【CN109576398A】一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法【专利】
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( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910028897 .1
(22)申请日 2019 .01 .12
(71)申请人 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店埔 档
(72)发明人 万春和 黄瑜 陈翠腾 施少华 傅光华 程龙飞 刘荣昌 陈红梅 傅秋玲
发明内容 [0004] 本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法，可以准确快速的判别 病料中是否含有鸭2型甲肝病毒。 [0005] 为实现上述技术方案，采用以下技术方案：
3
CN 109576Байду номын сангаас98 A
说 明 书
2/4 页
一种用于检测鸭2型甲肝病毒的引物对，所述引物如下所示： DHAV-2F：5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’； DHAV-2R：5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’； 目的片段大小为391 bp。 [0006] 鸭2型甲肝病毒检测试剂盒，其包含权利要求1所述的引物对。 [0007] 所述试剂盒的使用方法包括如下： （1）鸭2型甲肝病毒阳性对照和阴性对照； （2）鸭2型甲肝病毒引物对： DHAV-2F：5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’； DHAV-2R：5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’； （3）反转录：提取的核酸（RNA）5μL，0 .1μg/uL随机引物1μL，2× TSⅡ Reaction Mix 10 μL，TransScript Ⅱ RT/RI Enzyme Mix 1μL，gDNA Remover 1μL，Rnase-Free 水2μL，至总 体积20μL。50℃反转录30 min，85℃加热5s使酶失活，-80℃保存备用。 [0008] （4）PCR反应：2×DreamTaq Green PCR Master Mix 25μL，10 μmol/L上/下游引物 各1 μL，模板1 μL，去离子水22 μL，至总体积50μL。反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、55℃ 30 s、72 ℃ 30s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。 [0009] （5）结果判定：对扩增产物进行电泳检测，当阳性对照出现约391 bp的特异性条 带 、阴性对照无扩增条带 ，空白 对照无扩增条带 ，本次实验结果成立且有效。当待检样品出 现约391 bp条带，判为鸭2型甲肝病毒(DHAV-2)感染阳性；当待检样品无特异性扩增条带判 为阴性。 [0010] 本发明的优点在于： 本发明采用的特异性引物选择DHAV-2与DHAV-1、DHAV-3氨基酸同源性最低的2A2蛋白 区域进行设计获得，能够准确、快速、方便的辨别病料中是否含有鸭2型甲肝病毒，检测限可 达4 .08×103拷贝/μL；特异性好，对常见鸭群传染病均无交叉反应。本发明利用所述特异性 引物，建立了一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法，通过试验证明了该特异性引物 具有敏感性高、特异性好的特点，填补了国内外的空白。
(10)申请公布号 CN 109576398 A (43)申请公布日 2019.04.05
权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页
CN 109576398 A
CN 109576398 A
权 利 要 求 书
1/1 页
1 .一种用于检测鸭2型甲肝病毒的引物对，其特征在于：所述引物如下所示： DHAV-2F：5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’； DHAV-2R：5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’。 2 .一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒，其特征在于：其包含权利要求1所述的引物对。
(74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100
代理人 蔡学俊
(51)Int .Cl . C12Q 1/70(2006 .01) C12Q 1/686(2018 .01) C12N 15/11(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方
法 ( 57 )摘要
本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒 及其检 测方法 ，所述试剂盒包含了鸭 2型甲 肝 病 毒的引物对，序列如SEQ ID NO .1-2所示。本发明 采用的特异性引物选择DHAV-2与DHAV-1、DHAV-3 氨基酸同 源性最 低的 2A2蛋白区域设计 ，采 用的 引物可以准确快速的判别病料中是否含有鸭2型 甲肝病毒。当前国内外尚未见利用特异性检测检 测鸭2型甲肝病毒的检测试剂盒及其检测方法相 关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领 域空白。
2
CN 109576398 A
说 明 书
1/4 页
一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域 [0001] 本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法，属于动物传染病学领 域。
背景技术 [0002] 当前 ，引起雏鸭病毒性肝炎的病原为鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus ， DHAV），属小RNA病毒科（Picornaviridae）禽肝病毒属（Avihepatovirus）成员，分为三种基 因型：DHAV-1，DHAV-2和DHAV-3。DHAV病毒完整基因组长约7 .7kb，单股正链RNA。基因组RNA 由5’非编码区（untranslated region , UTR）、一个开放阅读框（ORF）、3’UTR 和 poly（A）尾 巴组成，它作为遗传物质稳定传代的同时还可以直接作为mRNA指导合成一条完整的病毒多 肽链（polyprotein）（即开放阅读框ORF）。5’-UTR长626nt，含有丰富的二级结构。DHAV 的 3 ′-UTR 长为 314~317nt，为已知小 RNA 病毒科成员中3 ′-UTR 最长的病毒。DHAV的ORF可 进一步切割形成L-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D。 [0003] 关于DHAV各地的流行病学数据存在较大差异，1945年，第一株鸭病毒性肝炎病毒 （即DHAV-1）发现于美国纽约长岛鸭场。1950年，Levine和Fabricant从鸡胚中首次分离到鸭 病毒性肝炎病原 ，随 后世界上很多国家相继报道了DHAV-1的流行。在我国 ，1963年上海畜牧 研究所的 黄均建首次 报道了鸭 病毒性肝炎发现于上海 ；1980年 ，王平等在北京地区分离到 了 第一株DHAV-1。随 后 ，浙江 、福建等地都先 后报道了DHAV-1的 发生 和流行。苏敬良 等于 1999年5 月从北京、广西疑似鸭肝炎的病死鸭体内分离到 2 株病毒（分别编号为B株和C 株），经鸭胚血清中 和试验表明 两者为同 一血清型 ，但与经典 DHAV-1无血清学交叉免 疫反 应，人工感染雏鸭可复制出与临床病例相似的病变，于是认为有新的血清型出现，并把分离 到的病毒命名为新型DHAV，基因组序列测定表明该毒株与 Kim报道的韩国新型鸭病毒性肝 炎（即DHAV-3）同源性最高。袁率珍等对1999-2010年从广东、山东、云南、河南和黑龙江等地 发病死亡雉鸭分离得到 DHAV 分离株进行血清型鉴定与抗原相关VPl 基因序列分析，结果 表明目前DHAV-1 和DHAV-3两种基因型同时流行。研究发现 ，DHAV-2仅在我国台湾地区 报道 （Tseng CH , Tsai HJ . Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus . Virus Res , 2007 , 126(1-2): 19-31 .）。目前GenBank数据库仅2株 DHAV-2基因组序列，90D株，GenBank登录号EF067924；04G株，GenBank登录号EF067923。流行 病学研究表明 ，DHAV-2在我国大陆地区 和世界其他国 家和地区尚 未见该病报道。当前国内 外尚未见利用特异性检测检测鸭2型甲肝病毒的检测试剂盒及其检测方法相关研究报道， 本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910028897 .1
(22)申请日 2019 .01 .12
(71)申请人 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店埔 档
(72)发明人 万春和 黄瑜 陈翠腾 施少华 傅光华 程龙飞 刘荣昌 陈红梅 傅秋玲
发明内容 [0004] 本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法，可以准确快速的判别 病料中是否含有鸭2型甲肝病毒。 [0005] 为实现上述技术方案，采用以下技术方案：
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CN 109576Байду номын сангаас98 A
说 明 书
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一种用于检测鸭2型甲肝病毒的引物对，所述引物如下所示： DHAV-2F：5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’； DHAV-2R：5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’； 目的片段大小为391 bp。 [0006] 鸭2型甲肝病毒检测试剂盒，其包含权利要求1所述的引物对。 [0007] 所述试剂盒的使用方法包括如下： （1）鸭2型甲肝病毒阳性对照和阴性对照； （2）鸭2型甲肝病毒引物对： DHAV-2F：5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’； DHAV-2R：5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’； （3）反转录：提取的核酸（RNA）5μL，0 .1μg/uL随机引物1μL，2× TSⅡ Reaction Mix 10 μL，TransScript Ⅱ RT/RI Enzyme Mix 1μL，gDNA Remover 1μL，Rnase-Free 水2μL，至总 体积20μL。50℃反转录30 min，85℃加热5s使酶失活，-80℃保存备用。 [0008] （4）PCR反应：2×DreamTaq Green PCR Master Mix 25μL，10 μmol/L上/下游引物 各1 μL，模板1 μL，去离子水22 μL，至总体积50μL。反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、55℃ 30 s、72 ℃ 30s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。 [0009] （5）结果判定：对扩增产物进行电泳检测，当阳性对照出现约391 bp的特异性条 带 、阴性对照无扩增条带 ，空白 对照无扩增条带 ，本次实验结果成立且有效。当待检样品出 现约391 bp条带，判为鸭2型甲肝病毒(DHAV-2)感染阳性；当待检样品无特异性扩增条带判 为阴性。 [0010] 本发明的优点在于： 本发明采用的特异性引物选择DHAV-2与DHAV-1、DHAV-3氨基酸同源性最低的2A2蛋白 区域进行设计获得，能够准确、快速、方便的辨别病料中是否含有鸭2型甲肝病毒，检测限可 达4 .08×103拷贝/μL；特异性好，对常见鸭群传染病均无交叉反应。本发明利用所述特异性 引物，建立了一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法，通过试验证明了该特异性引物 具有敏感性高、特异性好的特点，填补了国内外的空白。
(10)申请公布号 CN 109576398 A (43)申请公布日 2019.04.05
权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页
CN 109576398 A
CN 109576398 A
权 利 要 求 书
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1 .一种用于检测鸭2型甲肝病毒的引物对，其特征在于：所述引物如下所示： DHAV-2F：5’-TACATCTATGGGTGGTATTCTT-3’； DHAV-2R：5’-TTCAATTTCAAGATGGAGCTCA-3’。 2 .一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒，其特征在于：其包含权利要求1所述的引物对。
(74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100
代理人 蔡学俊
(51)Int .Cl . C12Q 1/70(2006 .01) C12Q 1/686(2018 .01) C12N 15/11(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方
法 ( 57 )摘要
本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒 及其检 测方法 ，所述试剂盒包含了鸭 2型甲 肝 病 毒的引物对，序列如SEQ ID NO .1-2所示。本发明 采用的特异性引物选择DHAV-2与DHAV-1、DHAV-3 氨基酸同 源性最 低的 2A2蛋白区域设计 ，采 用的 引物可以准确快速的判别病料中是否含有鸭2型 甲肝病毒。当前国内外尚未见利用特异性检测检 测鸭2型甲肝病毒的检测试剂盒及其检测方法相 关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领 域空白。
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CN 109576398 A
说 明 书
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一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域 [0001] 本发明提供一种鸭2型甲肝病毒检测试剂盒及其检测方法，属于动物传染病学领 域。
背景技术 [0002] 当前 ，引起雏鸭病毒性肝炎的病原为鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus ， DHAV），属小RNA病毒科（Picornaviridae）禽肝病毒属（Avihepatovirus）成员，分为三种基 因型：DHAV-1，DHAV-2和DHAV-3。DHAV病毒完整基因组长约7 .7kb，单股正链RNA。基因组RNA 由5’非编码区（untranslated region , UTR）、一个开放阅读框（ORF）、3’UTR 和 poly（A）尾 巴组成，它作为遗传物质稳定传代的同时还可以直接作为mRNA指导合成一条完整的病毒多 肽链（polyprotein）（即开放阅读框ORF）。5’-UTR长626nt，含有丰富的二级结构。DHAV 的 3 ′-UTR 长为 314~317nt，为已知小 RNA 病毒科成员中3 ′-UTR 最长的病毒。DHAV的ORF可 进一步切割形成L-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D。 [0003] 关于DHAV各地的流行病学数据存在较大差异，1945年，第一株鸭病毒性肝炎病毒 （即DHAV-1）发现于美国纽约长岛鸭场。1950年，Levine和Fabricant从鸡胚中首次分离到鸭 病毒性肝炎病原 ，随 后世界上很多国家相继报道了DHAV-1的流行。在我国 ，1963年上海畜牧 研究所的 黄均建首次 报道了鸭 病毒性肝炎发现于上海 ；1980年 ，王平等在北京地区分离到 了 第一株DHAV-1。随 后 ，浙江 、福建等地都先 后报道了DHAV-1的 发生 和流行。苏敬良 等于 1999年5 月从北京、广西疑似鸭肝炎的病死鸭体内分离到 2 株病毒（分别编号为B株和C 株），经鸭胚血清中 和试验表明 两者为同 一血清型 ，但与经典 DHAV-1无血清学交叉免 疫反 应，人工感染雏鸭可复制出与临床病例相似的病变，于是认为有新的血清型出现，并把分离 到的病毒命名为新型DHAV，基因组序列测定表明该毒株与 Kim报道的韩国新型鸭病毒性肝 炎（即DHAV-3）同源性最高。袁率珍等对1999-2010年从广东、山东、云南、河南和黑龙江等地 发病死亡雉鸭分离得到 DHAV 分离株进行血清型鉴定与抗原相关VPl 基因序列分析，结果 表明目前DHAV-1 和DHAV-3两种基因型同时流行。研究发现 ，DHAV-2仅在我国台湾地区 报道 （Tseng CH , Tsai HJ . Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus . Virus Res , 2007 , 126(1-2): 19-31 .）。目前GenBank数据库仅2株 DHAV-2基因组序列，90D株，GenBank登录号EF067924；04G株，GenBank登录号EF067923。流行 病学研究表明 ，DHAV-2在我国大陆地区 和世界其他国 家和地区尚 未见该病报道。当前国内 外尚未见利用特异性检测检测鸭2型甲肝病毒的检测试剂盒及其检测方法相关研究报道， 本发明的建立可填补国内外相关领域空白。