lncRNA研究策略与技术
研究lncRNA的常见技术及原理LncRNA专题
研究lncRNA的常见技术及原理LncRNA专题本期专题将围绕lncRNA的常见技术与原理，主要介绍RT-PCR/qPCR/RT-qPCR/QD-FISH原位杂交技术/cDNA 末端快速扩增/RNA pull down/RIP技术/ChIRP等技术及原理，还介绍了相关研究思路。
快来和小编一起开启学习模式吧~1常见技术及原理1.RT-PCRRT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR），由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反转录酶。
2.qPCRReal-time-PCR和qPCR（Quantitative Real-time-PCR）是一码事，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。
3.RT-qPCRRT-qPCR（Real-time Quantitative PCR），实时荧光定量PCR 就是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，最后通过Ct值和标准曲线的分析对起始模版进行定量分析的方法。
LncRNA的研究策略
lncRNA研究策略转载请注明来自丁香园发布日期：2012-09-21 14:47 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：RNA miRNA 技术专题锐博生物丁香通丁香园点击次数：34471、差异表达筛选通过lncRNA芯片或RNA-seq测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA 表达谱分析。
2、生物信息分析通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA 的靶基因。
3、细胞分子水平研究（1）功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体（2）功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响（3）可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。
4、动物实验（1）构建移植瘤或原位瘤模型，转移模型（2）导入siRNA或者lncRNA表达质粒（3）检测肿瘤生长曲线（4）通过免疫组化、RT-PCR、Western Blot等方法检测相关指标变化。
小知识RNA-RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation)是一种高通量检测细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。
RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。
CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白的高通量测序方法。
方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，把目标RNA拉下来以后，与其共同作用的DNA染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，这样会得到该RNA能够结合到在基因组的哪些区域；如果结合物是蛋白质，可以通过将蛋白质打断成短肽再通过质谱进行鉴定，从而或者与RNA结合的蛋白质。
长链非编码RNALncRNA研究，读这篇文章就足够了！
长链⾮编码RNALncRNA研究，读这篇⽂章就⾜够了！1.认识⼀下长⾮编码RNA定义⾮编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)指不翻译成多肽的RNA。
按照长度不同，短于200nt的归为⼩⾮编码RNA (small ncRNAs，sncRNAs)，长于200nt的归为长⾮编码RNA (longncRNAs，lncRNAs)。
分类根据染⾊体上与编码基因的相对位置将lncRNA分为反义型(antisense lncRNAs)、内含⼦型(intronic lncRNAs)、反向型(divergent lncRNAs)、基因间型(intergenic lncRNAs)、启动⼦上游型(promoter upstream lncRNAs)、启动⼦型(promoter-associated lncRNAs)、转录起始位点型(transc ription start site-associated lncRNAs) [1, 2] (图1)。
图1. 根据染⾊体上与编码基因的相对位置对ncRNA进⾏分类。
lncRNAs作⽤范围⼴泛，机制⾮常复杂，这⾥从基因调控的⾓度重点讲⼀讲。
为了⽅便⼤家的理解，咱们来看看lncRNA的特点。
简单讲，lncRNA的本质是RNA，是由核苷酸组成的长链，有以下⼏个优势：(1) 可以轻松的与同源DNA序列(转录lncRNA的基因以及序列相似的基因)结合；(2) 可以轻松的与同源RNA序列结合；(3) 其丝带般的特点可以折叠成复杂的⼆级结构，轻松与多种蛋⽩质结合。
也就是说，lncRNA情商极⾼，与上层领导(DNA)关系暧昧，与同事(RNA)关系很铁，与下属(蛋⽩质)关系紧密。
这样⼋⾯玲珑的lncRNA那肯定是相当吃得开啊。
2.lncRNA参与转录前调控顾名思义，转录前调控就是对转录事件发⽣之前的准备阶段进⾏调控，主要指染⾊质开放或关闭状态的调控——想要使原来不转录的基因开启转录，就需要染⾊质从关闭状态转换为开放状态；想要使原来转录的基因不再转录，就需要染⾊质从开放状态转换为关闭状态。
外泌体lncRNA芯片研究方法及思路
外泌体lncRNA芯片研究方法及思路
一、技术简介
外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200 nm，形态也呈现出多样性。
长链非编码RNA（long non-coding RNA）是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。
近年来的研究表明lncRNA能在标贯遗传、转录及转录后水平上调控基因表达，参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联系。
lncRNA芯片对lncRNA进行功能研究也被更多的关注，通过设计不同的lncRNA探针，可以更加快速、高通量地筛选出疾病或特定生物学过程中差异表达的lncRNA和mRNA信息，最终找到lncRNA的靶基因位点深入分析调控机制。
二、测序流程：
1. RNA提取
2. 逆转录合成cDNA1链
3. 合成cDNA2链
4. 体外转录合成cRNA
5. 随机引物合成正义链DNA
6. DNA产物片段化
7. Cy3标记
8. 芯片杂交
9. 数据分析
三、数据分析
1. 芯片数据质控和标准化
2. 主成分分析
3.mRNA表达模式聚类分析
4. GO富集分析
5. KEGG富集分析
6. lncRNA表观模式聚类分析。
深度解密lncRNA研究策略及注意事项
lncRNA
circRNA
2
LncRNA 概述 ——lncRNA的发现
1980s-1990s: Individual lncRNAs are discovered through traditional gene mapping approaches, Xist and H19.
Early 2000s: Development of large scale cDNA sequencing leads to the discovery of a surprising number of lncRNA transcripts.
lncRNA的类别
Knauss and Sun, Neuroscience 2013
lncRNA研究策略
组织，细胞，外周血
lncRNA芯片
RNA-seq
难点
候选lncRNA
差异倍数大的 表达量高的 靶基因功能相关的 共表达网络中的hub 结合TF靶基因数据 结合不同分类
生物标志物
机制研究
• 高通量：包含88,371条circRNA，68,423条lncRNA、18,853条mRNA，让您的筛选范围更广； • 特异性高：环状RNA -特异的反向剪接位点探针设计，保证每个探针检测的特异性，避免与母基因之间的
冗余影响。基于circbase数据库信息;
LncRNA基本特点
• > 200nt • have little or no open reading
frame (ORF) • Polyadenylated are not necessary
(more than 40% of transcripts are non-polyadenylated) • Generally lower expressed than protein-coding genes • more tissue-specific expression patterns, with a large fraction of tissue-specific lncRNAs expressed in the brain. • general long ncRNAs lack strong conservation
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展随着近年来生物学研究的不断深入，越来越多的研究表明长链非编码RNA（lncRNA）在调控基因表达和参与疾病发生发展中起着至关重要的作用。
而作为调控因子的ceRNA（竞争性内源性RNA）也逐渐受到了研究者的关注。
本文将就lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展做一综述。
1. lncRNA作为ceRNA的机制近年来的研究发现，lncRNA作为ceRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。
lncRNA HULC（highly upregulated in liver cancer）可以通过竞争性结合miR-372来调控PRKACB 基因的表达，从而促进肝癌细胞的增殖和转移。
lncRNA MALAT1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1）也通过作为ceRNA来影响肿瘤细胞的增殖和转移。
这些研究表明，在肿瘤发生发展过程中，lncRNA作为ceRNA起着不可忽视的调控作用。
随着对lncRNA作为ceRNA调控机制的深入研究，其在疾病诊断和治疗中的临床应用前景也逐渐显现。
研究者可以通过分析患者组织中lncRNA-miRNA-mRNA网络的变化，对某些疾病进行更精准的诊断和治疗。
针对lncRNA-miRNA-mRNA网络中的关键分子，还可以开发相应的干预手段，如靶向药物或基因治疗，从而更好地干预疾病的发生和发展。
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展已经成为当前生物医学研究的热点之一。
随着对其机制的深入探索和临床应用前景的逐步明晰，相信lncRNA作为ceRNA的调控作用将为我们揭示更多疾病发生发展的新机制，并为疾病的诊断和治疗开辟新的途径。
期待未来在这一领域的研究能够取得更多重要的突破，为人类健康事业作出更大的贡献。
lncRNA研究策略与技术
lncRNA研究策略与技术研究背景：长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp 以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究说明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
图1. lncRNA参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示lncRNA锐博生物提供研究思路：差异lncRNA筛选的研究方法：案例解读：案例(一)RNA seq发现lincRNA1. 2011年，Rinn研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了8000多个人的lincRNAseq预测lincRNAlincRNA的数量及交集及用软件组装的结果2. lincRNA的表达具有组织特异性图3. lincRNA和mRNA在不同组织当中的表达情况案例(二)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。
对64个肿瘤样品高通量测序，在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072新的lncRNA。
lncRNA表达谱分析案例(三)lncRNA表达谱芯片结合lncRNA-mRNA共表达网络筛选关键lncRNA第二军医大学的研究人员利用2/3肝部分切除(PH)小鼠在不同的时间点，针对肝脏再生过程进行了全基因组lncRNA芯片表达谱分析。
通过lncRNA和mRNA共表达网络分析找到了一个非常有意义的长链非编码RNA(lncRNA-LALR1)，并结合体内外实验证实在肝再生过程中lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-Catenin信号加速细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展【摘要】当前研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源性RNA（ceRNA）在疾病中起着重要作用。
本文首先介绍了lncRNA在疾病中的功能及作用机制，然后探讨了ceRNA假说的提出与发展。
接着详细讨论了lncRNA作为ceRNA在癌症及其他疾病中的研究进展，以及ceRNA网络在疾病治疗中的应用。
结论部分展望了lncRNA作为ceRNA在疾病中的未来研究方向，以及ceRNA网络在疾病治疗中的潜在作用。
这些研究为揭示疾病发生发展机制和寻找新的治疗策略提供了重要的理论基础。
【关键词】lncRNA, ceRNA, 疾病, 研究进展, 功能, 作用机制, 癌症, ceRNA 网络, 治疗, 展望, 潜在作用, 未来研究方向1. 引言1.1 lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展长期以来，非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源RNA（ceRNA）在疾病中的作用机制逐渐受到重视。
ceRNA假说提出了一种全新的基因调控机制，即不同种类的RNA分子之间通过竞争结合共享的microRNA（miRNA）来调控彼此的表达。
在这一机制中，lncRNA作为ceRNA在疾病中扮演着重要角色。
研究表明，lncRNA作为ceRNA能够通过调控miRNA的活性，从而影响其靶基因的表达水平，进而参与调控细胞生长、分化、凋亡以及转移等生物学过程。
在癌症中，lncRNA作为ceRNA已被广泛研究，发现其在肿瘤发生、发展和预后中发挥着重要作用。
在其他疾病中，如心血管疾病、神经系统疾病、代谢性疾病等，lncRNA作为ceRNA的研究也逐渐展开。
2. 正文2.1 lncRNA在疾病中的功能及作用机制lncRNA在疾病中的功能主要包括调节基因表达。
通过与蛋白质或RNA相互作用，lncRNA能够调控转录因子的活性或稳定性，从而影响基因的表达水平。
lncRNA还可以调控染色质构象和DNA甲基化等表观遗传学调控机制，进而影响基因的表达。
一文参透：lncrna研究思路、模式和大数据库应用
一文参透：lncRNA研究思路、模式和数据库应用...作者：解螺旋.老谈导语当很多小伙伴还徘徊在miRNA时，lncRNA已经横空出世，还没得来得及反应过来lncRNA到底是怎么回事时，circRNA 又开始崭露头角了。
科研就是这样，你落后一步，便步步落后，跟娶媳妇生孩子是一样一样的。
说回正题，应部分解螺旋粉丝的要求，今天老谈帮大家整体梳理了曾经红极一时、目前热度不减的IncRNA的研究思路和模式以及相关工具，希望能对那些想在IncRNA研究上有所作为的小伙伴能助上一臂之力。
lncRNA研究思路IncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。
很多人看到lncRNA的热度还没有过去，经常会问老谈如果没有相关的工作基础，如何开始lncRNA的研究?今天我们就褪去虚伪外衣，研究的大方向是这样子的：1. 寻找到lncRNA分子2. lncRNA分子表型研究3. lncRNA 通过何种机制调节表型？老谈将这些研究方向及实验手段按层次的方式绘成流程图，如下所示：首先，是样本的准备与收集。
高质量的样本是实验结果具有可靠性的前提。
其次，是lncRNA检测。
可以先通过芯片的方式高通量筛选到目的基因，然后通过q-PCR或Northern blot的方法验证所得到的芯片结果。
再次，其研究方向根据研究目的而定。
如果是研究生物标志物，那么可以通过收集更多的临床样本，研究lncRNA对疾病的指示作用。
如果是研究其功能，则是研究其细胞表型、分子表型及机制。
小伙伴们是不是觉得这和miRNA的总体研究思路相似呢？这时可以根据各自的实验平台条件选择相应的研究。
值得注意的是，lncRNA的功能研究并不像miRNA一样通过3’UTR影响翻译套路，总的来说lncRNA机制研究套路还不成熟。
对于很多科研工作者而言，lncRNA分子的获得及其细胞表型的获得并非难事，关键在于如何进行下一步研究，这时候就要涉及到对功能研究的定位。
探测长非编码RNA功能的研究策略
探测长非编码RNA功能的研究策略长非编码RNA（lncRNA）是一类超过200个核苷酸的RNA分子，没有编码蛋白质的能力，但在细胞中扮演着重要的调控角色。
研究lncRNA功能的策略主要包括以下几个方面：1. 高通量测序分析：利用RNA测序技术对lncRNA在不同组织和发育阶段的表达进行全面分析。
通过比较不同条件下lncRNA的表达变化，可以发现与特定生物过程或疾病相关的lncRNA。
2. lncRNA与DNA互作研究：采用染色质免疫共沉淀（ChIP）和DNase I超敏感性测定等技术，确定lncRNA与DNA之间的相互作用。
这些研究可以揭示lncRNA在染色质结构和基因转录调控中的功能。
3. lncRNA与蛋白质相互作用研究：运用RNA免疫沉淀（RIP）、RNA 结合蛋白质免疫共沉淀（RIP-Chip或RIP-Seq）和蛋白质质谱分析（MS）等技术，鉴定lncRNA与蛋白质之间的相互作用。
通过这些研究，可以发现lncRNA与转录因子、染色质修饰蛋白等的相互作用，揭示lncRNA在调控基因表达中的作用机制。
4. RNA干扰研究：采用RNA干扰技术或CRISPR-Cas9系统，通过敲除或过表达特定lncRNA，检验其对细胞功能和生理过程的影响。
同时，还可以利用CRISPR-Cas9系统对lncRNA进行定点突变，以研究lncRNA功能域和调控序列。
5. lncRNA亚细胞定位研究：利用细胞定位技术，如原位杂交、亚细胞分离等方法，研究lncRNA的亚细胞定位，进一步了解lncRNA的功能和调控机制。
6. 系统生物学方法：运用数学建模和计算模拟等系统生物学方法，研究lncRNA在细胞信号传导和调控网络中的作用。
通过结合基因表达数据和调控网络信息，可以预测和验证lncRNA的功能和调控机制。
总之，研究lncRNA功能的策略是多样化的，融合了实验和计算方法。
这些策略的综合应用将为我们进一步揭示lncRNA在基因表达调控和疾病发生机制中的重要作用提供重要的线索。
lncrna研究方案
引言长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一类RNA分子，其长度通常超过200个核苷酸，并且不具备翻译成蛋白质的能力。
在过去的几年中，越来越多的研究表明lncRNA在调控基因表达、细胞生命周期以及疾病发生发展等方面起到重要的作用。
本文旨在介绍一种lncRNA的研究方案，包括实验设计、数据分析以及结果解读等方面。
实验设计样本采集首先，需要选择适当的样本进行研究。
根据研究目的和研究对象的不同，可以选择不同的样本来源，如细胞系、动物组织或者患者样本。
确保样本的来源和特性与研究问题相匹配。
RNA提取和测序在获得样本后，需要进行RNA的提取。
根据样本类型的不同，可以使用不同的方法进行RNA提取，如RNA提取试剂盒、酚/氯仿法等。
提取到的RNA质量和纯度需要进行评估，可以使用比色法、琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测。
提取到RNA后，可以选择不同的测序方法进行lncRNA的定量分析。
常见的测序方法包括转录组测序（RNA-Seq）和全长转录组测序（full-length transcriptome sequencing）等。
根据研究目的，选择合适的测序方法进行分析。
数据分析数据预处理在进行数据分析之前，需要对得到的测序数据进行预处理。
这一步骤包括去除低质量序列、去除接头序列、去除重复序列等。
常用的工具包括Trimmomatic、Cutadapt等。
数据比对和定量在预处理后，将得到的序列数据进行比对到参考基因组或转录组上。
选择合适的比对工具，如Bowtie、STAR等。
根据比对结果，可以对lncRNA进行定量分析，根据差异表达水平进行筛选。
功能分析对于不同表达的lncRNA，可以进行生物学功能的分析。
根据研究问题，可以选择不同的功能分析方法，如通路富集分析、功能注释等。
常用的工具包括GSEA、DAVID等。
结果解读根据上述的分析，可以得到不同lncRNA的表达差异结果，并进行生物学功能解读。
lncRNA功能研究手册
lncRNA功能研究手册随着生物技术检测手段的发展，我们发现人类基因组中90%的转录产物并不能翻译蛋白。
其中包含一类序列长度大于200 nt的非编码RNA——lncRNA。
这些年来的研究表明，lncRNA以多种调控方式决定了生物体发育，疾病发生等过程。
从目前发现的lncRNA 数目来说，已有5万余条。
但是，到目前为止，真正已知功能的lncRNA不到1000条。
所以，我们可以看到，lncRNA研究领域，还是一个充满了潜力的大宝库。
每一个研究领域，研究方向都有发现新的lncRNA功能的可能性。
1，lncRNA的研究策略汇总2．1 高通量筛选并确认ncRNA为非编码RNA经典的实验设计中，大多是通过高通量芯片或测序筛选差异表达的lncRNA，并通过各种生物信息学分析（GO、Pathway、cis-target、trans-target、co-expression、IPA、GSEA、WGCNA等）确认首选的lncRNA，并qRT-PCR验证表达，Northern blot 去验证高通量筛选的结果，并通过/ 或/ 或CPAT：/cpat/index.php等预测编码能力。
2.2 3’RACE、5’RACE 实验确认其全长目前，模式动物lncRNA数据库中收录的lncRNA 的cDNA序列相对比较准确，如果想针对某条lncRNA开展表观遗传方面的启动子、转录因子等研究，或者准备做miRNA与lncRNA的双荧光素酶实验，来验证某条miRNA可以调控lncRNA，则需要获取5’UTR、3’UTR 的序列。
2.3 细胞定位可以帮助找到lncRNA 作用方式的方向找到lncRNA 后，接下来的重要工作就是研究其调控方式。
从目前已有研究来说，lncRNA的调控方式是多种多样的，染色质调控，转录调控，转录后调控，只要你想得到的，都有它的身影。
那么，当我们知道某一条lncRNA 在细胞中特异性表达时，该怎么入手呢？“脑袋跟着屁股走”，在什么位置，担当着什么样的角色。
lncrna研究方法
LncRNA研究方法引言长链非编码RNA（long noncoding RNA，简称lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，不具有翻译成蛋白质的能力。
近年来，越来越多的研究表明，lncRNA在生物学过程中起到重要的调控作用。
因此，研究lncRNA的功能和机制对于深入理解基因表达调控和疾病发生发展具有重要意义。
本文将介绍几种常用的lncRNA研究方法，包括lncRNA鉴定、表达分析和功能研究。
1. lncRNA鉴定方法1.1 基于转录组测序技术的lncRNA鉴定1.1.1 基于RNA-seq的lncRNA鉴定RNA-seq是一种高通量测序技术，可以同时检测转录本的数量和结构。
通过RNA-seq数据分析，可以利用不同lncRNA和mRNA的长度、读取方向、外显子数目和剪接事件等特征来鉴定lncRNA。
1.1.2 基于CAGE技术的lncRNA鉴定CAGE（Cap Analysis of Gene Expression）技术可以用来检测转录起始位点（transcription start site，TSS），从而揭示基因的转录起始区域。
结合CAGE技术和高通量测序，可以鉴定lncRNA的转录起始位点，辅助lncRNA的鉴定和表达分析。
1.2 基于生物信息学方法的lncRNA鉴定1.2.1 基于序列保守性的lncRNA鉴定lncRNA在进化中可能会保留一定程度的序列保守性，即不同物种之间的lncRNA序列相对保守。
利用序列保守性的分析方法，可以鉴定出可能的lncRNA 序列，并进行进一步的实验验证。
1.2.2 基于结构特征的lncRNA鉴定lncRNA的结构特征在一定程度上与其功能相关。
通过比对已知lncRNA的结构特征和未知序列的结构特征，可以进行预测和鉴定。
2. lncRNA表达分析方法2.1 qRT-PCRqRT-PCR（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction）是一种可靠的lncRNA表达分析方法。
LncRNA研究思路
LncRNA研究思路lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活,转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，很多人看到lncRNA的热点还没有过去，经常会问老谈如果没有相关的工作基础，如何开始lncRNA的研究？今天我们就褪去虚伪假衣，研究的大方向是这样子的：1。
寻找到lncRNA分子2。
lncRNA分子表型研究3。
lncRNA通过何种机制调节表型？老谈将这些研究方向及实验手段按层次的方式绘成流程图，如下所示：首先,是样本的准备与收集，高质量的样本是实验结果具有可靠性的前提。
其次，是lncRNA检测，可以先通过芯片的方式高通量筛选到目的基因,然后通过q-PCR或Northernblot的方法验证所得到的芯片结果。
再次，其研究方向根据研究目的而定。
如果是研究生物标志物，那么可以通过收集更多的临床样本，研究lncRNA对疾病的指示作用.如果是研究其功能,则是研究其细胞表型，分子表型及机制。
小伙伴们是不是觉得这和miRNA的总体研究思路相似呢?这时可以根据各自的实验平台条件选择相应的研究。
值得注意的是,lncRNA的功能研究并不像miRNA一样通过3’UTR影响翻译套路,总的来说lncRNA机制研究套路还不成熟。
对于很多科研工作者，lncRNA分子的获得及其细胞表型的获得并非难事，关键在于如何进一步进行研究，这时候就要涉及到对功能研究的定位.归纳如下：lncRNA的功能分为3方面：1. 是通过修饰染色体参与表观调节；2。
通过与转录因子的相互作用参与转录调节；3. 通过影响mRNA处理过程参与转录后调节。
在以上3个方向的研究中，其中转录后调节相对简单，大家在选择lncRNA的时候，可以对其序列做一下分析，看看自己研究的lncRNA是作为miRNA的sources还是sinks？另外两方面的调节机制均涉及RNA—蛋白质的相互作用。
在没有目的蛋白的时候，此时不得不使用先进技术，用于检测RNA—蛋白质相互作用的实验手段如下：RNA—蛋白质相互作用的检测手段有nRIP，CLIP；lncRNA由于其长片段核苷酸序列,碱基之间相互作用，通常二级结构，可通过RNase足迹等实验手段进行探讨；在染色体结构修饰作用中，还会涉及RNA-RNA的相互作用，可通过CHIRP等实验手段来研究.由于上述实验手段比较难得,lncRNA的机制研究相对还是比较困难。
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究进展
lncRNA（长链非编码RNA）是一类长度超过200核苷酸的非编码RNA，它们在细胞内的功能多样且重要。
最近的研究表明，lncRNA可通过与微小RNA（miRNA）竞争结合目标基因的共同靶向，从而发挥着miRNA诱导的靶基因表达抑制的作用。
这种机制被称为lncRNA作为ceRNA（competing endogenous RNA）。
除了肿瘤，lncRNA作为ceRNA在其他一些疾病中也发挥着重要的作用。
在心血管疾病中，一些lncRNA可以通过竞争性结合miRNA来调节心肌细胞的凋亡和血管生成。
在神经系统疾病中，一些lncRNA也可以通过ceRNA机制影响神经元的发育和功能。
最近的研究还发现，lncRNA作为ceRNA在药物治疗中也具有潜在的应用价值。
一些药物可以通过调控lncRNA和miRNA之间的竞争关系来达到治疗疾病的效果。
这为开发新的治疗方法和药物提供了新的思路和靶点。
lncRNA作为ceRNA在疾病中的研究正在加速发展。
随着我们对lncRNA机制的深入了解，我们有望开发出更多针对lncRNA的治疗策略，并为疾病的诊断和治疗提供新的突破口。
我们还需要更多的研究来揭示lncRNA作为ceRNA的详细机制，以及其在不同疾病中的具体作用和调控网络。
lncRNA研究策略与技术
lncRNA研究策略与技术————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：2lncRNA研究策略与技术研究背景：长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
转录激活 B. A.lncRNA。
染色质重组1. lncRNA图参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示诱导分子 E.转录后修饰和抑制 C.蛋白抑制 D.锐博生物提供研究思路：筛选的研究方法：差异lncRNA 3案例解读：lincRNA)RNA seq发现一案例(lincRNA多个人的24种组织样本进行RNA测序发现了8000研究小组对1. 2011年，Rinn的数量及多个参考数据库找到的lincRNA的流程图利用图2. A.RNA-seq预测lincRNA B.交集及用软件组装的结果的表达具有组织特异性2. lincRNA在不同组织当中的表达情况图3. lincRNAmRNA和4可以成为各种肿瘤的生物标志物)lncRNA(二案例2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。
对64个肿瘤样。
新的lncRNA在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072品高通量测序，表达谱分析4.图肿瘤和对照样品lncRNAlncRNAlncRNA-mRNA共表达网络筛选关键三案例()lncRNA表达谱芯片结合针对肝脏再生过程(PH)小鼠在不同的时间点，2/3第二军医大学的研究人员利用肝部分切除共表达网络分析找到了一个mRNAlncRNAlncRNA芯片表达谱分析。
lncRNA研究的常见思路与策略
lncRNA研究的常见思路与策略lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪⾳”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有⽣物学功能。
然⽽⼤量研究表明，lncRNA在细胞核内、核外，通过染⾊质修饰，转录调控，转录后调控等多种⽅式调节基因表达，在肿瘤发⽣发展中具有重要作⽤。
lncRNA功能研究的基本思路⼀般来说，lncRNA功能研究的主线包含3个主要步骤：（1）⾼通量筛选。
全转录组测序和lncRNA芯⽚是⽬前最常⽤的技术⼿段，通过这种⾼通量的筛选⽅法，可以快速获得不同实验组间差异表达的lncRNA和mRNA。
（2）候选lncRNA的确定。
通过⽣物信息学分析，从⼤量lncRNA 中筛选有潜在功能意义的lncRNA。
（3）⽬标lncRNA的功能分析与验证。
根据上述⽣物信息分析推断出lncRNA可能的⽣物学功能，并设计相应的实验来验证假设是否成⽴。
lncRNA研究的基本流程LncRNA的⼀般研究策略1. lncRNA筛选通过lncRNA芯⽚或RNA测序等⽅法对多对疾病模型和对照样本组织进⾏lncRNA表达谱分析；通过⽣物信息学的⽅法筛选出具有表达差异的lncRNA，预测lncRNA的靶基因，构建共表达⽹络；通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
lncRNA筛选建议根据统计学筛选，⽐如fold-change和p-value，同时表达量⾼的根据lncRNA在基因组上的位置进⾏筛选根据lncRNA的靶基因进⾏筛选，筛选和表型相关的lncRNA根据lncRNA与mRNA在表达上的协同关系进⾏推断，筛选具有hub地位的lncRNA根据lncRNA与protein的关系进⾏筛选根据lncRNA与miRNA的靶向关系筛选2. lncRNA全长克隆可以通过5'RACE获取lncRNA 5'全长，3'RACE获取lncRNA 3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。
lncRNA研究策略之RNAPullDown实验技术
【实验技巧】lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。
RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。
该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。
复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
1) lncRNA筛选：通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
2) lncRNA确定：通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。
3) 表达分析：细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。
组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。
表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。
4) 功能研究：功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体:原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。
然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。
功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响；采用RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。
lncRNA研究方案
1lncRNA 研究技术手册一、lncRNA 概述lncRNA (Long noncoding RNAs,lncRNAs)长链非编码RNA ，起初被认为是基因组转录的不具有生物学功能的“噪音”，是RNA 聚合酶II 转录的副产物。
然而，近年来的研究表明，lncRNA 参与了X 染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA 的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。
随着研究的推进，各类lncRNA 的大量发现，lncRNA 的研究将是RNA 基因组研究非常吸引人的一个方向，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。
lncRNA 的功能分为3方面：1）通过修饰染色体参与表观调节-与mRNA 相互作用；2）通过与转录因子的相互作用参与转录调节-与蛋白（转录因子）相互作用；3）通过影响mRNA 处理过程参与转录后调节-ceRNA 作用模式。
三种lncRNA 机制作用方式，1和2主要发生于细胞核，3则发生在胞质。
从研究难度来说，1>2>3：1）的RNA interaction 与array 并无成熟的研究模式；2）需要RIP 和RNA pull-down ，实验执行难度大风险高；3）转录后调节的研究方法-ceRNA 作用模式可行性及阳性率较高，是目前研究最热门的lncRNA 作用方式。
lncRNA 的ceRNA 作用模式：lncRNA 作为竞争性内源RNA(competing endogenousRNA ，ceRNA)，与microRNA 结合，在细胞中起到microRNA 海绵的作用。
从而降低microRNA 的活性，间接上调microRNA相关靶基因的表达。
图：lncRNA 的ceRNA 作用模式2二、汉恒生物-lncRNA 研究专家汉恒生物lncRNA 研究团队，为您提供基于ceRNA 调控机制的lncRNA 系统研究方案。
LncRNA调控机制及研究策略
LncRNA调控机制及研究策略长链非编码RNA（long noncoding RNAs，LncRNAs）是一类转录本长度超过200nt的功能性RNA分子，其表达水平相对于蛋白编码基因较低，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。
研究表明：LncRNAs在X染色体沉默、基因组印迹、染色体修饰、转录激活、转录干扰以及核内运输等方面具有重要的功能。
其主要的调控机制如图1所示：图1. LncRNA的调控机制根据所发现的lncRNA的作用机制，lncRNA主要可能具有以下几个方面的功能：1）通过在蛋白编码基因上游启动子区（桔）发生转录，干扰下游基因（蓝）的表达（如酵母中的SER3基因）。
2）通过抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因（蓝）表达（如小鼠中的p15AS）。
3）通过与蛋白编码基因的转录本形成互补双链（紫），进而干扰mRNA的剪切，从而产生不同的剪切形式。
4）通过与蛋白编码基因的转录本形成互补双链（紫），进一步在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平。
5）通过结合到特定蛋白质上，lncRNA转录本（绿）能够调节相应蛋白的活性。
6）作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体。
7）通过结合到特定蛋白上，改变该蛋白的胞质定位。
8）作为小分子RNA，如miRNA，piRNA的前体分子。
图2. LncRNA的研究策略LncRNA的一般研究策略如图2所示，其过程主要包括LncRNA 筛选、LncRNA确定、表达分析、功能研究和表达调控。
1) LncRNA筛选通过lncRNA芯片或RNA-seq等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
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lncRNA研究策略与技术
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lncRNA研究策略与技术
研究背景：
长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200 bp 以上，起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等，图1所示。
随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。
图1. lncRNA参与肿瘤生物学调控，红色线状图表示lncRNA。
A.染色质重组 B.转录激活和抑制 C.蛋白抑制 D.转录后修饰 E.诱导分子
锐博生物提供研究思路：
差异lncRNA筛选的研究方法：
案例解读：
案例(一)RNA seq发现lincRNA
1. 2011年，Rinn研究小组对24种组织样本进行RNA测序发现了8000多个人的lincRNA
图2. A.利用RNA-seq预测lincRNA的流程图 B.多个参考数据库找到的lincRNA的数量及
交集及用软件组装的结果
2. lincRNA的表达具有组织特异性
图3. lincRNA和mRNA在不同组织当中的表达情况
案例(二)lncRNA可以成为各种肿瘤的生物标志物
2012斯坦福大学医学院研究人员进行首个大型的癌症lncRNA表达谱分析。
对64个肿瘤样品高通量测序，在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个已知的以及1072新的lncRNA。
图4.肿瘤和对照样品lncRNA表达谱分析
案例(三)lncRNA表达谱芯片结合lncRNA-mRNA共表达网络筛选关键lncRNA
第二军医大学的研究人员利用2/3肝部分切除(PH)小鼠在不同的时间点，针对肝脏再生过程进行了全基因组lncRNA芯片表达谱分析。
通过lncRNA和mRNA共表达网络分析找到了一个非常有意义的长链非编码RNA(lncRNA-LALR1)，并结合体内外实验证实在肝再生过程中lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-Catenin信号加速细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。
因此采用药物干预靶向lncRNA-LALR1诱导肝脏再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治疗。
1. 表达谱芯片检测肝脏生长相关的lncRNA
图5. 表达谱芯片聚类分析小鼠肝脏2/3切除后 0，1.5，12和24小时1231个lncRNA和
3141个mRNA表达谱
2. KEGG pathway 分析与肝脏生长相关的信号通路
图6. Pathway 分析展示最相关的信号通路
3. 共表达网络分析找到关键的lncRNA-LALR1
图7. 部分共表达网络分析，包含22个基因，18个lncRNA(k-core=12), 4个mRNA(k-core=11 and degrees≥28)，位于中心位置的是lncRNA-LALR1
案例(四)lncRNA 功能研究
研究者对位于HOXA基因簇的5‘端启动子区域的非编码RNA HOTTIP进行了功能研究，研究证明HOTTIP可以增强HOXA的转录；对HOTTIP体内外的干扰研究发现HOTTIP在发育过程中起到重要作用，例如影响鸡远端骨的形成。
1. RT-PCR和FISH结果验证lncRNA HOTTIP的表达具有组织中特异性
图8. A.HOTTIP在人不同组织器官中的表达情况B. E13.5小鼠胚胎上HOTTIP的原位杂交2. 通过RNAi技术可以下调lncRNA HOTTIP的表达量
图9. A. 针对HOTTIP设计的siRNA可以下调HOTTIP基因及距离40 kb左右的编码基因HOXA13、HOXA11、HOXA10、HOXA9和HOXA7的表达量。
B.对HOTTIP基因的干扰不影响HOXD 基因和BID基因的表达
3. 动物实验验证HOTTIP干扰载体的表达可以影响HoxA基因的表达及骨质的形成。
图10. A. FISH结果显示HOTTIP干扰载体在鸡胚胎中的过表达影响HoxA基因的表达。
B. HOTTIP基因表达量的下降导致远端骨头变短。
参考文献
1. Wang KC, Yang YW, Liu B, et al. A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression. Nature.2011; 472(7341): 120–4.
2. Cabili MN, Trapnell C, Goff L, et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specificsubclasses. Genes Dev. 2011; 25(18): 1915–27.
3. Cheetham SW, Gruhl F, Mattick JS, et al. Long noncoding RNAs and the genetics of cancer. Br J Cancer. 2013; 108(12): 2419-25.
4. Brunner AL, Beck AH, Edris B, et al. Transcriptional profiling of long non–coding RNAs and novel transcribed regions across a diverse panel of archived human cancers. Genome Biol. 2012; 13(8): R7
5.
5. Xu D, Yang F, Yuan JH，et al. Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/β- Catenin signaling. Hepatology. 2013; 58(2): 739–51.。