2微生物发酵产酶

在原核生物细胞中，多数基因是按照功能相
regulator
promoter operator
关性而组成基因群共同存在。单个基因群在同一
操纵体系下进行表达和调节。
Structual gene
对基因表达进行统一控制的完整单元称为操 纵子。一个操纵子包括结构基因、调节基因、操 纵基因和启动基因等。
10
乳糖操纵子模型
• 无乳糖存在的情况下，
阻遏蛋白与操纵基因结合，阻 碍RNA聚合酶与启动基因的正 常结合，转录关闭。
• 乳糖存在的情况下，
乳糖在β- 半乳糖苷酶的作用 下生成别乳糖，与阻遏蛋白结 合改变其结构，使之从操纵基 因上解离；RNA聚合酶与启动 基因结合，开启转录。
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在乳糖操纵子中，除阻遏状态（乳糖诱导） 与阻遏状态下（无乳糖诱导）的β- 半乳糖苷酶 的酶产量比例约为1000 : 1。
Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism
微生物发酵产酶
1
酶的生产方法
❖ 提取分离法
血液中提取SOD；木瓜中提取木瓜蛋白酶；动物胰脏中提取胰 蛋白酶。来源：器官、组织、细胞。
受到生物资源、地理环境、气候条件的影响。
衰减子 2. 实是际一产酶种分广析泛结存果在与于体外原实核验生不物一合样成途径酶类（氨 基酸实合际成产酶酶情，况发核现苷，酸在高合浓成度T酶rp等和低）浓，度T由rp的翻情译况水下色平氨和酸合转成 酶录的水表平达量共相同差搭约6配00倍而，成与的理论细抑微制程调度节的模70倍式多。出来近10倍。
多出来的抑制效果必然存在其他的调节系统？为什么要多这 样一个调节系统呢？
色氨酸合成调节
无Trp
音
逐
量 少Trp 调
渐
节 器
过
渡
10倍抑制 70倍抑制
多Trp
色氨酸合成酶的调节是一种逐渐过渡的模式，有别 于乳糖操纵子的非开即关。
31
Why & How
衰减子模型普遍存在于氨基酸和核苷酸的合成调节当中
his phe Leu Thr
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生物体对于不同的营养物是区别对待的
原核生物的调节理论
外界适当的Trp两量种是作保用证模Trp式-t共RN同A决trp定充了足的必需条件， 色氨酸合但成不酶是反充馈分抑条制件效。率为700倍。
29
阻遏操纵子+衰减子的调节结果
➢ 无 Trp，阻遏操纵子，支持转录；衰减子，支持
转录。
➢有Trp少量，而却未达到合成前导肽所需要
的Trp-tRNA的量。阻遏操纵子发挥70倍阻遏；而
其中，cAMP 是环腺苷酸，CAP是称为cAMP受体蛋白， 当CAP与cAMP结合为复合物后结合到CAP-cAMP结合位点， 激活启动基因，使RNA 聚合酶在启动子处能解开DNA双链。
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所以乳糖结构基因要表达，除了RNA聚合酶能 够结合在启动子上，还需要cAMP-CAP在结合位点 上的结合。
细胞内分解葡萄糖的酶类属于组成酶，当同时 存在葡萄糖和乳糖时，细胞能够优先分解葡萄糖， 其中产生了阻碍乳糖操纵子转录的因子，这种阻遏 因子与cAMP-CAP的结合有关。
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色氨酸阻遏型操纵子
• 无色氨酸时，阻遏蛋 白无活性，RNA聚合酶起 始转录。
• 当存在色氨酸时，色 氨酸作为共阻遏物与调节 蛋白TrpR结合，进而通过 构象改变，TrpR与启动子 结合而阻止RNA聚合酶结 合，基因关闭。
23
But
1. 色氨酸操纵子阻遏蛋白的阻遏效率比较低
对色氨酸操纵子阻遏蛋白进行体外实验，研究表明此阻碍蛋白在无 色氨酸与有色氨酸的情况下的色氨酸合成酶的表达量仅相差70倍（乳糖 操纵子阻遏蛋白为1000倍）。
E
D C BA
调节基因
操纵基因 UGA
结构基因
特点2：转录出RNA序列可形成双双互补结构，
其中3-4互补将形成终止子结构
前导肽 1
2 前导肽
UGA
3 终止子信号 4
1-2/3-4 4
1/2-3/4
1 终2 3 止 UGA 子
1-2/3-4
3-4：终 止子
23
1
4
1/2-3/4
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前导肽
色氨酸衰减子工作原理
中筛选出相应的微生物。
• 繁殖迅速、代谢能力强。短时间内可获取大量细胞和酶类。
3
章节内容
一、酶生物合成调节理论 二、产酶微生物 三、酶的发酵工艺条件及控制 四、酶生产过程的动力学
4
一、酶生物合成调节理论
生物体对千变万化的环境采取的一种适应性策略。 遵循节约、经济、实用的原则。
• 组成型酶（Constitutive enzyme）：生物细胞中 合成的酶的量比较恒定，这些酶的合成速率变化不大。 • 调节型酶（Regulated enzyme）：生物细胞中合成 的酶的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影 响。
trp-trp
UGA
UGA
终止子
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色氨酸反馈阻遏调节分析（阻遏操纵子+衰减子）
➢ 阻遏操纵子：共阻遏物为Trp，在有Trp和没有Trp的情
况下阻遏效率约为70倍。 仍允许部分RNA聚合酶通过操 纵位点继续转录。
➢ 衰减子：共阻遏物为Trp-tRNA，在Trp-tRNA充足和
Trp-tRNA缺乏的情况下阻遏效率约为10倍。 RNA聚合酶 转录出前导链之后，根据Trp-tRNA是否充足决定后续相关合 成酶的基因的转录是否继续。
在相关酶的生产中可以考虑加入酶的诱导物， 从而提高酶产量。
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原核生物的调节理论
1. 酶合成的诱导作用 2. 分解代谢物的阻遏作用 3. 反馈抑制作用
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2. 分解代谢物的阻遏作用
指一些物质经过分解代谢产生的物质会阻遏 某些酶生物合成的现象；
当培养基中含有多种能源物质（比如同时存 在葡萄糖和乳糖）时，微生物首先利用易于分解 利用的能源物质（葡萄糖），而这种首先被利用 的物质的分解可以阻碍微生物对另外一种能源物 质的利用。
葡萄糖效应（二次生长现象）
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实验现象：
二次生长现象
• 细菌在只有葡萄糖的培养基中生长的时候， 可以利用葡萄糖。
• 细菌在以乳糖为单一碳源的培养基中生长的 时候，可以利用乳糖。
• 细菌在葡萄糖和乳糖培养基中生长的时候， 只利用葡萄糖，而不利用乳糖！
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理论支撑 葡萄糖效应理论
乳糖操纵子的启动基因内，除RNA聚合酶结合位点外， 还有一个称为CAP-cAMP复合物的结合位点。
在没有-半乳糖苷酶(lacZ)、 -半乳糖苷透过酶(lacY) 的情况下，细胞怎样进行乳糖的吸收利用？？
正常情况下，细胞会本底产生极少量(1~5 个)β- 半乳糖苷酶和透过酶。用于监测环境中是 否存在乳糖，监测到便可将乳糖生成别乳糖进 行诱导作用，而打开结构基因的表达。
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与分解代谢相关的酶常采用这种调节模式， 目的就是避免浪费。比如半乳糖操纵子、阿拉伯 糖操纵子等。
子
诱导和分解代谢物阻遏调节，目的是为了不没有必 要的蛋白，避免浪费，提高自身环境适应力。
3. 反馈抑制作用
21
3. 反馈抑制作用
酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物 使酶的生物合成受到阻遏的现象。
色氨酸反馈阻遏 ----（阻遏型操纵子、衰减子）----
色氨酸作为色氨酸合成代谢的代谢终产物会反 过来抑制色氨酸合成代谢中的一系列酶！
衰减子依然支持转录。
➢ 当有大量Trp存在，Trp和Trp-tRNA都充足。
两者共同发挥作用，达到最大阻遏效率700倍。
通常是体 内合成Trp
通常是体 外添加Trp
这种调节保证了细胞内总是具有一定浓度的 Trp，是细胞自给自足的基础。
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乳糖分解调节
有乳糖
非
电 灯
开
开 关
即
关
1000倍 抑制
无乳糖
原核生物的调节理论
1. 酶合成的诱导作用 2. 分解代谢物的阻遏作用 3. 反馈抑制作用
7
1. 酶合成的诱导作用
加入某些物质，能够使酶的生物合成开始或 者加速进行的现象称之为酶的诱导作用。
乳糖操纵子理论（Jocob & Monod,1960）
8
实验现象：
已知与分解利用乳糖相关的酶类有：-半乳糖苷酶 (lacZ)、 -半乳糖苷透过酶(lacY)和-半乳糖乙酰化酶
—— 衰减子
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RPO
终止子信号
leading seq.
E
终止子信号
D C BA
调节基因
实验结果
操纵基因
高色氨酸时
基因低分色析氨酸时
S.D序列
操纵基因(O)
结构基因
前导肽特点1：编码区含有重复Trp
可翻译14 个氨基酸的前导肽
UGA
trp E基因(E)
终止子
翻译层面
转录层面
25
RPO
终止子信号
leading seq.
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凡是在降解过程中能被转化成葡萄糖或糖酵解途径 中的其他中间产物的糖代谢（乳糖、半乳糖、麦芽糖、 阿拉伯糖等）中，其有关酶都是由这种cAMP-CAP诱 导控制的。
即只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不会表达。
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原核生物的调节理论
乳 1. 酶合成的诱导作用
糖 操
2. 分解代谢物的阻遏作用
纵
对于多数与分解代谢相关的酶类，微生物采用
(lacA) 。
1. 大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内上述三 种酶基本不合成；
2. 大肠杆菌生长在以乳糖为唯一碳源培养基上时，三种 酶都大量合成，达到细胞总蛋白量的6%~7%左右；
3. 当再次换回葡萄糖培养基时，三种酶又ຫໍສະໝຸດ Baidu本消失；
经济性原则：有需要，才合成！！
9
理论支撑
乳糖操纵子（Jocob & Monod,1960）
生物合成法
微生物发酵产酶；（枯草芽孢杆菌生产淀粉酶、蛋白酶、磷 酸酶；曲霉产糖化酶等）
植物细胞培养产酶；动物细胞培养产酶。
❖ 化学合成法
成本昂贵，效果不好。一般只用于实验室研究
2
微生物发酵产酶
定义：利用微生物的生命活动，获得所需的酶 的技术过程。
利用微生物产酶主要原因：
• 微生物种类繁多，分布广泛。可以根据不同的需求从环境
在原核生物中，翻译和转录是同时进行的，为衰减子 的两者搭配调控提供可能。
前导肽翻译的过程中，重复的Trp密码子迫使核糖体在 此处合成减慢；决定核糖体前进的因素R是NA外聚合界酶TrRpN-At聚R合N酶ATrp的 供给量。
• 当trp-tRNA供给不足，核糖体在重复trp序列(序列1 的中间位置上)上停止。
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1.对酶生产菌的要求
• 产酶量高，最基本，最重要的条件。 • 产酶稳定，传代过程中不易发生变异、退化。 • 最好是胞外酶，方便发酵产物的纯化。 • 不是致病菌，不产生毒素等有毒代谢物。
酶作为天然提取物可以认为是安全的，但在酶分离纯化中可 能会带入一些致病素，所以要对产酶微生物进行安全检查，尤其 是在医药和食品用酶特别重要。
序列1结合核糖体；2-3配对；4独立 ---- 无终止信号，转录继续
• 当trp-tRNA供给充足，核糖体顺利通过重复trp序列 在UGA（核糖体占据序列1和部分序列2）处停止。
核糖体停留在序列1和2的连接（UGA）处，占据部分1和2的序列；
序列3-4配对，形成终止信号 ----- 转录终止。
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trp-trp
取样
筛选
改良
2.1 取样：由微生物的分布规律决定
• 从富含该酶作用底物的场所取样（筛选蛋白酶产生菌从
堆放鱼、肉、虾等蛋白质的地方采样、或者从肉食动物的粪便中采 集；在堆积腐烂纤维素的地方筛选产纤维素酶的菌）
了解生物体的合成调节模式，有利于在酶 的生产采取相应的措施以提高酶产量。
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调节酶生物合成的方式主要有：
转录水平的调节 转录产物的加工调节 翻译水平的调节 翻译产物的加工调节 酶降解的调节
转录水平的调节是原核生物最常用也最实用的一种调 节方式。直接在源头决定产物是否表达。
6
生物体采用何种调节模式都存在一定的生物学意义
用于食品工业的微生物（枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、 乳酸菌等）已经有了充分的安全记录，可以直接采用；其他非致 病性的微生物需要做一个短期的毒性试验；对于非常见的微生物 则需要做广泛的毒性试验，包括慢性中毒试验。
• 容易培养，营养要求低
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2. 如何获取产酶微生物
生产菌可以从菌种保藏中心和有关研究部门 获取，但主要还是从自然界进行筛选。
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ATP
AMP
cAMP
葡萄糖效应模型
只要外界存在葡萄糖， 细胞会优先并迅速分解葡 萄糖产生大量ATP；
• AMP的浓度ATP产生因 此降低，使体内cAMP转化 为AMP，进而降低cAMP 浓度；
• 同时腺苷酸环化酶的活 性受到抑制。
最终结果：cAMP浓度 不足，无法形成CAPcAMP复合物，转录关闭。
1. 酶合成的诱导作用 乳糖操纵子模型
2. 分解代谢物的阻遏作用 葡萄糖效应
要想提高某酶 的产量，我们 或许能够……
或有或无，
需要才合成
3. 反馈抑制作用 确保一定有，但要控制量 色氨酸阻遏型操纵子、衰减子
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章节内容
一、酶生物合成调节理论 二、产酶微生物 三、酶的发酵工艺条件及控制 四、酶生产过程的动力学