Ｒ ＮＡ 病 毒 ，属微 小 Ｒ ＮＡ 病毒 科 肝病毒 属 。Ｈ Ｖ 具有 以 Ａ 下特 点 ：嗜肝性 ；细胞培养 周期长 ，一般 不引 起 细胞病 变 ； 毒位 于细 胞 内 ， 病 很少 释放 至细 胞外 ； 耐热 ，６ ℃ １小 时仍 有传 染 性 。Ｈ Ｖ Ｒ ．Ａ ＩＭ阳性 ；Ⅱ． Ａ ． Ｈ Ｖ ｇ 病 程 中抗． Ｖ ＩＧ 四倍 以上 增长 ；Ｉ 粪便 经 免 ＨＡ 有 ｇ Ⅱ． 疫 电镜 找 到 ｗ 颗 粒 或 用 Ｅ ＩＡ法 检 出Ｈ ＬＳ ＡＶ抗 原 ；Ⅳ 血清 或粪 便 中检 出 Ｈ Ｖ 的 Ｒ Ａ ＮＡ。龙润 乡Ｌ等 将 Ｈ Ｖ ｇ Ａ 诊 断 试剂 盒 用 Ｈ Ｖ Ａ 标 ３ Ｊ Ａ ＩＭ． ｂ Ａ －ｇ
取 贝 的 胃肠 组织 ，一般 为 １ ｇ ． ，而不 是整个 贝进 ５
的 抑 制 作 用 ； ３选 择 检 测 范 围 广 的 引 物 提 高 ）
Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ反应 的灵敏度 和特 异性 。
行匀 浆 ，这样 可使 样 品体 积控 制在 ５ｍＬ 以内 ， ０ 操 作更加 方便 。使 用此 富集 方法 ，用硅 胶膜柱 法 提取 Ｒ ＮＡ，Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ法扩 增 ，琼脂糖 凝胶 法观 察 结果 ， 可检 测 到 ００ ． ６个 Ｔ Ｉ 的 Ｈ Ｖ／．ｇ贝类 。 ＣＤ Ａ １ ５
３ ４代才 能 出现 可 见病变 ，且食 品 中往 往病 毒含 ￣
量 很低 ， 因此 ，用 培养 法往 往 需要 ３ ～ ０天 才 能 ０６ 分 离 出 甲肝 病毒 ，不 适用 于食 品中 甲肝 病毒 的检 测 。 目前 ，美 国 、 日本和 澳大 利亚 等 国家普 遍采 用 Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ方 法进 行食 品 中 Ｈ Ｖ 的检验 。 Ａ 该方法 通 过对病 毒 目标基 因片段 的扩 增进 行检 测 ，具有
组只含 ３ ％鸟嘌 呤和 腺嘌 呤核 苷酸 ，远低 于其 他 ８
肠道病 毒 。ＨＡ Ｖ在 体外 组织 培养 成 功 。主要 在 肝
实质 细胞 中复制 ，尚未证 明在 其他 组 织 中复制 。
目前 只有 １ 个血 清 型和 １ 抗原 抗体 系统 。 个 １８ ９ １年 Ｈ Ｖ 部分基 因组 互 补 Ｄ Ａ ＮＡ （Ｄ ｃ ＮＡ） 已
准 品调控 灵敏 度后 ，用 于检测 Ｈ Ｖ Ａｇ Ａ － ，并 比较
快速 检测 法和 常规过 夜法 两种 检测 方法 的测 定效 果 ， 以选 择在 甲肝 疫苗生 产 中，抗 原检测 的合 适 方法 。 过调 控 灵敏度 后 ， ＨＡ ＩＭ诊 断试剂 经 抗 Ｖ ｇ
盒完 全 可 以用来 检 ￣ Ｈ Ｖ Ａｇ 并可 以正确 评 价 Ｊ ＩＡ － 。
Ｊ
。
后的病毒悬液中病毒浓度大大提 高。这是由于当 导 电率小 于 ２ ０ ｐ ，ｐ ＇ ５０ 时 ，病 毒吸 附 ０ ０ Ｓ Ｈｄ 于 ．
于匀 浆后 的 贝类 组织 ，离心 后沉 淀下 来 ，而上 清 中 的大量 蛋 白被 除去 。且 等体 积Ｆｅｏ 提取 可 除 ｒｚｎ 去 贝类 组织 中的类 脂类 Ｒ －Ｃ 抑制 剂 。 ＴＰ Ｒ 为进 一步 提 高 检测 的灵 敏度 ，Ｍａｋ Ｓｂｙ ｒＤ．ｏ ｅ 和Ｙ． ．ａｏＳ ｉ ［等 人 ２ ０ ＳＣ ｒｌｈｅ ２ ｈ］ ０ １年 对 此 方 法 进 行 了改进 。 体改进 内容 如 下： 具 将病毒 吸 附于 贝组织 的ｐ ｎ确定 为 ４８５０ ． ．。用ＨＡ ￣ Ｖ进行 的病 毒回 收率 实验 表 明 ，在此 条件 下 ，９％病 毒有 效 的吸 附于 ８ 贝类 组织 颗粒 上 ，上清 中损 失 的Ｈ Ｖ只 有 ２ Ａ ％。 将上 述步 骤 中的沉淀 用苏 氨酸 缓冲液 重新 洗涤 ，