革兰氏染色法

革兰氏染色法(Gram's stain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。

【原理】

细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。

【材料】

【方法】

按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。1．涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：

用肉汤培养物涂片：

①右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。

②将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝

烧红(图1-2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。

③用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将

试管口用火焰烧灼灭菌。

④用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1-3)，此时注

意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。

⑤将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免

点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。

⑥将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼

灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。

用斜面培养物涂片：

用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片

上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。2．干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部

的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。

3．固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，

以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。

4．染色：

①将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min。

②水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1min。

③水洗后用95％酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体

无色为止(约需0.5min)。

④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。

⑤水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。

染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，

勿使强水流直接冲到涂膜上。

【结果观察】

使用油镜观察，注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪种细菌是革兰氏阳性菌(染成紫色)，哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。将在标本中观察到的细菌形态和染色性，用有色铅笔画出模式图，并附以文字说明。

注意事项：①酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。②被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。

1．革兰氏染色液的制备

①结晶紫染液

用天秤量取结晶紫5g放乳钵内研碎，一面研磨一面徐徐加入95％酒精使之溶解。加入酒精全量为100m1，制成酒精饱和液(原液)。取原液20ml，与1％草酸铵水溶液80ml混合，用滤纸过滤。供革兰氏染色初染用。

②芦戈氏碘液

碘1g

碘化钾2g

蒸馏水300ml

配法是先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾，然后加碘使其全溶解，最后

加蒸馏水至300ml。供革兰氏染色媒染用。

③稀释石碳酸复红染液

取碱性复红10g和95％酒精100ml，按上述方法同①制成复红酒精饱合液。取复红饱和液10ml，与5％石碳酸水溶液90ml混合，用滤纸.过滤，再用蒸馏水稀释10倍。供革兰氏染色复染用。

细菌的特殊染色技术─芽孢染色荚膜染色鞭毛染色

一．目的要求：

学习掌握芽孢、荚膜和鞭毛染色原理和方法。

二．原理：

芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。

观察荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。

观察鞭毛是采用在染色的同时将染料堆积在鞭毛上使它加粗的方法。细菌只有在个体发育到一定的时期才具有鞭毛，一般在多次移种之后，在其旺盛生长阶段染色。

三．实验材料：

1．菌种：巨大芽孢杆菌(B.megaterium)：营养琼脂斜面培养20hs 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)：肉汁等斜面培养20hs

普通变形杆菌(Proteus vulgaris)：营养琼脂斜面培养18hs 2．染料：

（1）芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝

液）

（2）荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。

（3）鞭毛染色用硝酸银染色液（A、B液）;或Leifson染色液（A、B、C液）

3．其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、

1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuSO4、95%乙醇、擦镜纸等。四．实验方法与步骤：