甲型肝炎病毒IgM抗体测定.ppt

结果判定
• 酶标仪读数：450nm波长630nm副波长读 数， • 临界值=阴性对照孔 OD 均值 × 2.1( 阴 性对照 OD 小于 0.05 以 0.05 计算) • 结果判定: S/CO≥1 为 HAV-IgM 阳性， • S/CO<1为 HAV-IgM 阴性。
Cut off value(临界值)
• （5）加底物显色．
免疫球蛋白的结构
一、基本结构：四肽链结构 由两条相同的轻链 （Light Chain）和两 条相同的重链（Heavy chain）通过链间二硫 键连结形成。 分子式为：H2L2 四条肽链两端游离的 NH2和COOH方向一致 分别命名为N端和C端
（一）轻链和重链
轻链（L链） κ链 轻链决定型别 κ型 正常人κ：λ≈2 ：1 λ链 λ型
要点： 1. HAV的传播途径(粪—口) 2. HAV的潜伏期(30天±2周) 3. 血清标志物出现的规律 4. 免疫学检测指标—HAV Ag 抗HAV总抗体 抗HAV-IgM
临床意义
• 血清中抗HAVIgM出现于感染的早期(发病后数 日),抗体的效价很快升到峰值并持续较长时间 (2-4周),经1-2个月后抗体的效价和阳性率明显 不降,于3个月后消失.因此抗HAVIgM阳性,尤其 是效价较高时,表明处于感染的早期,被公认为 早期诊断甲肝的依据,是区别是急性感染还是慢 性感染的有力佐证。
ELISA类型
• 夹心法
• 间接法测抗体
• 竞争法 • 捕获法
捕获法测IgM抗体
血清中针对某些 抗原的特异性IgM 常和特异性IgG同 时存在，后者会干 扰IgM抗体的测定。 因此测定IgM抗本 多用捕获法。
• （1）包被抗体：用抗人μ 链抗体包被 固相载体上,形成固相抗人μ 链; • （2）加入病人的血清标本; • （3）加入特异性抗原试剂;， • （4）加入针对特异性抗原的酶标抗体，
思考题
• 血清的类风湿因子及其它非特异 IGM是影响捕获法检测中的主要 物质，如何避免这些物质的影响？
重链（H链）:根据其抗原性的差异，人类Ig的H链分 为 链 链 链 链 链 重链决定Ig类别 IgG IgA IgM IgD IgE
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
捕获法
• 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的测定。
实验原理
• 用抗人μ链抗体包被酶标板，用以捕获血 清中 IgM 类抗体，然后用特异性 HAVAg 与 IgM 抗体结合，再加酶标抗 HAV 抗体， 最后加底物显色，显色深浅与 HAVIgM 的含量成正相关。
甲型肝炎病毒IgM抗体的测定 (捕获法)
酶联免疫吸附试验（ELISA法）
• 将抗体(抗原)包被在固相表面后，按不同 的步骤加入待测抗原(抗体)和酶标抗体 (抗原)，充分反应后用洗涤的方法，使固 相上形成的抗原抗体复合物与其他物质 分离，洗去游离的酶标抗体(抗原)，最后 加入底物，根据酶对底物催化的显色反 应程度，而对标本中的抗原(抗体)进行定 性或定量。
试剂盒组成
• • • • • • 1 抗-μ 链包被干板条 4×12 孔 2 抗-HAVIgM 阴性对照 1 ml×1 瓶 3 抗-HAVIgM 阳性对照 1 ml×1 瓶 4 HA-Ag 2.6 ml×1 瓶 5 酶结合物 2.6 ml×1 瓶 6浓缩洗涤液 20 ml×1 瓶（用蒸馏水 1： 20 稀释） • 7 显色剂 A 3 ml×1 瓶 • 8 显色剂 B 3 ml×1 瓶
Cut off value(临界值)：阴阳性判断值，简称 CO值。 夹心法：若S/CO值>1，为阳性； S/CO值<1，为阴性； 竞争抑制法：若S/CO值<1，为阳性； S/CO值>1，为阴性。
HAV HBV 肝炎病毒---- HCV HDV HEV 其他（HGV、TTV） （SEN、TLMV）
甲型肝炎急性期血清标志物出现过程
• 9 终止液 3 ml×1瓶
操作步骤
• 1．将微孔条固定在支架上，按顺序编号。 • 2．分别将待测标本，阴、阳性对照100μl（2滴） 加入相应的孔中，设空白对照孔。置37℃20分 钟。 • 3 ．洗涤：甩去孔内液体，用洗涤液注满各孔， 静置5秒，共三次，每次洗后均需扣干。 • 4．每孔加HA· Ag50μl，酶结合物50μl（空白对 照除外），振荡混匀，置37℃20分钟。 • 5．洗涤：重复上述3 • 6．显色：每孔加显色剂A液50μl，再加显色剂 B液50μl，振荡混匀，置37℃15分钟。 • 7.每孔加终止液50μl